Summary
Это руководство к изменению формы из стекла микропипетки. В частности, с помощью тепла и давления воздуха конус расширяется без увеличения наконечник открытие, что приводит к снижению сопротивления пипетки. Это очень важно для получения низких записи шума из мелких клеток, но полезно во многих приложениях.
Abstract
Давление полировки является методом для формирования стекла пипетки для патч-зажим записи. Сначала мы разработали эту методику изготовления пипеток подходит для записи от небольших (<3 м) тела нейронов. Основной принцип похож на стеклодувные и сочетает в себе давление воздуха и тепла для изменения формы патч пипетки подготовленный обычным съемником микропипетки. Он может быть применен к так называемой мягкой (соды извести) и жесткие (боросиликатного) очков. Вообще говоря, давление полировка может уменьшить сопротивление пипетки на 25%, не уменьшая диаметр кончика открытия (Goodman и Lockery, 2000). Он может применяться практически в любой тип стекла и требует только добавления высокого давления клапан и установки на microforge. Эта техника необходима для записи из клеток сверхмалых (<5 м), а также может улучшить одноканальной записи, минимизируя пипетки сопротивления. Тупой формы также полезно для перфорированной-патч зажим записи, так как это формы иглы приводит к увеличению мембранного пузырь для перфорации.
Protocol
Тяговая пипетки
Использование нить съемник, таких как Саттер Р-97 Flaming / коричневый Микроэлектродные Puller, тянуть набор примерно 10-20 пипеток.
- Выберите стекла. Мы используем боросиликатного (BF150-86-10, OD = 1,5 мм, ID = 0,86 мм). Магазин стекла осторожно, чтобы она остается чистой и без пыли.
- Дизайн потянув программы. Основной целью является открытие наконечника примерно нужного размера, который будет зависеть от приложения. Р-97 Саттера Внесите Cookbook 2 является отличным ссылки.
- Понаблюдайте за своим пипетки под микроскопом, чтобы определить диаметр открытия и гладкость. Отменить грубая, неровная, или нерегулярные советы. Для стандартной записи зажим патч, наконечник открытие, что составляет 2-4 мкм по всему, тем лучше. Тупым кончиком приводит к снижению сопротивления для того же диаметра отверстие, которое является предпочтительным. Форма и размер может быть изменен во время полировки, ниже.
Пипетки давления полировки
- Прикрепите держатель пипетки на чистую, линии сжатого воздуха. Использование регулятора, установить линии сжатого воздуха давлением до ~ 40 PSI. Подключение линии сжатого воздуха 4-ходовой регулирующий клапан, который позволит давления пипетки держателю будет включаться и выключаться. Подключите пипетки держателю управление клапаном с длиной ⅛ в Tygon ® труб.
- Используйте полировки машина (microforge) с высоким давлением пипетки держателю, полировка катушки контролируется ножной педали, микроскоп с низким и высоким увеличением, долгие рабочие расстояния (в идеале, 10x и 100x) воздух целей. Очень важно, чтобы иметь возможность наблюдать во время открытия пипетка протокола.
- Дополнительно: Пальто пипетки с гидрофобным изолятором для уменьшения емкости и улучшения шумовых характеристик (см. "Тяговая пипетки" для этой техники).
- Проверьте давление клапан находится в закрытом положении. Место пипетки в пипетку держатель и затяните уместно пальца туго.
Безопасность внимание: если пипетки плотно прижаты в держатель пипетки, давление воздуха заставит пипетки необходимо извлечь из держателя пипетки. - Место пипетки и держателя в microforge. Расположите держатель пипетки на столике микроскопа так, чтобы оба кончика и полировки катушки видны при низких (10x) питание microforge. Принесите наконечник ~ 75 мкм от нити. Имейте в виду, что нить будет расширяться при нагревании.
- Переключение в режим высокой мощности (100x) цели. Оба кончика пипетки и полировки катушки должны быть в центре внимания и в поле зрения. Если нет, то регулировать высоту полировки катушку. (Положение пипетки, не могут быть скорректированы). Кончика пипетки и полировки катушка должна быть близка к противоположным сторонам поля зрения. Избегайте позиционирования катушку слишком близко к пипетки потому что он будет расширяться, поскольку она нагревается и врезаться в вашем пипетки.
- Поверните клапан прямого давления воздуха в пипетку, и тепло пипетки до конической за кончик начинает шар наружу.
- Стоп отопления до кончика шары слишком широко. Эксперимент требует, чтобы определить соответствующее расстояние, тепло, и времени на желаемую форму.
- Дополнительно: Уменьшить диаметр кончика открытие полировка наконечника при отсутствии давления. Шаги 7 и 8 могут повторяться для тонкой настройки как форма и размеры пипетки.
- Выключите давления и, указывая кончиком пипетки в безопасном направлении, удалить пипеткой и поместите его в чистый ящик для хранения, где он будет защищен от пыли.
Безопасность внимание: если давление воздуха не выключена, пипетки удается извлечь из держателя пипеткой во время удаления.
Заметки о microforge
Мы используем microforge собран из отходящих готовые коммерчески доступные компоненты. (Вы можете также купить давления полировка Комплект из немногих компаний, например, ALA науки, GlassWorx). Независимо от того, microforge, важно, чтобы оптика, что достаточно хороши, чтобы увидеть кончик отверстие, которое часто является лишь несколько микрон в диаметре. Мы используем долгосрочные рабочее расстояние 100x линзы для этой цели. Кроме того, слой полировки катушки с высокой температурой плавления стекла, чтобы минимизировать сдаче испарения металла на пипеток.
Часть 3: Ожидаемые результаты
Умеренная полировка давление может уменьшить сопротивление пипетки без заметного изменения диаметром отверстия. При желании, этот протокол может быть использован для пипеток с суб-микронных отверстий и сопротивлений между 5-10МОм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы изначально разработали этот метод, чтобы сделать пипетки полезно для патч-зажим записи от 2-3 мкм нейронов в C. Элеганс 1. Он регулярно используется в Гудман лаборатории. Мы давления польский пипетки не только для записи от крошечных C. Элеганс нейронов, но и для получения macropatch и одноканальной записи ионных каналов, выраженная в ооцитах Xenopus. Для данного зонда с диаметром отверстия, тупой формы производит более низкого сопротивления пипетки. Нижняя пипетки сопротивления приводит к снижению сопротивления серии и ниже шум записей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Давление полировки техника была разработана в сотрудничестве с Lockery SR.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Capillaries | Consumable | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (or similar) | The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament. |
| Inverted Microscope | Microscope | Leica Microsystems | DM IL (or similar) | Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose. |
| Microforge Kit | Tool | ALA Science | CPM-2 | Supplies polishing coil, controller and foot pedal. |
| Air pressure source | Tool | ALA Science | PR-60 | Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below) |
| 4-way valve | Tool | Cole-Parmer | A-98150-01 | Fittings will be needed to couple valve to tubing |
| Pipette Holder with Luer Connector | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing |
| Tygon® tubing | Tool | Cole-Parmer | 06408-62 | Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve |
References
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
