JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג'ין

1,2, 1, 1,2

1Department of Genetics, Harvard Medical School, 2Department of Cardiology, Children’s Hospital Boston

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

    Date Published: 3/09/2009, Issue 25; doi: 10.3791/1115

    Cite this Article

    Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115, doi:10.3791/1115 (2009).

    Abstract

    אחד היתרונות של דג הזברה לומד הוא הקלות והמהירות של מניפולציה רמות החלבון בעובר. Morpholinos, אשר oligonucleotides סינתטי עם ההשלמה antisense כדי RNAs היעד, ניתן להוסיף את העובר כדי לצמצם את הביטוי של גן מסוים המוצר. לעומת זאת, ה-mRNA מעובד ניתן להוסיף העובר להגדיל את רמות של המוצר גן. הרכב להוספת או mRNA או morpholino לעובר הוא microinjection. Microinjection יעילה ומהירה, המאפשרת הזרקה של מאות עוברים לשעה. וידאו זה מציג את כל השלבים הכרוכים microinjection. בקצרה, ביצים נאספים מיד אחרי שהרימו אותו בשורה נגד המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי. בשלב הבא, מחט קנס שקצהו עמוסה חומר הזרקה מחובר microinjector ומקור אוויר, שולט microinjector מותאמים לייצר נפח הזרקה רצוי. לבסוף, המחט הוא צלל לתוך החלמון של העובר ואת morpholino או mRNA הוא גורש.

    Protocol

    חלק 1: ייצור ביצה אוסף

    1. בלילה לפני זריקה, להגדיר את הדגים רבייה טנקים עם חוצצים במקום. כדי להגדיל את הייצור הכולל ביצה, דגים ניתן להגדיר יחס של שתי נקבות על זכר אחד אם תרצה בכך.
    2. למחרת בבוקר, אחרי האורות בחדר נדלק, למשוך את חוצצים מטנקים מספר ולאפשר כ 20 דקות של זמן הזיווג באין מפריע.
    3. בעזרת מסננת, לאסוף את הביצים מן הכלובים לגידול ולשטוף אותם במים ביצה. יוצקים את הביצים לתוך צלחת פטרי עם מים ביצה מופרית להסיר ביצים ופסולת עם פיפטה העברה. דגים יכולים להיות נערכו מחדש במיכלים גדולים כדי לייצר סיבובים נוספים של ביצים להזרקה. התאם את העיתוי של איסוף ביצים כדי לאפשר מספרים המרבי של ביצים להיות מיוצר מבלי לאפשר להם לעבור את השלב תא בודד.
    4. המקום שקופיות מיקרוסקופ במכסה הפוכה של צלחת פטרי 100mm. השתמש פיפטה להעביר בשורה את הביצים על הצד של המגלשה להרכיב עמודה בודדת. הסרה של עודפי מים ביצה משקופית על ידי לחיצה Kimwipe נגד הצד הנגדי הביצים. (איור 1A)

    חלק 2: משיכת המחט, טעינה, והכנת

    1. עם חולץ micropipette, למשוך כוס 1.0mm OD נימי לשתי מחטים חנות בצלחת פטרי 150mm ידי הנחת מעל רמפות מרק טיפשי. מחטים יכול להיות משך מראש.
    2. מחט Backload עם μL 3 של חומר ההזרקה באמצעות פיפטה microloader. נער את בולוס לעבר קצה המחט עד כמה יש בועות או לא הנותרים.
    3. הפעל את מקור האוויר microinjector. הכנס את המחט לתוך microinjector ולהבטיח חותם חזק בתוך הדיור. בדוק micromanipulator נמצא במצב תקין כדי לאפשר מגוון רחב של תנועה והסתגלות. תביאו את קצה מחט לתוך מטוס המבט של מיקרוסקופ, גבוה מעל הבמה, להתמקד באזור הדק של קצה. השתמש זוג מלקחיים חדה לצבוט את מחט בנקודה אשר משאיר המחט צר מספיק כדי לחדור את סיסית וחלמון אבל עדיין מסוגל לספק גודל חרוז עקבי. טיפה של שמן מינרלי על מיקרומטר ניתן להשתמש כדי לחשב את עוצמת הקול של כל הזרקה. כאשר מוזרק לתוך השמן, חרוז בקוטר של 0.1 מ"מ מכיל 500 PL של חומר ההזרקה (1B דמות); כרכים הזרקה של 500 PL או 1nL משמשים בדרך כלל. לדכא את דוושת רגל ולנטר את גודל חרוז בעוד זמירה את המחט והתאמת לחץ ההזרקה לפי הצורך. כרכים הזרקת אידיאלי תמלא כ 10% מנפח הביצה. איכות קצה מחט הוא חיוני כדי להקל על שניהם הזרקת ואת איכות ועקביות של התוצאות.

    חלק 3: הזרקה

    1. ודא העוברים לא התפתחו מעבר לשלב ארבע התא. באופן אידיאלי, עוברים צריך להיות בשלב אחד התא.
    2. מנמיכים את המחט לכיוון הטור של ביצים, מחזיק את המנה במקום עם היד מול שלך.
    3. פירס את פני השטח של סיסית והזן את החלמון במכה אחת חלקה תוך כדי צפייה לכל ריסוק או קריעה של שק החלמון. להזריק את חומר הזרקה לתוך החלמון (דמות 1C). הימנע הזרקת בועות אוויר או מתיחת חלמון כמו גם יכול להיות קטלני לעובר. עבודה לאורך הקו, להתאים את הלחץ הדרוש כדי לשמור על גודל חרוז עקבית, באמצעות קצה פיפטה, להסיר ביצים שנראים מופרית או נהרסים בתהליך הזרקה.
    4. לאחר השלמת עמודה של ביצים, להשתמש בזרם עדין של מים ביצה להעביר את הביצים מוזרק לתוך צלחת פטרי נקי. חזור על פי הצורך. שמור עוברים uninjected מספר כביקורת. בסוף של יום אחד, להסיר עוברים מתים להקליט את מספר העוברים מוזרק. החלף את המים ביצה בצלחת מעת לעת כדי להקטין את הסיכוי לזיהום.

    חלק 4: תוצאות נציג

    תלוי מה זה להיות מוזרק, העוברים עשויים לשרוד בקצב נמוך יותר מאשר אחים uninjected שלהם. למרבה המזל, קל להזריק מספרים עצומים של אותם, אז זה רק לעתים נדירות בעיה. זה נורמלי morphants להציג הפיתוח מתעכב מעט.

    כדי להמחיש את התוצאות של microinjection, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לתפעל את רמות החלבון הלב של זכוכית (Heg). Heg הוא חלבון הטרנסממברני הדרושים לפיתוח לב נורמלי. בהעדר שלה, עוברים לפתח לבבות עם קטעי יבוא ענק ותאי 1. אנו מזריקים two morpholinos מתואר בעבר נגד heg, heg_e3i3_egfr1 ו heg_e4i4_egfr2, בריכוז של 500 מיקרומטר. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, שולט אח uninjected נראים תקינים, כצפוי (2A דמות ו-B). עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח (דמות 2C). למרות ליבם של רוב morphants אלה שינו את המורפולוגיה, חדרי שלהם הם בגודל רגיל (דמות 2D). עוברים מוזרקעם heg_e4i4_egfr2 מומים בלב התערוכה משתנה. חלקם נראים תקינים, בעוד אחרים יש שטחים גדולים יבוא אטריה מוגדל בינוני (2E דמות ו-F). מוטציה heg, כפי שדווח בעבר 1, יש דרכי יבוא מוגדל עצומה ו אטריום (דמות 2G ו-H).

    אנחנו גם עוברים wildtype מוזרק עם mRNA 400 ng / μL עיבד מ heg באורך מלא cDNA. אמנם שולטת uninjected להתפתח בצורה תקינה (איור 3A ו-B), עוברים הזריקו heg mRNA בתערוכה מגוון של פנוטיפים החל המראה wildtype כדי cyclopia חמור, קיצור של ציר הגוף העיקרי, נמק של הראש והגוף, ועל ליקויים קו האמצע (דמות 3C ו-D).

    באיור 1. לעוברים להיות מוזרק הם נעמדו מול המיקרוסקופ שקופית בצלחת פטרי (A). נפח הזרקה נקבעת על ידי הזרקה לתוך שמן מינרלי דגש על מיקרומטר. נפח הזרקה של 500 PL, אשר נמצא בשימוש נפוץ, בעל קוטר של 0.1 מ"מ (B). מיד לאחר ההזרקה, morpholino או mRNA נראה כמו מקום להדגיש את החלמון (C).

    איור 2. בשלב ההפריה 2 ימים הודעה, עוברים uninjected אין פגמים ברוטו (א) או הפנוטיפ לב (B). עוברים מוזרק עם heg_e3i3_egfr1 morpholino יש בצקת במוח (C, חץ) אבל חדרי הלב בגודל רגיל (D). כמה עוברי מוזרק עם heg_e4i4_egfr2 morpholino יש קטעי זרימה מוגדלים אטריה (E, F). מוטנטים heg יש קטעי יבוא מוגדל קשה אטריה (G, H). (א), (ג), (E), ו - (G) הם תמונות DIC 4x, (ב), (ד), (F) (H) הם 20x תמונות DIC. אטריום = זה = בדרכי יבוא.

    איור 3. הפריה בגיל 24 שעות לכתוב, uninjected עוברי יש גוף ארוך, ישר, ללא פגמים או נמק קו האמצע (א) ושתי עיניים מוגדרים בבירור עם צינור עצביים ביניהם (B). כמה עוברי הזריקו mRNA heg, לעומת זאת, התערוכה ציר הגוף מקוצר, נמק, somites מעוותות (ג), ו cyclopia (ד '). (א) ו - (ג) הם תמונות DIC 4x, (ב) ו - (ד) הם 20x תמונות DIC.

    Discussion

    אחד היתרונות של מערכת מודל דג הזברה הוא הקלות בה מוצרי גן מסוים ניתן להוסיף או לבטל מן העובר על ידי microinjection. כדי בכל מקום בגוף overexpress חלבון מסוים, קידוד ה-mRNA הוא מוזרק לתוך החלמון בשלב 1-התא. במהלך הפיתוח הבאים של העובר, RNA מופץ ברחבי האורגניזם ותורגם. לעומת זאת, כדי למנוע חלבון מסוים, morpholinos משמשים. Morpholinos הם oligonucleotides סינתטי נועד עם ההשלמה antisense כדי RNAs ספציפיים. כמו mRNAs, morpholinos מוזרקים לתוך החלמון בשלב 1-התא. בתוך העובר הם נקשרים RNAs היעד שלהם, למנוע תרגום.

    השינוי העיקרי צריך להיעשות עבור כל morpholino או mRNA הוא הריכוז של החומר המוזרק. גבוה מדי ריכוז או morpholino או mRNA עלול לגרום אי - רעילות ספציפיים, בעוד כל morpholino חייבים להיבדק אמפירית כדי לקבוע ריכוז אופטימלי שלה, בדרך כלל ריכוזי morpholino בין 200 מיקרומטר ו 500 מיקרומטר להפיל פעילות הגן ביעילות מבלי לגרום אי - פגמים ספציפיים. גודלו המדויק של פתיחת מחט זה לא קריטי. בתוך במגוון גדלים מחט, בלחץ הזרקה וזמן הזרקה ניתן להתאים לייצר בולוס נפח הנכון.

    Morpholinos יש יישומים רבים, כולל לנתיחה התפקודית של תחומים בתוך החלבון. כאשר תוכנן יעד ספציפי, אקסון אינטרון צמתים, morpholinos תמנע שחבור התרחשות שם. בדקנו את ההשפעה של שתי morpholinos אשר נקלטות אקסון אינטרון צמתים ב-mRNA מראש של heg. Heg_e3i3_egfr1 morpholino נקשר הצומת בין אקסון אינטרון 3 ו 3, מניעת מכונות שחבור מתוך שילוב של אקסון 3 לתוך תמלילי בוגרת. Heg_e4i4_egfr2 morpholino דומה מסיר אקסון 4. שני אקסונים 3 ו -4 לקודד תחומים המכיל EGF כמו חוזר. עוברים כמה הזריקו heg_e4i4_egfr2 בינוני phenocopy מוטציה; ניסויים נוספים יידרשו להבין את התפקיד של Heg אקסון 4 בהתפתחות הלב. באופן מפתיע, עוברים הזריקו heg_e3i3_egfr1 יש בצקת במוח, תכונה לא ראיתי מוטציות heg. זה יכול להיות בגלל היכולת של morpholinos להיקשר תמלילי אימהית זה יהיה מעושה מוטנטים zygotic.

    Disclosures

    Acknowledgements

    אנו מכירים אנשי המעבדה Mably ו Narie סטורר לקבלת סיוע טכני שלהם, איגוד הלב האמריקני (NCRP המדען פיתוח גרנט 0635363N) לבין הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (גרנט SCCOR HL02 RFA-027) למימון.

    Materials

    Name Type Company Catalog Number Comments
    Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI 100
    Micromanipulator Tool Narishige International MN 153
    Needle Puller Tool Sutter Instrument Co. P 97
    Glass Capillaries Tool World Precision Instruments, Inc. TW100 F6
    Microloader Pipettes Tool Eppendorf 5242956.003
    Needle Holder Tool World Precision Instruments, Inc. MPH310

    References

    1. Mably, J.D., Mohideen, M.P.K., Burns, C.G., Chen, J., & Fishman, M.C. heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2138-2147, (2003).

    Comments

    19 Comments

    Request:           Respested sir/ madam                                Please can you send the protocol of DNA isolation, RAPD, and Procedure, culture media composition etc for protoplast culture. thanks.
    Reply

    Posted by: atanu d.April 2, 2009, 5:09 AM

    You must have posted on the wrong protocol.  Ours is for zebrafish embryo microinjection.  Good luck finding the information you need!
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 2, 2009, 3:24 PM

    My translation-blocking morpholino is carboxy-fluoresecin tagged but I don't see the fluorescence under the microscope after injection? Can the concentration be too low? How dŒs the tag work? Thank you 
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 17, 2009, 10:05 PM

    Because the fluorescence of carboxyfluorescein dŒs not require any morpholino-related mechanism, I would verify that the injection material alone is fluorescing under your microscope. The tag is simply attached to the morpholino during manufacturing to ensure the presence of the morpholino in the injected tissue. The final concentration within the embryo would have to be extremely low to not be visible at all.    
    Reply

    Posted by: Michael S.April 21, 2009, 10:47 AM

    Hey guys do you see any intergration events when injecting into the yolk? Would you expect to see a greater number intergration events if you injected directly into the cell? Have you seen yolk glowers when injecting reporter genes (e.g RXP/GFP) and if so what do you think is occuring here? Intergaration?

    Regards

    Giles
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 22, 2009, 3:40 AM

    Hi Giles,
    When you inject DNA into the yolk, you get some integration, but not as much as when you inject into the cell. If you use the tol² system and inject DNA with particular flanking sequences and transposase RNA, you get a huge amount of integration. We do see yolk glowers; we're not sure whether this is due to maintenance of the plasmid as an episome, or whether integration has occured.
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 24, 2009, 1:11 PM

    Hi, Jonathan Rosen
    First of all thanks for such an informative presentation. I really liked it a lot and I am highly impressed with the techniques which has been used by your lab.Could you send the protocol for the microinjection of zebrafish embryo to analyse gene function. Also can you please let me know which equipment you use to displace embryos from one place to another inside the petridish or in agarose gel.
    I shall be thankful to you
    Kind Regards
    Avdesh
    chaudharyavdesh@gmail.com
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 23, 2009, 10:18 AM

    dŒs the orientation of the embryo matter prior to injection? i always thought that the needle should pierce opposite to the cell, through the yolk sac. also, can a thick, firm needle damage the embryo, as opposed to a thin unsupported one?
    thanks
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 12, 2010, 9:16 PM

    I find it easiest to inject without going through the cell. Too thick a needle can definitely damage the embryo; if you're seeing a lot of yolk leak out after you inject, the needle is too thick.
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 17, 2010, 6:06 PM

    Sir i would like to know a simple study using wild type embryos of the Zebra fish with out using GFP
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 25, 2010, 2:20 AM

    Sir i would like know a simple invitro study on the wild type embryos of Zebrafish with out GFP
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 25, 2010, 2:22 AM

    Hi, Thanks for this video! Other protocols suggest injecting DNA/RNA/morpholino dissolved in KCl or Danieau's. Do you use one of these or just miliQ water, and do you think the solution makes a difference for survival? Thanks!
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 24, 2012, 10:21 AM

    Hi. Glad the video was helpful. Although KCl or Danieau's solution are often used, we haven't found that either improves embryo survival over just water. I believe Gene-Tools recommends dissolving the stock morpholino in water now, rather than Danieau's solution as they recommended in the past. They may have done a more thorough comparison of the different solutions and their influence on embryo development.

    Good luck with your studies.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 25, 2012, 4:26 PM

    I am trying micro injection of EGFP-N3 vector to standardize the injection protocol. But in all my attempts, embryos are dying. what might be the reason. I am using methylene blue as a tracker. Please help me out.
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 7, 2012, 7:23 AM

    I have never tried it with methylene blue. I would use phenol red. I have also found that I get more lethality from DNA injection than from RNA injection. If you want to globally over-express a gene early in embryonic development, RNA is better anyway because it will go into every cell, whereas DNA will be mosaic.
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 7, 2012, 10:55 AM

    I WAS WONDERIN IF U HAVE EXPERIENCE USING TH PARASITE BLASTOCYST HOMINIS AS THE SHELL TO INJECTED OTHER PARASITES INTO AS MEANS OF PROTEIN PRODUCTION IF SO IWAS INTERESTED IN UR FININDINDS TO COMPARE TO THE THE VERY STRANG FINDINS FROM MY PROJECT
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 27, 2012, 8:07 PM

    How to prepare egg water
    Reply

    Posted by: Yumei C.July 22, 2012, 11:25 PM

    http://staff.missouriwestern.edu/users/daggett/PR1D.ZF.E3.pdf
    Reply

    Posted by: Michael S.November 6, 2012, 6:38 PM

    Hello,
    I am currently using a Hsp70I promoter in the Tol² system for generating transgenic zebrafish. Any suggestions for the best time and condition to do heat shock after microinjecton ? Is Hsp70I promoter leaky after recovery from heat shock? Your suggestions and comments will be highly appreciated.
    Reply

    Posted by: Hsu k.March 6, 2013, 3:19 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter