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 JoVE Immunology and Infection

विशिष्ट सेल आबादी के पूरक रिक्तीकरण द्वारा रिक्तीकरण

1

1BloodCenter of Wisconsin, Blood Research Institute

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    प्रभावी ढंग से उनकी शुद्धि अक्सर आवश्यक है प्रतिरक्षा सेल आबादी के समारोह का अध्ययन. पूरक रिक्तीकरण उच्च शुद्धता के साथ प्रतिरक्षा सेल आबादी के अलगाव के लिए एक तेजी से और सस्ती तकनीक है.

    Date Published: 2/05/2010, Issue 36; doi: 10.3791/1487

    Cite this Article

    Dittel, B. N. Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion. J. Vis. Exp. (36), e1487, doi:10.3791/1487 (2010).

    Abstract

    प्रतिरक्षा सेल आबादी की शुद्धि अक्सर क्रम में उनके अद्वितीय कार्य का अध्ययन आवश्यक है. वास्तविक समय पीसीआर और माइक्रोएरे विश्लेषण के रूप में विशेष रूप से, आणविक दृष्टिकोण में उच्च शुद्धता के साथ सेल आबादियों के अलगाव की आवश्यकता है. आमतौर पर इस्तेमाल किया शुद्धि रणनीतियों फ्लोरोसेंट सक्रिय कक्ष (FACS) छँटाई, चुंबकीय मनका जुदाई और पूरक रिक्तीकरण शामिल हैं. तीन रणनीतियों, पूरक कमी तेज, सस्ती, कोशिकाओं और एक उच्च सेल उपज पर कोमल होने का लाभ प्रदान करता है है. पूरक प्रणाली प्लाज्मा प्रोटीन की एक बड़ी संख्या है कि जब सक्रिय एक proteolytic एक झिल्ली हमले जटिल है कि कोशिका मृत्यु में जिसके परिणामस्वरूप एक सेल की सतह पर एक ताकना रूपों के गठन में समापन झरना आरंभ से बना है

    Protocol

    ए खरगोश पूरक

    1. शेयर खरगोश पूरक कमरे के तापमान पर thawed जाना चाहिए, और फिर 0.5 और / या 1 मिलीलीटर मात्रा में aliquoted और -20-80 पर डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए जमे हुए.
    2. पूरक के प्रत्येक बहुत इष्टतम काम निर्धारित एकाग्रता titrated होना चाहिए. आमतौर पर, 1:10-1:20 की एक कमजोर पड़ने इष्टतम है.
    3. खरगोश पूरक हमेशा बिक्री के लिए पहले नहीं presterilized है, कोशिकाओं के अंतिम उपयोग पर निर्भर करता है, पूरक निष्फल फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए जब aliquoted और जमे हुए या कोशिकाओं के अलावा से पहले.

    बी एंटीबॉडी चयन

    1. नहीं सभी एंटीबॉडी सक्रियण पूरक पर प्रभावी रहे हैं, इस प्रकार एंटीबॉडी पहली गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए.
    2. दोनों माउस और चूहा MAB सक्रियण पूरक पर प्रभावी रहे हैं.
    3. आईजीएम प्रतिपिण्डों आम तौर पर प्रेरित पूरक सेल lysis में उपयोग आईजीजी द्वारा पीछा के लिए सबसे कुशल हैं. सक्रियण पूरक के लिए सबसे अच्छा आईजीजी isotypes प्रजातियों के बीच बदलती हैं.
    4. प्रत्येक एंटीबॉडी 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल घनत्व में इष्टतम उपयोग के लिए titrated होना चाहिए.

    सी. बेसिक प्रोटोकॉल

    1. 5 से शुरू सेल की आबादी को समायोजित x 10 7 मध्यम युक्त गर्मी निष्क्रिय FCS में कोशिकाओं / मिलीलीटर . कक्षों की अंतिम मात्रा दो बार शुरू मात्रा हो जाएगा. कुछ कोशिकाओं को बचाने के लिए इतना है कि कमी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है याद रखें.
    2. प्रत्येक एंटीबॉडी उचित पूर्व निर्धारित एकाग्रता या कमजोर पड़ने पर सेल निलंबन के लिए जोड़ा जाना चाहिए. कोशिकाओं को उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
    3. पूरक की जरूरत की राशि की गणना. कमरे के तापमान पर पूरक शेयर पहले गला लें. यदि पूरक बाँझ नहीं है, यह एक कम प्रोटीन बाध्यकारी सिरिंज टिप फिल्टर का उपयोग कर बाँझ. सिरिंज करने के लिए, मध्यम के कई मिलीलीटर पूरक के अलावा पहले और ऐड कोशिकाओं और एंटीबॉडी युक्त ट्यूब में सीधे फिल्टर.
    4. ट्यूब में अंतिम मात्रा समायोजित करें ताकि कोशिकाओं 1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल हैं.
    5. एक घंटे के लिए, 37 ° C पर कोशिकाओं सेते हर 15 मिनट में मिश्रण.
    6. कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    7. मध्यम के साथ दो बार धोएं. सेल मलबे polystyrene ट्यूबों के पक्ष में रहना होगा. मृत कोशिकाओं और मलबे एक सेल या घनत्व ढाल centrifugation द्वारा झरनी का उपयोग कर समाप्त किया जा सकता है.
    8. पहले और बाद में कमी ब्याज की सेल की आबादी की तुलना द्वारा सेल शुद्धता की जाँच करें. प्रवाह cytometry और immunohistochemistry सेल पवित्रता निर्धारण के दो अच्छे तरीके हैं.

    प्रतिनिधि परिणाम

    जब एक MAB कि एक दौर के बाद पूरक, सेल रिक्तीकरण को सक्रिय करने में अत्यधिक कुशल है का उपयोग कर अधिक से अधिक तो 95% है. यह चित्रा 1 जहां हम माउस 32.2% αβ टी कोशिकाओं की रचना के रूप में TCRβ के प्रवाह cytometry द्वारा अभिव्यक्ति (eBioscience, सैन डिएगो, सीए) के द्वारा पता लगाया splenocytes के साथ शुरू में दिखाया गया है. हम टी कोशिकाओं का उपयोग कर एक MAB Thy1 के लिए विशिष्ट सभी टी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त प्रोटीन, लेकिन अन्य नहीं leukocytes कम करते हैं. एंटीबॉडी हम इस्तेमाल एक चूहे 2 IgG2c Y-19 था. वर्णित प्रक्रिया के बाद, TCRβ जनसंख्या 1.56%, 95% से अधिक की कमी करने के लिए कम हो गया था.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. Thy1 के रिक्तीकरण + सक्रियण पूरक द्वारा प्लीहा - संबंधी टी कोशिकाओं कुल माउस splenocytes. तिल्ली और आरबीसी के lysis के homogenization के द्वारा प्राप्त किया गया . विरोधी thy1 और बच्चे को पूर्व निर्धारित सांद्रता में खरगोश पूरक ऐसी थी कि अंतिम सेल एकाग्रता 1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल splenocytes के एक एकल कक्ष निलंबन के लिए जोड़ा गया था. 1 घंटे के लिए 37 ऊष्मायन के बाद डिग्री सेल्सियस, कोशिकाओं में दो बार धोया गया और trypan सेल व्यवहार्यता के लिए नीले अपवर्जन द्वारा मूल्यांकन. कमी की दक्षता प्रवाह cytometry रिक्तीकरण (बाएं पैनल) से पहले और उसके बाद रिक्तीकरण (राइट पैनल) TCRβ + कोशिकाओं के प्रतिशत की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया गया था. क्षैतिज पट्टी सकारात्मक धुंधला इंगित करता है और पट्टी ऊपर संख्या प्रतिशत सकारात्मक.

    Discussion

    सेल आबादी की शुद्धि एक आम उनके कार्यों के अध्ययन के लिए आवश्यक प्रक्रिया है. यहाँ हम कोशिका प्रतिजन विशिष्ट एंटीबॉडी और पूरक रिक्तीकरण का उपयोग आबादी घट की एक तेजी से और प्रभावी विधि का वर्णन. किसी भी सेल की आबादी की कमी अगर एक पूरक सक्रिय प्रतिरक्षी एक वंश विशिष्ट मार्कर के लिए उपलब्ध है हासिल किया जा सकता है. यहाँ हम टी Thy1 के लिए एक MAB विशिष्ट का उपयोग कोशिकाओं की कमी का प्रदर्शन किया, एक प्रोटीन अनिवार्य रूप से सभी टी सेल आबादी के द्वारा व्यक्त की है. हम αβ टी कोशिकाओं के 95% से अधिक समाप्त हो गया और शेष splenocytes 68% से 98% के लिए बढ़ रहे थे. सेल पवित्रता का यह स्तर FACS और चुंबकीय मनका जुदाई सहित अन्य शुद्धि रणनीतियों के लिए इसी तरह की है. पूरक रिक्तीकरण एक तेजी से तकनीक है कि 1.5 घंटे में किया जा सकता है एक बार शुरू सेल की आबादी प्राप्त की है. पूरक कमी की एक और लाभ यह है कि किसी भी प्रयोगशाला तकनीक का प्रदर्शन क्योंकि यह महंगे उपकरण और अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है सकते हैं. केवल उपकरणों के प्रमुख टुकड़े की आवश्यकता एक पानी स्नान और एक अपकेंद्रित्र हैं. खरगोश पूरक विक्रेताओं की एक किस्म से एक उचित कीमत पर खरीदा जा सकता है (अभिकर्मकों की तालिका देखें) और कई MAB ATTC से खरीदा जा सकता है और स्थानीय बढ़ी लागत नियंत्रण. इसके विपरीत, FACS सेल छँटाई की क्षमता के साथ एक प्रवाह cytometer कि छह आंकड़े और महंगी fluorescently टैग MAB में खर्च होंगे की आवश्यकता है. चुंबकीय मनका जुदाई मामूली कीमत है, लेकिन एक चुंबक और चुंबकीय मोती, जो महंगा हो सकता है की खरीद की आवश्यकता है. इसके अलावा, कुछ चुंबकीय मनका जुदाई रणनीतियों भी स्तंभों की खरीद की आवश्यकता होती है.

    सेल रिक्तीकरण के लिए पूरक का उपयोग करने के लिए मुख्य बाधा प्रतिजन आवश्यक विशिष्टता के साथ MAB सक्रिय पूरक की उपलब्धता है. हालांकि मानव, माउस, चूहा और एंटीबॉडी सभी के लिए पूरक तय करने की क्षमता है, कुछ isotypes दूसरों की तुलना में बेहतर हैं. हालांकि सभी तीन प्रजातियों से आईजीएम पूरक फिक्सिंग पर अत्यधिक प्रभावी है आईजीजी isotypes बदलती हैं. इस प्रकार हर MAB पहले एक पायलट अध्ययन में परीक्षण किया जाना चाहिए है उसकी प्रभावशीलता निर्धारित करने के लिए. एंटीबॉडी कि अत्यधिक कुशल नहीं हैं के लिए, पूरक कमी की दो राउंड शेष सेल आबादी की व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना किया जा सकता है. एक लागत बचत के रूप में, एंटीबॉडी इष्टतम प्रभावशीलता के लिए titrated होना चाहिए. इसके अलावा, इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए शुद्ध होने की जरूरत नहीं है. हाइब्रिडोमा supernatants और जलोदर द्रव काम बस के रूप में प्रभावी ढंग से, जो आईजीएम एंटीबॉडी, जो शुद्ध मुश्किल कर रहे हैं के लिए विशेष रूप से सुविधाजनक है. एंटीबॉडी के साथ के रूप में, यह आवश्यक है कि पूरक एक पायलट अध्ययन में titrated हो. एकाग्रता की एक बहुत अधिक गैर - लक्षित सेल आबादी की व्यवहार्यता के नुकसान में परिणाम देगा. यह भी महत्वपूर्ण है कि ऊष्मायन समय 60 मिनट से अधिक नहीं करता है.

    हमारे प्रोटोकॉल में, हम एंटीबॉडी और पूरक के साथ सह सेते हैं. हालांकि, कोशिकाओं 15-30 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है और पूरक के अलावा पहले धोए. जब इस रणनीति का प्रयोग, कोशिका की सतह पर कोशिका प्रतिजन की हानि को रोकने के लिए बर्फ पर एंटीबॉडी incubations प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें, के रूप में पट्टी और कैपिंग या रिसेप्टर internalization द्वारा कुछ प्रोटीन के साथ होता है. हालांकि, अत्यधिक कुशल रिक्तीकरण पूरक के रूप में अन्य विधियों की तुलना में मुख्य दोष यह है कि यह सकारात्मक चयन के लिए नहीं किया जा सकता है. इस प्रकार यह मुश्किल है के लिए कक्षों की subpopulations प्राप्त. उदाहरण के लिए, यह मुश्किल हो सकता है के कूपिक बी कोशिकाओं है, जो सबसे अच्छा FACS द्वारा किया जाएगा से सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं को शुद्ध होता है. इस स्थिति में, सक्रियण पूरक टी कोशिकाओं व्यय जा रहा सॉर्ट किया गया कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस रणनीति तरह समय को कम, जो पैसे बचाने के लिए होगा और कोशिकाओं पर कम कठोर हो जाएगा.

    विशेष सेल आबादी की शुद्धि के बाद एक आम आवश्यकता है रणनीतियों का एक संख्या में विकसित किया गया है. पूरक रिक्तीकरण रणनीति का मुख्य लाभ अपनी सामर्थ्य, तकनीकी सादगी और समय की बचत कर रहे हैं.

    Disclosures

    Acknowledgements

    मैं Sreemanti बसु चित्रा 1 के लिए डेटा प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में NIH अनुदान AI069358 और BloodCenter रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    3-4 week baby rabbit complement Pel-Freez Biologicals 31061-3
    Water bath Various various An incubator set at 37 °C can also be used.

    References

    1. Janeway, C., Travers, P. Immunobiology : The Immune System in Health and Disease. London; San Francisco; New York: Current Biology Limited; Garland Pub. Inc (1994).
    2. Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens. II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol 12, 30-37 (1982).

    Comments

    11 Comments

    Hello!
    Thank you for this experimental video. I have a question about rabbit complement. Whether only 3-4 week baby rabbit complement could be applied in this experiment. How about RABBIT COMPLEMENT (31060-1)?
    Thank You!!
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 25, 2011, 4:45 AM

    I have always used the newborn complement. However, I am sure that the rabbit complement would work. If you try it and it works well, please make a posting letting everyone know.

    Thanks
    Reply

    Posted by: Bonnie D.April 27, 2011, 12:02 PM

    Hi, do you think rat, human or mouse complement dŒs the same job as rabbit complement?
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 11, 2012, 2:43 AM

    I don't have any experience using rat, human or mouse complement to deplete cells. I know that guinea pig complement also works. You would need a lot of plasma if you were going to used rat or mouse.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.January 11, 2012, 10:03 AM

    Ok, I was thinking of using rat, mouse or human complement as I have frozen aliquots of them. I guess I will give it a try. If anyone has prior experience in using them, please let me know! Thanks!
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 11, 2012, 8:08 PM

    Dear Bonnie, Can you tell me if your method works for adherent cell cultures? Thanks, Katherine
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 26, 2012, 7:05 PM

    Also, I assume the antibodies have to recognize cell surface proteins. Will the method work for if the cells are permeabilized?
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 26, 2012, 7:07 PM

    Katherine,

    I have never tried complement depletion on adherent cells, but in theory it should work. The antibodies do need to recognize cell surface proteins in order for the complement attack complex to assemble on the cell surface. If the cells are permeabilized they will already be dead and thus the complement won't have any additional affect.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.November 27, 2012, 12:06 PM

    Thanks Bonnie. I figured that the antibodies have to recognize surface proteins but I have also heard of gentle permeabilization methods that don't affect cell viability.
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 27, 2012, 1:05 PM

    The attack complex assembles on the surface of the cells and forms a pore in the cell membrane that leads to cell lysis. This system would not work intracellularly.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.November 27, 2012, 1:17 PM

    Has anyone tried B-cell depletion using CD19 (mouse) clone 1D3 (IgG²a)? I can deplete both CD4 and CD8 T-cells just fine with this protocol using IgG²a antibodies but I'm having trouble with the B-cells. Any suggestions?
    Reply

    Posted by: Jesse V.May 2, 2013, 9:14 AM

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