Tryck-polering Pipetter för förbättrad patch-clamp-inspelning

Summary

Detta är en guide för att ändra formen på glaset mikropipetter. Specifikt, genom att använda värme och lufttryck den koniska vidgas utan att öka spetsen öppning, vilket leder till lägre pipett motstånd. Detta är avgörande för att erhålla låg ljudnivå inspelningar av små celler, men är användbar i många tillämpningar.

Abstract

Tryck-polering är en metod för att forma glas pipetter för patch-clamp inspelning. Vi utvecklade först denna metod för att tillverka pipetter lämplig för inspelning från små (<3 m) neuronal cell organ. Den grundläggande principen liknar glasblåsning och kombinerar lufttryck och värme för att ändra formen på plåster pipetter som utarbetats av en konventionell mikropipett avdragare. Det kan tillämpas på så kallade mjuka (kalk) och hårda (borosilikatglas) glasögon. Generellt trycket polering kan minska pipett motståndet med 25% utan att minska diametern på spetsen öppning (Goodman och Lockery, 2000). Det kan appliceras på nästan alla typer av glas och endast kräver tillsats av en högtrycks-ventil och montering på ett microforge. Denna teknik är avgörande för inspelning från ultrasmall celler (<5 m) och kan också förbättra en-kanals inspelning genom att minimera pipett motstånd. Den trubbiga formen är också användbar för perforerade-patch clamp inspelning eftersom detta tips formen resulterar i en större membran Bleb tillgängliga för perforering.

Protocol

Dra pipetter

Med hjälp av en glödtråd avdragare som en Sutter P-97 Flaming / Brown mikroelektrod Avdragare, dra en uppsättning av ca 10-20 pipetter.

1. Välj ditt glas. Vi använder borosilikatglas (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Förvara glaset försiktigt så att det förblir rent och dammfritt.
2. Designa en dra-program. Det primära målet är ett tips att öppna ungefär önskad storlek, som beror på tillämpningen. Sutter s P-97 Pipettera Kokbok ² är en utmärkt referens.
3. Observera dina pipetter i mikroskop för att fastställa öppna diameter och jämnhet. Kasta grov, ojämn, eller oregelbundna tips. För standard patch clamp inspelning är ett tips öppning som är 2-4 ìm över bäst. En trubbig spets leder till lägre motstånd för samma öppning diameter, vilket är att föredra. Form och storlek kan ändras under polering, nedan.

Tryck polering pipetter

1. Bifoga en pipett innehavaren att en ren, tryckluftsledning. Med hjälp av en regulator, ställ den komprimerade trycket luftledningen till ~ 40 PSI. Anslut tryckluft linje till en 4-vägs reglerventil som gör att pipetten innehavaren trycket att slås på och av. Anslut en pipett innehavaren att reglerventilen med en längd på ⅛ i tygon ®-slangar.
2. Använd en polering rigg (microforge) med ett högt tryck pipett hållare, en polering spole som styrs av en fotpedal, ett mikroskop utrustat med en låg och hög förstoring, långa arbetsdagar avstånd (helst 10x och 100x) luft mål. Det är viktigt att kunna observera pipetten öppningen under protokollet.
3. Tillval: Täck pipetten med ett hydrofobt isolator för att minska kapacitansen och förbättra buller egenskaper (se "Pulling pipetter" för denna teknik).
4. Kontrollera att ventilen är i läge OFF. Placera en pipett i pipetten hållaren och dra åt montering finger-tight.
   
   Säkerhet OBS: Om pipetten hålls tätt i pipetten hållaren kommer lufttrycket gör att pipetten för att komma ut från pipetten hållaren.
   
   
5. Placera pipetten och hållaren i microforge. Placera pipetten hållaren på mikroskop scenen så att både spets och polering spolen är synliga vid låga (10x) makt på microforge. Ta spetsen ~ 75 mikron från glödtråden. Tänk på att glödlampan kommer att expandera vid uppvärmning.
6. Växla till hög effekt (100x) mål. Både pipettspetsen och polering spolen bör vara i fokus och i synfältet. Om inte, justera höjden på polering spolen. (Den pipett position kan inte justeras). Pipettspetsen och polering spole ska vara nära motsatta sidor av synfältet. Undvik att placera spolen för nära pipettspetsen eftersom det kommer att expandera som det värmer och stöta på din pipett.
7. Vrid ventilen till direkt trycksatt luft i pipett och värme pipettspetsen tills koniska bakom spetsen börjar ballong utåt.
8. Stoppa uppvärmningen innan spetsen ballongerna alltför omfattande. Experimenterande krävs för att fastställa lämplig distans, värme och tid för önskad form.
9. Tillval: Minska diameter spetsen öppningen genom polering spetsen i avsaknad av trycket. Steg 7 och 8 kan upprepas för att finjustera både form och mått pipettspetsen.
10. Stäng av trycket och samtidigt pekar pipettspetsen i en säker riktning, ta bort pipetten och placera den i ett rent förvaringsbox där det kommer att skyddas från damm.
    
    Säkerhet OBS: Om lufttrycket inte är avstängd, kan pipetten komma ut från pipetten innehavaren under avlägsnande.

Anteckningar om microforge

Vi använder en microforge samlade från off-the-shelf kommersiellt tillgängliga delar. (Du kan också köpa ett tryck från polering kit från ett fåtal företag, t.ex. ALA vetenskap, GlassWorx). Oavsett microforge är det viktigt att ha optik som är tillräckligt bra för att se toppen öppning, som ofta är bara några mikrometer i diameter. Vi använder en längre arbetsavstånd 100x lins för detta ändamål. Även belägga polering spole med hög smälttemperatur glas för att minimera deponering förångas metallen på pipetter.

Del 3: förväntade resultat

Måttligt tryck polering kan minska motståndet av en pipett, utan en märkbar förändring i öppningen diameter. Om så önskas kan detta protokoll användas för att göra pipetter med submikrona öppningar och motstånd mellan 5-10MΩ.

Discussion

Vi utvecklade ursprungligen denna metod för att göra pipetter användbart för patch-clamp inspelning 2-3 ìm nervceller i C. elegans ^1. Det är i rutinmässig användning i Goodman laboratoriet. Vi tryck-polish pipetter inte bara för inspelning från små C. elegans nervceller, men också för att få macropatch och en kanal inspelningar av jonkanaler som uttrycks i Xenopus oocyter. För ett givet tips öppnande diameter, producerar trubbiga formen ett lägre motstånd pipett. Lägre pipett motstånd leder till lägre serier motstånd och lägre brus inspelningar.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve