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संयंत्र हार्मोन और संबंधित संकेत यौगिकों संयंत्र प्रतिक्रियाओं के विभिन्न पर्यावरण उत्तेजनाओं और तनाव के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. सबसे गंभीर तनाव में कीट herbivory, रोगज़नक़ संक्रमण, सूखे और तनाव हैं. के लिए इनमें से प्रत्येक के हार्मोन का एक विशिष्ट सेट और / या संयोजन उसके ठीक धुन प्रतिक्रियाओं करने के लिए जाना जाता है, जिससे संयंत्र के अस्तित्व को सुनिश्चित करने पर जोर दिया. इन प्रतिक्रियाओं के विनियमन में शामिल प्रमुख हार्मोन jasmonic (जावेद) एसिड, चिरायता एसिड (एसए), और abscisic एसिड (ए.बी.ए.) कर रहे हैं. बेहतर व्यक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इन प्रतिक्रियाओं यह आवश्यक है के दौरान उनके संभावित बातचीत हार्मोन की भूमिका को समझने के लिए एक अस्थायी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक स्थानिक फैशन में उनकी बहुतायत में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए. इन और अन्य संकेत यौगिकों के आसान है, संवेदनशील है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रा का ठहराव के लिए हम एक भाप चरण निष्कर्षण और गैस क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी / एमएस) विश्लेषण (1, 2, 3, 4) के आधार पर विधि विकसित की है. प्लान्ट टिशू से अम्लीय जलीय द्वारा इन यौगिकों निकालने के बाद 1-propanol dichloromethane के साथ मिश्रित कार्बोक्जिलिक - एसिड युक्त यौगिकों methylated गर्मी के तहत volatilized, और एक polymeric शोषक पर एकत्र. एक नमूना शीशी में elution के बाद analytes गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग कर रहे हैं और रासायनिक ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया है. उपयुक्त आंतरिक मानकों का उपयोग करें तो analyte और आंतरिक मानक के शिखर क्षेत्रों से संबंधित द्वारा सरल मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है.
पहले हम निकासी के लिए 2ml पेंच टोपी शीशियों को तैयार करने की जरूरत है: 400ul निष्कर्षण बफर जोड़ें (एक propanol: H2O: केंद्रित एचसीएल 2:1:0.002 खंड / / खंड खंड) और संबंधित आंतरिक मानक के 10 μl (10ng/μl ) एक शीशी. तरल नाइट्रोजन में फ्रीज और तब चीनी मिट्टी मोती जोड़ें.
संयंत्र सामग्री जोड़ें (के बीच 50 और 200mg) है जबकि शीशियों अभी भी तरल नाइट्रोजन में तैनात हैं. ध्यान दें कि जोड़ा संयंत्र सामग्री के वजन से पहले आगे की प्रक्रिया के बाद सटीक मात्रा का ठहराव है, जो ताजा वजन पर आधारित है के लिए अनुमति देने के लिए अनुमान लगाया जा है.
यह सुनिश्चित करें कि सभी तरल नाइट्रोजन एक टोपी के साथ कसकर शीशी में बंद करने से पहले सुखाया जाता है. ध्यान दें कि टोपी के लिए एक रबर homogenization के दौरान सॉल्वैंट्स का spills और इस प्रकार, निकाले यौगिकों को रोकने के लिए सील है की जरूरत है.
30 सेकंड के लिए एक FastPrep या 6000 के एक गति (Precellys के लिए) पर Precellys मनका चक्की homogenizer में ऊतक homogenize.
Homogenizer से शीशियों व्यक्तिगत निकालें, ध्यान टोपी खोलने के लिए और प्रत्येक नमूने dichloromethane के 1ml जोड़ने. फिर कसकर बंद और 10-15sec के लिए फिर से छह हज़ार (Precellys) homogenize शीशियों.
एक tabletop अपकेंद्रित्र शीशियों स्थानांतरण और अलग 60sec के लिए 10.000xg पर जलीय चरण से जैविक चरण.
चरण जुदाई के बाद कम व्यक्तिगत शीशियों से हरी (जैविक चरण, हार्मोन और आंतरिक मानकों हैं) एक स्वच्छ 4ml कांच की शीशी परत हस्तांतरण. पानी के हस्तांतरण (ऊपरी चरण) से बचें. वैकल्पिक रूप से, एथिल एसीटेट dichloromethane के बजाय प्रयोग किया जा सकते हैं. उस मामले में ethyacetate चरण ऊपरी परत (हरा) हो सकता है और अब आसान हटाने और एक ताजा 4ml कांच की शीशी को हस्तांतरित. पहले की तरह, पानी के हस्तांतरण से बचने.
10-25 (नमूने पर निर्भर करता है) के बारे में मिनट के लिए एक कई गुना के माध्यम से हवा के साथ बंद विलायक उड़ा, एक एकल airflow के टिप के साथ की जाँच करें अगर नमूने सूख रहे हैं (ध्यान). Overdry नमूने मत करो, इस के लिए यौगिकों के नुकसान का कारण हो सकता है.
एक बार नमूने सूख रहे हैं हम कार्बोक्जिलिक के मेथिलिकरण एसिड हमारे नमूनों में यौगिकों से युक्त शुरू कर सकते हैं. सबसे पहले, एक मिश्रण / diethyether मेथनॉल (09:01 खंड / खंड) के 100 μl प्रत्येक शीशी 2M trimethylsilyldiazomethane समाधान (hexane, सिग्मा Aldrich में) के 4μl द्वारा पीछा करने के लिए जोड़ रहे हैं. शीशियों तुरंत एक खुले शीर्ष पेंच एक सिलिकॉन पट Teflon लाइन के साथ लगे टोपी के साथ बंद हो जाती हैं. धीरे हिलाएँ और आरटी पर 25 के लिए 30min के लिए सेते हैं.
चरण 9 खत्म करने के बाद, इच्छित संग्रह के तापमान पर एक हीटिंग ब्लॉक और सेट पर बारी है. methylated यौगिकों की अस्थिरता उनके आकार पर है, लेकिन यह भी = हे, ओह, और राष्ट्रीय राजमार्ग जैसे अन्य, अधिक ध्रुवीय समूहों पर निर्भर करता है. Jasmonic एसिड और चिरायता एसिड मिथाइल का एक संग्रह तापमान एस्टर के लिए लगभग 80 ° सी पर्याप्त हैं, जबकि उदाहरण के लिए C18 फैटी एसिड जैसे अन्य यौगिकों, jasmonic एसिड अमीनो एसिड conjugates, coronatine, और 12-oxo - phytodienoic एसिड मिथाइल एस्टर के बीच तापमान की आवश्यकता होती है 180-200 ° सी प्रभावी ढंग से भाप बनकर उड़ जाना करने के लिए.
एक 30min ऊष्मायन के बाद मेथिलिकरण प्रतिक्रिया करने के लिए अवांछित माध्यमिक प्रतिक्रिया से बचने के लिए रोका जा जरूरत है. यह एक 2M एसिटिक प्रत्येक शीशी एसिड समाधान (hexane में) के 4 μl जोड़कर किया जाता है. कैप और एक छोटी vortexing के साथ शीशियों को बंद करने के बाद, नमूने के लिए एक और 30min के लिए सेते अनुमति दी जाती है.
इस भाप चरण निकासी के लिए इस्तेमाल फिल्टर हस्तनिर्मित और प्रस्तुत फार्म में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं. वे एक बाहरी Teflon (के बारे में लंबे 7-8cm) ट्यूब, जो एक तरफ से एक अच्छी तरह से ढाले 4cm के बारे में लंबाई के ग्लास ट्यूब डाला जाता है से मिलकर बनता है. Teflon ट्यूब के दूसरे पक्ष पर एक स्टेनलेस स्टील जाल डिस्क ट्यूब के अंदर धकेल दिया है जब तक यह भीतरी ग्लास ट्यूब पहुँचता है और कि पर 20 के बारे में 30mg adsorbent (या तो 80/100 SuperQ (बंद) या ® HayeSep Q80/100) कर रहे हैं जोड़ा. एक और स्टेनलेस स्टील जाल डिस्क डाला और अंत में एक गिलास टिप Teflon ट्यूब में धक्का है, जिससे ध्यान शोषक पर स्टेनलेस स्टील जाल डिस्क दबाने. एक विस्तृत तस्वीर एक फिल्टर संख्या 1 में दिखाया गया है. चित्रा 1.
11 कदम की ऊष्मायन समय के दौरान, methylated और इस तरह, वाष्पशील संयंत्र हार्मोन के संग्रह के लिए फिल्टर, मेथनॉल के पहले 200ul का उपयोग धोया जा है, और तब 200ul dichloromethane प्रत्येक के साथ 2 washes. फिल्टर में सॉल्वैट शेष तो हवा से बुझ. फिल्टर अब भाप चरण निष्कर्षण के माध्यम से अस्थिर हार्मोन के फँसाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
ऊष्मायन के 30min बाद 4ml शीशी टोपी के रबर septa एक स्केलपेल के साथ काट रहे हैं. भाप चरण निष्कर्षण साफ फिल्टर 800ml/min के बारे में एक प्रवाह दर पर अलग - अलग निर्वात लाइनों से जुड़े हैं द्वारा संयंत्र हार्मोन इकट्ठा. फिल्टर तो कटौती septa के माध्यम से शीशी में डाला जाता है. एक छोटा सा pipet टिप भी के लिए एक वायुइनलेट के रूप में में कार्य करने के लिए डाला जाता है. इस प्रक्रिया के प्रारंभिक भाग के दौरान डाला फिल्टर के साथ शीशियों के लिए आयोजित किया हैशीशी के अंदर तरल के किसी भी से बचने के लिए फिल्टर टिप है, जो फिल्टर और बाद में भी जीसी / एमएस दूषित होता के साथ संपर्क में पाने के लिए एक ईमानदार स्थिति में है. शीशियों तो हाथ से आयोजित की जाती हैं जब तक सभी तरल फिल्टर के माध्यम से सुखाया जाता है. फिर संलग्न फिल्टर के साथ शीशियों हीटिंग ब्लॉक और गर्मी सुखाया 3min के लिए एकत्र यौगिकों पर रखा जाता है. सेटअप के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रणाली के सिद्धांत घटकों संख्या 1 में चित्रित कर रहे हैं. इस अंतिम भाप चरण निष्कर्षण कदम के बाद अभी भी जुड़ी फिल्टर के साथ शीशियों एक रैक पर रखा जाता है और शांत करने की अनुमति दी.
जब फिल्टर कमरे के तापमान तक पहुँच चुके हैं फिर वे 150ml dichloromethane के साथ एक 1.5 मिलीलीटर एक डालने के साथ फिट जीसी शीशी में eluted हैं. अॉॉल्टर बाहर फिल्टर शीशियों छाया हुआ हैं और जीसी / एमएस द्वारा विश्लेषण से शेष विलायक उड़ाने.
एक गैस chromatograph एक विभाजन / splitless इंजेक्टर (splitless मोड 250 डिग्री सेल्सियस, इंजेक्शन 1μ मात्रा) एक बड़े पैमाने पर रासायनिक ionization मोड (सीआई) में संचालित स्पेक्ट्रोमीटर को interfaced विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए है) के साथ सुसज्जित है. कम्पाउँड स्तंभ HP - 1ms पर अलग हो रहे हैं (025μm 30m x x 0.25mm) 40 में आयोजित डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन के बाद 1min के लिए, और फिर तापमान 15 में क्रमादेशित सी / 250 डिग्री सेल्सियस (10min) के लिए हीलियम के साथ मिनट ° वाहक के रूप में गैस (निरंतर प्रवाह 0.7ml/min). एमएस आधारित विश्लेषण के लिए दोनों quadropole (जैसे Agilent HP5973) और एक आयन जाल आधारित (जैसे Varian सैटर्न 2200) मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए इस्तेमाल किया जा सकते हैं. के रूप में एक गैस या तो सीआई isobutane (गैस टैंक में आता है) या मेथनॉल (एक तरल जलाशय से वाष्पकणों उपयोग किया जाता है) का उपयोग किया जा सकता है, तथापि, प्रत्येक मामले में ionization प्रतिक्रिया के टुकड़े चयनित आयन गिनती प्रोग्राम (इस प्रकार) से पहले जाँच की जानी चाहिए बनाई गई हैं. हम एक Varian जीसी 3900/Saturn एमएस 2200 और सीआई अभिकर्मक के रूप में प्रणाली मेथनॉल के लिए निम्नलिखित प्रोग्राम का इस्तेमाल किया है: 5.00 - 11.30min आयनों (एम 1) 153-158 + (मिथाइल सैलिसिलेट 153,मिथाइल 2 एच 5- सैलिसिलेट); 11.30-13.30min आयनों (एम 1) 207-228 + (मिथाइल jasmonate 207 और 225, मिथाइल dihydrojasmonate 209 और 227), 13.30-16.30min आयनों (एम 1) 237-300 + (मिथाइल abscisic एसिड 261, 2 मिथाइल एच 6-267 abscisic एसिड (abscisic एसिड मुख्यतः [महाराष्ट्र 2 हे 1] + आयनों का उत्पादन) सभी यौगिकों. प्रामाणिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानकों के साथ तुलना के द्वारा की पहचान किया जाना चाहिए जावेद, SA, और ए.बी.ए. की मात्रा पीक क्षेत्र correlating द्वारा किया जाता है. (निकाले आयनों) और संबंधित आंतरिक मानक के शिखर क्षेत्र (निकाले आयनों) के साथ भी संयंत्र सामग्री का इस्तेमाल किया ताजा वजन पर आधारित है.
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विधि यहाँ प्रस्तुत संयंत्र संकेत प्रदान की है कि परिसर के आकार और रासायनिक प्रकृति जा रहा निकाले, methylated, और vaporized से नहीं रोकता यौगिकों की एक विस्तृत सरणी के लिए मज़बूती से काम करने के लिए सिद्ध किया गया है. इसके अलावा, मेथिलिकरण प्रक्रिया है के रूप में यह इस के साथ साथ वर्णित है derivatization का एकमात्र रास्ता नहीं है. Silyllation और एसिटिलीकरण वैकल्पिक तरीकों और प्रोटोकॉल रहे हैं आसानी से ऑनलाइन पाया जा सकता है.
यदि मास स्पेक्ट्रोमीटर एकल आयन जन रेंज है कि एक रन के दौरान दर्ज की गई है सीमित किया जाना चाहिए प्रक्रिया से भी कई अवांछित आयनों बाहर निगरानी के लिए सक्षम नहीं है. उदाहरण के लिए, jasmonic (जावेद) एसिड और अपने आंतरिक मानक dihydro jasmonic एसिड (dhJA) के दो प्रमुख (एक एम) + आयनों, जावेद के लिए 207 और 225, और 209 और मेथनॉल के साथ रासायनिक ionization के दौरान dhJA के लिए 227 का उत्पादन. क्योंकि इन दो प्रमुख (एक एम) + जनता (जावेद के लिए 207 और 225, 209 और 227 dhJA लिए) एक ही बहुतायत rationfor जावेद और dhJA नहीं है, वे दोनों और निकाले जाना चाहिए मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया . इसलिए, एक जन रेंज 207 से 228 के लिए और दर्ज किया जाना चाहिए विशिष्ट आयनों को बाद में निकाला जाना चाहिए.
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Schmelz, E.A., Engelberth, J., Tumlinson, J.H., & Alborn, H.T. The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites. Plant Journal 39 (5), 790-808, (2004).
