לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

Summary

זהו מדריך כדי לשנות את הצורה של micropipettes זכוכית. באופן ספציפי, באמצעות חום ולחץ אוויר להתחדד הוא התרחב מבלי להגדיל את פתיחת קצה, המוביל פיפטה התנגדות נמוכה יותר. זה קריטי כדי להשיג הקלטות רעש נמוך של תאים קטנים אך שימושית ביישומים רבים.

Abstract

לחץ לליטוש היא שיטה לעיצוב pipettes זכוכית הקלטה תיקון-clamp. אנחנו הראשונים שפותחו בשיטה זו בודה pipettes מתאים הקלטה מ (<3 מ '), גופים קטנים תאים עצביים. מנהל בסיסי דומה ניפוח זכוכית, והוא משלב לחץ אוויר וחום לשנות את הצורה של pipettes תיקון שהוכן על ידי חולץ micropipette קונבנציונאלי. זה יכול להיות מיושם רך שנקרא (סודה לימון) וקשה (בורוסיליקט) משקפיים. ככלל, ליטוש הלחץ יכול להפחית התנגדות פיפטה של ​​25% ללא ירידה בקוטר של פתיחת קצה (גודמן Lockery, 2000). זה יכול להיות מיושם כמעט כל סוג של זכוכית דורש רק תוספת של שסתום לחץ גבוה ו הולם microforge. טכניקה זו היא חיונית עבור הקלטת מתאי ultrasmall (<5 מ ') יכול גם לשפר את ההקלטה יחיד הערוץ על ידי צמצום התנגדות פיפטה. הצורה הבוטה שימושית גם עבור הקלטה מחורר, מהדק מאז תיקון זה צורה תוצאות הטיפ בועה קרום יותר עבור ניקוב.

Protocol

משיכת pipettes

בעזרת חוט כזה חולץ כמו סאטר P-97 Flaming פולר microelectrode / בראון, למשוך קבוצה של כ 10-20 pipettes.

1. בחר זכוכית שלך. אנו משתמשים בורוסיליקט (BF150-86-10, OD = 1.5 מ"מ, ID = 0.86 מ"מ). אחסן את הכוס בזהירות כך הוא נשאר נקי אבק חינם.
2. תוכנית עיצוב מושך. המטרה העיקרית היא קצה הפתיחה בערך בגודל הרצוי, אשר יהיה תלוי ביישום. P-97 של סאטר Cookbook פיפטה ² היא הפניה מצוינת.
3. שימו לב pipettes שלך תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בקוטר הפתיחה החלקות. בטל מחוספס, טיפים אחידה, או לא סדיר. להקלטת תיקון תקן מלחציים, פתח טיפ כי הוא 2-4 מיקרומטר לרוחב היא הטובה ביותר. טיפ בוטה מוביל התנגדות נמוכה יותר עבור קוטר הפתיחה זהה, אשר העדיפה. הצורה והגודל ניתן לשנות במהלך ליטוש, להלן.

ליטוש לחץ pipettes

1. צרף בעל פיפטה אל קו נקי, אוויר דחוס. באמצעות הרגולטור, להגדיר את קו אוויר דחוס בלחץ ~ 40 PSI. חבר את קו אוויר דחוס שסתום 4-way שליטה שתאפשר את הלחץ בעל פיפטה להיות מופעלת לסירוגין. חבר בעל פיפטה אל שסתום הבקרה עם אורך של ⅛ ב Tygon ® צינורות.
2. השתמש במתקן ליטוש (microforge) עם בעל בלחץ גבוה פיפטה, סליל ליטוש נשלט על ידי דוושת רגל, מיקרוסקופ המצויד בהגדלה נמוכה גבוהה, זמן עבודה מרחוק (באופן אידיאלי, 10x ו 100x) האוויר מטרות. זה קריטי כדי להיות מסוגל לראות את פתיחת פיפטה במהלך הפרוטוקול.
3. אופציונלי: מעיל עם פיפטה מבודדת הידרופובי להקטין קיבוליות ולשפר את המאפיינים רעש (ראה "pipettes משיכת" עבור בטכניקה זו).
4. בדוק את שסתום הלחץ נמצא במצב כבוי. מניחים טפטפת לתוך מחזיק פיפטה והדק את הולם האצבע חזק.
   
   הערה בטיחות: אם פיפטה מוחזק בחוזקה לתוך מחזיק פיפטה, את לחץ האוויר תגרום פיפטה להיות נפלט מבעל פיפטה.
   
   
5. מניחים את פיפטה ומחזיק ב microforge. מיקום פיפטה בעל לבמה מיקרוסקופ כך הן קצה ואת סליל ליטוש גלויים בהספק (10x) נמוך microforge. תביאו את קצה ~ 75 מיקרון מן החוט. זכור כי החוט תרחיב כאשר מחומם.
6. מעבר אל המטרה גבוה כוח (100x). גם את קצה פיפטה ואת סליל ליטוש צריך להיות בפוקוס בתחום התצוגה. אם לא, להתאים את גובה של הסליל ליטוש. (עמדת פיפטה לא יכול להיות מותאמים). קצה פיפטה ו סליל ליטוש צריכה להיות קרובה צדי בתחום התצוגה. הימנע מיצוב סליל קרוב מדי לקצה פיפטה כי תרחיב כפי מחממת ולהיתקל פיפטה שלך.
7. סובבו את שסתום להפנות אוויר דחוס לתוך פיפטה, והחום קצה פיפטה עד להתחדד מאחורי קצה מתחיל בלון החוצה.
8. עצור חימום לפני קצה בלונים גם בהרחבה. ניסויים נדרשת כדי לקבוע את המרחק חום מתאים, וזמן עבור הצורה הרצויה.
9. אופציונלי: הקטנת קוטר הפתח טיפ על ידי ליטוש קצה בהעדר לחץ. שלבים 7 ו -8 ניתן חזר כדי לכוונן גם את הצורה ואת הממדים של קצה פיפטה.
10. כבה את הלחץ תוך הצבעה על קצה פיפטה בכיוון בטוח, להסיר את פיפטה ולמקם אותו בתוך קופסת האחסון נקי איפה זה יהיה מוגן מפני אבק.
    
    הערה בטיחות: אם לחץ האוויר לא מבוטלת, פיפטה יכול להפלט מבעל פיפטה במהלך ההסרה.

הערות על microforge

אנו משתמשים microforge התאספו מעל המדף, חלקים זמינים מסחרית. (ניתן גם לקנות ערכת הלחץ ליטוש של מספר חברות, כגון: ALA המדע, GlassWorx). ללא קשר microforge, חיוני לקיים אופטיקה כי הם טובים מספיק כדי לראות את פתיחת קצה, אשר לעיתים קרובות רק כמה מיקרומטר קוטר. אנו משתמשים בעדשה ארוכת עובד מרחק 100x למטרה זו. כמו כן, המעיל סליל ליטוש עם כוס גבוהה נמס בטמפרטורה כדי למזער את הפקדת מתכת מתאדה על pipettes.

חלק 3: התוצאות החזויות

ליטוש לחץ מתונה יכולה להפחית את עמידות של טפטפת ללא שינוי ניכר בפתיחת קוטר. אם תרצה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להפוך pipettes עם תת מיקרון פתחים התנגדויות בין 5-10MΩ.

Discussion

אנחנו במקור פיתחו שיטה להפוך pipettes שימושי הקלטה תיקון-clamp 2-3 מיקרומטר נוירונים ב C. elegans ^1. זה נמצא בשימוש שגרתי במעבדה גודמן. אנחנו בלחץ פולנית pipettes לא רק הקלטה מ ג זעיר נוירונים elegans, אלא גם לקבלת macropatch חד ערוצים הקלטות של תעלות יונים לידי ביטוי ביציות Xenopus. עבור בקוטר טיפ הפתיחה נתון, את הצורה הבוטה מייצרת פיפטה נמוך התנגדות. התנגדות פיפטה התחתון מוביל התנגדות סדרה נמוך יותר רעש הקלטות.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve