Biology

改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

Published: October 22, 2008 doi: 10.3791/964

Brandon E. Johnson¹, Austin L. Brown¹, Miriam B. Goodman¹

¹Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine

Summary

これは、ガラスマイクロピペットの形状を変更するためのガイドです。特に、熱や空気圧を使用してテーパーが低いピペットの抵抗につながる、先端の開口部を増やすことなく広げている。これは、小さな細胞の低ノイズ記録を取得することが重要ですが、多くのアプリケーションで有用です。

Abstract

圧力研磨は、パッチクランプ記録用ガラスピペットを整形するための方法です。我々は、最初に小さな（<3 m）のニューロン細胞体から記録に適したピペットを作製するためにこの方法を開発した。基本的なプリンシパルは、ガラス吹きと類似しており、従来のマイクロピペットプラーが作成したパッチピペットの形状を変更するには、空気の圧力と熱を兼ね備えています。それは、いわゆるソフト（ソーダ石灰）とハード（ホウケイ酸）ガラスに適用することができます。一般的に言えば、圧力の研磨は、先端開口部（グッドマンとLockery、2000）の直径を減少させることなく25％ピペット抵抗を減らすことができます。それはガラスのほぼすべてのタイプに適用され、高圧バルブとマイクロフォージへのフィッティングの添加のみを必要とすることができます。この手法は、超小型の細胞（<5 m）からの録音に必須であり、またピペットの抵抗を最小限に抑えることで、シングルチャンネルの記録を向上させることができます。鈍形の穿孔のための利用可能な大規模な膜のブレブのこの先端形状の結果以降も穿孔、パッチクランプ記録するのに便利です。

Protocol

引っ張っピペット

プーラーのようなフィラメントを使用すると、サッタはP - 97 /ブラウン微小電極プラーをフレーミング、約10〜20ピペットのセットを引き出します。

あなたのガラスを選択してください。我々は、ホウケイ酸（BF150 - 86 - 10、OD = 1.5 mm、内径0.86 mm）を使用してください。それは自由な汚れやほこりを保つように慎重にガラスを保管してください。
引っ張ってプログラムを設計します。主な目標は、アプリケーションに依存する約希望のサイズを、開けるヒントです。サターのP - 97ピペットクックブック ^2は優れたリファレンスです。
開口径と滑らかさを決定するために顕微鏡下でピペットを守ってください。荒い、でこぼこ、または不規則なヒントを捨てる。標準のパッチクランプ記録の場合は、全体で2から4μmであるティップオープニングは最高です。鈍先端が好まれているのと同じ開口径、より低い抵抗値につながる。形状とサイズは以下に、研磨中に修正することができます。

圧力の研磨ピペット

きれいな、圧縮空気ラインにピペットホルダーを取り付けます。レギュレータを使用して、〜40 PSIへの圧縮空気ラインの圧力を設定します。オンとオフにするピペットホルダーの圧力を可能にする4方向制御弁、圧縮空気ラインを接続します。タイゴンの⅛の長®チューブと制御弁にピペットホルダーを接続してください。
高圧ピペットホルダー、フットペダル、低と高倍率、長作動距離（理想的には、10倍および100倍）空気の目標を装備した顕微鏡によって制御される研磨コイルで研磨リグ（マイクロフォージ）を使用してください。これは、プロトコル中にピペットの開口部を観察できることが重要です。
オプション ：コート静電容量を減少させると（このテクニックのための"引っ張るピペット"を参照）ノイズ特性を向上させるために疎水性の絶縁体とのピペット。
圧力弁がオフの位置にあることを確認します。ピペットホルダーにピペットを置き、指締めに金具を締めます。

安全上の注意 ：ピペットをピペットホルダーにしっかりと保持されている場合、空気の圧力がピペットをピペットホルダーから排出するようになります。
マイクロフォージのピペットとホルダーを置きます。顕微鏡ステージ上に位置ピペットホルダーは、その先端と研磨コイルの両方は、マイクロフォージで低い（10倍）電源投入時に表示されていること。〜75ミクロンのフィラメントからヒントをもたらす。加熱するとフィラメントが拡大することに留意してください。
ハイパワー（100倍）目標に切り替えます。ピペットチップや研磨コイルの両方が焦点に、ビューのフィールドにしてください。されていない場合は、研磨コイルの高さを調整する。（ピペットの位置を調整することができます）。ピペットチップや研磨コイルは、ビューのフィールドの反対側に近づける必要があります。それが加熱されると拡大して、ピペットにぶつかるだろうので、あまりピペットの先端に近いコイルを配置することは避けてください。
ピペットに加圧空気を指示するためにバルブを回し、そして先端の後ろのテーパーが外側に膨らむし始めるまでピペットの先端を加熱する。
先端があまりにも広範囲にバルーンの前に加熱を停止します。実験は、所望の形状のために適切な距離、熱、および時間を決定するために必要です。
オプション ：圧力のない状態で先端を研磨することにより先端の開口径を小さくしてください。手順7と8は、微調整するために、ピペットチップの形状と大きさの両方を繰り返すことができる。
圧力スイッチをオフにし、安全な方向にピペットチップを指さしながら、ピペットを削除し、それが埃から保護されるクリーンな収納ボックスに入れてください。

安全上の注意 ：空気の圧力がオフになっていない場合、ピペットを除去中にピペットホルダーから取り出すことができる。

マイクロフォージについてのメモ

我々は、既製の市販の部品から組み立てマイクロフォージを使用してください。（また、いくつかの企業、たとえば、ALA科学、GlassWorxから圧力研磨キットを購入することができます）。に関係なく、マイクロフォージの、それはしばしば直径数μmの先端の開口部を、見て十分な光学系を持つことが不可欠です。我々はこの目的のために長い作動距離100倍レンズを使用してください。また、コートオーダーの高融点ガラスによる研磨コイルは、ピペットで蒸発した金属を堆積最小限に抑えます。

パート3：予測される結果

適度な圧力の研磨は、直径を開くに明らかな変化なしにピペットの抵抗を減らすことができます。必要に応じて、このプロトコルは、510MΩの間にサブミクロンの開口部と抵抗とのピペットを作るために使用することができます。

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Discussion

私たちは、もともとCの 2〜3μmの神経細胞からパッチクランプ記録用ピペットを有用にするためにこの方法を開発エレガンス ^1。それは、グッドマンの研究室で日常的に使用しています。我々は小さなCから録音用だけでなく、圧力、研磨ピペット線虫の神経細胞だけでなく、アフリカツメガエルの卵母細胞で発現するイオンチャネルのmacropatchとシングルチャネル記録を得るため。与えられた先端開口径の場合は、鈍い形状は、低抵抗のピペットを生成します。低ピペット抵抗が低い直列抵抗と低ノイズの録音につながる。

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Acknowledgments

圧力研磨技術は、SRのLockeryと共同で開発されました。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve