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 JoVE Immunology and Infection

Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l'épuisement Complément

1

1BloodCenter of Wisconsin, Blood Research Institute

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Pour bien étudier la fonction des populations de cellules immunitaires leur purification est souvent nécessaire. L'épuisement du complément est une technique rapide et peu coûteuse pour l'isolement des populations de cellules immunitaires avec une grande pureté.

    Date Published: 2/05/2010, Issue 36; doi: 10.3791/1487

    Cite this Article

    Dittel, B. N. Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion. J. Vis. Exp. (36), e1487, doi:10.3791/1487 (2010).

    Abstract

    La purification des populations de cellules immunitaires est souvent nécessaire afin d'étudier leurs fonctions uniques. En particulier, les approches moléculaires comme la PCR en temps réel et de l'analyse par microréseau nécessite l'isolement des populations de cellules avec une grande pureté. Stratégies de purification couramment utilisés comprennent le tri de cellules fluorescentes (FACS), séparation magnétique et l'épuisement des billes complément. Parmi les trois stratégies, l'épuisement de compléter offre l'avantage d'être rapide, peu coûteuse, doux sur les cellules et un rendement élevé de cellules. Le système du complément est composé d'un grand nombre de protéines plasmatiques qui lorsqu'il est activé initier une cascade protéolytique aboutissant à la formation d'un complexe membranaire d'attaque qui forme un pore sur une surface cellulaire entraînant la mort cellulaire

    Protocol

    Complément de lapin A.

    1. Complément de lapin stock doivent être décongelés à température ambiante, puis répartie dans des 0,5 et / ou volumes de 1 ml et congelé à -20 à 80 ° C pour stockage à long terme.
    2. Chaque lot de complément doit être titré pour déterminer la concentration optimale de travail. Généralement, une dilution de 1:10-1:20 est optimale.
    3. Le complément de lapin n'est pas toujours préstérilisés avant la vente, en fonction de l'utilisation finale des cellules, le complément doit être filtrée stérilisée quand aliquotés et congelés ou avant l'addition aux cellules.

    Sélection d'anticorps B.

    1. Pas tous les anticorps sont efficaces à l'activation du complément, ainsi que les anticorps doivent d'abord être testées pour leur activité.
    2. Les deux souris et le rat mAb sont efficaces à l'activation du complément.
    3. Les anticorps IgM sont généralement les plus efficaces pour une utilisation dans la lyse cellulaire induite par complètent suivie par des IgG. Les isotypes IgG mieux pour l'activation du complément varient entre les espèces.
    4. Chaque anticorps doit être adaptée pour une utilisation optimale à une densité cellulaire de 10 7 cellules / ml.

    C. Protocole de base

    1. Ajustez la population de cellules commencent à 5 x 10 7 cellules / ml dans le milieu de la chaleur contenant FCS inactivé. Le volume final des cellules sera le double du volume de départ. N'oubliez pas de sauvegarder certaines cellules de sorte que l'épuisement peut être quantifiée.
    2. Chaque anticorps devrait être ajoutée à la suspension cellulaire à la bonne concentration prédéterminée ou de dilution. Mélanger les cellules bien par inversion.
    3. Calculez le montant du complément nécessaire. Décongelez le stock de compléter à la température ambiante. Si le complément n'est pas stérile, stériliser l'aide d'un filtre à faible liaison protéique bout de la seringue. Pour la seringue, ajouter quelques ml de milieu avant l'ajout du complément et le filtre directement dans le tube contenant les cellules et d'anticorps.
    4. Ajuster le volume final dans le tube de sorte que les cellules sont à 1 x 10 7 cellules / ml.
    5. Incuber les cellules à 37 ° C pendant une heure, en mélangeant toutes les 15 minutes.
    6. Centrifuger les cellules et jeter le surnageant.
    7. Laver avec support double. Les débris cellulaires seront adhérer à la paroi des tubes en polystyrène. Les cellules mortes et les débris peuvent être éliminés à l'aide d'une passoire cellulaire ou par centrifugation en gradient de densité.
    8. Vérifiez la pureté des cellules en comparant la population cellulaire d'intérêt avant et après l'épuisement. La cytométrie en flux et d'immunohistochimie sont deux bonnes méthodes de détermination de la pureté des cellules.

    Les résultats représentatifs

    Lorsque vous utilisez un mAb qui est très efficace à l'activation de la déplétion des cellules de compléter, après une ronde est supérieure à 95%. Ceci est illustré dans la figure 1, où nous avons commencé avec des splénocytes de souris composé de 32,2% des cellules T αβ détectée par l'expression de TCRβ (eBioscience, San Diego, Californie) par cytométrie en flux. Nous appauvri cellules T en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques pour les Thy1, une protéine exprimée par toutes les cellules T, mais pas les autres leucocytes. L'anticorps a été utilisé, nous Y-19 un rat IgG2c 2. Suite à la procédure décrite, la population a été réduite TCRβ à 1,56%, soit une réduction supérieure à 95%.

    Figure 1
    Figure 1. L'épuisement des Thy1 + cellules T spléniques par l'activation du complément. Splénocytes de souris totales ont été obtenues par l'homogénéisation de la rate et la lyse des globules rouges. Anti-Thy1 et complètent bébé lapin à des concentrations prédéterminées ont été ajoutés à une suspension cellulaire unique de splénocytes telle que la concentration cellulaire finale était de 1 x 10 7 cellules / ml. Après une incubation de 1 heure à 37 ° C, les cellules ont été lavées deux fois et évalué par exclusion du bleu trypan pour la viabilité cellulaire. L'efficacité de la déplétion a été évaluée par cytométrie en flux comparant le pourcentage de TCRβ + cellules avant l'épuisement (à gauche) et après épuisement (panneau de droite). La barre horizontale indique coloration positive et le nombre au-dessus du bar est le pour cent positif.

    Discussion

    La purification des populations de cellules est une procédure commune nécessaires à l'étude de leurs fonctions. Nous décrivons ici une méthode rapide et efficace de l'épuisement des populations de cellules en utilisant un antigène-anticorps spécifiques et de l'appauvrissement de complément. L'épuisement de toute la population de cellules peut être réalisé si un anticorps activant le complément est disponible à un marqueur de la lignée spécifique. Ici, nous avons démontré l'épuisement des cellules T en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques pour les Thy1, une protéine exprimée par la quasi-totalité des populations de cellules T. Nous appauvri plus de 95% des cellules T αβ et les splénocytes restants ont été augmenté de 68% à 98%. Ce niveau de pureté des cellules est similaire à d'autres stratégies de purification dont FACS et séparation magnétique perle. L'épuisement du complément est une technique rapide qui peut être effectué en 1,5 heures une fois que la population de cellules de départ est obtenu. Un autre avantage de l'épuisement du complément est que tout laboratoire peut effectuer la technique car elle ne nécessite pas de matériel coûteux et des réactifs. Les seuls éléments majeurs de l'équipement requis sont un bain d'eau et une centrifugeuse. Le complément de lapin peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs, à un coût raisonnable (voir le tableau des réactifs) et de nombreux anticorps monoclonaux peuvent être achetés auprès de CIFA et cultivé localement pour contrôler les coûts. En revanche, FACS nécessite un cytomètre en flux avec une capacité de tri de cellules, qui coûtera dans les six chiffres marqués par fluorescence et coûteux mAb. Séparation magnétique perle est à prix modéré, mais nécessite l'achat d'un aimant et les billes magnétiques, qui peut être coûteux. En outre, certaines stratégies de séparation magnétique perles exigent également l'achat de colonnes.

    La principale pierre d'achoppement à l'utilisation du complément pour la déplétion des cellules est la disponibilité du complément activant mAb avec la spécificité d'antigène nécessaire. Bien que des anticorps humains, de souris et de rats ont tous la capacité à fixer le complément, certains isotypes sont mieux que d'autres. Bien que les IgM de ces trois espèces est très efficace pour la fixation de compléter les isotypes IgG varier. Ainsi, chaque mAb doit d'abord être testée dans une étude pilote pour déterminer son efficacité. Pour les anticorps qui ne sont pas très efficaces, deux tours de l'épuisement du complément peut être réalisée sans affecter la viabilité des populations de cellules restantes. Comme une des économies de coûts, les anticorps doivent être titrés pour une efficacité optimale. En outre, les anticorps utilisés n'ont pas besoin d'être purifié. Surnageants d'hybridome et travailler liquide d'ascite tout aussi efficacement, ce qui est particulièrement pratique pour les anticorps IgM, qui sont difficiles à purifier. Comme avec les anticorps, il est impératif que le complément sera titré en une étude pilote. Un haut trop de concentration va entraîner la perte de viabilité des populations de cellules non ciblées. Il est également important que le temps d'incubation ne dépasse pas 60 minutes.

    Dans notre protocole, nous avons co-incubation de l'anticorps et le complément ensemble. Cependant, les cellules peuvent être étiquetés avec l'anticorps pendant 15-30 minutes et lavés avant l'ajout du complément. Lorsque vous utilisez cette stratégie, assurez-vous d'effectuer les incubations d'anticorps sur la glace pour empêcher la perte de l'antigène des cellules à la surface cellulaire, comme c'est le cas avec certaines protéines en patchant et le plafonnement ou l'internalisation du récepteur. Bien que très efficace, le principal inconvénient pour compléter l'épuisement par rapport à d'autres méthodes, c'est qu'il ne peut pas être utilisé pour la sélection positive. Ainsi, il est difficile d'obtenir des sous-populations de cellules. Par exemple, il serait difficile de purifier les cellules B de la zone marginale des cellules B folliculaire, qui serait mieux fait par FACS. Dans cette situation, l'activation du complément peut être utilisé pour épuiser les cellules T afin de réduire le nombre de cellules à trier. Cette stratégie permettrait de réduire le temps de trier, ce qui permettrait d'économiser de l'argent et serait moins sévère sur les cellules.

    Depuis la purification des populations spécifiques de cellules est une exigence commune d'un certain nombre de stratégies ont été développées. Les principaux avantages de la stratégie de l'épuisement du complément sont son prix abordable, simplicité technique et des économies de temps.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Je tiens à remercier Sreemanti Basu pour fournir les données de la figure 1. Ce travail a été soutenu en partie par NIH AI069358 et la Fondation de recherche BloodCenter.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    3-4 week baby rabbit complement Pel-Freez Biologicals 31061-3
    Water bath Various various An incubator set at 37 °C can also be used.

    References

    1. Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. Current Biology Limited; Garland Pub. Inc London; San Francisco; New York (1994).
    2. Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).

    Comments

    11 Comments

    Hello!
    Thank you for this experimental video. I have a question about rabbit complement. Whether only 3-4 week baby rabbit complement could be applied in this experiment. How about RABBIT COMPLEMENT (31060-1)?
    Thank You!!
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 25, 2011, 4:45 AM

    I have always used the newborn complement. However, I am sure that the rabbit complement would work. If you try it and it works well, please make a posting letting everyone know.

    Thanks
    Reply

    Posted by: Bonnie D.April 27, 2011, 12:02 PM

    Hi, do you think rat, human or mouse complement dŒs the same job as rabbit complement?
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 11, 2012, 2:43 AM

    I don't have any experience using rat, human or mouse complement to deplete cells. I know that guinea pig complement also works. You would need a lot of plasma if you were going to used rat or mouse.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.January 11, 2012, 10:03 AM

    Ok, I was thinking of using rat, mouse or human complement as I have frozen aliquots of them. I guess I will give it a try. If anyone has prior experience in using them, please let me know! Thanks!
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 11, 2012, 8:08 PM

    Dear Bonnie, Can you tell me if your method works for adherent cell cultures? Thanks, Katherine
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 26, 2012, 7:05 PM

    Also, I assume the antibodies have to recognize cell surface proteins. Will the method work for if the cells are permeabilized?
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 26, 2012, 7:07 PM

    Katherine,

    I have never tried complement depletion on adherent cells, but in theory it should work. The antibodies do need to recognize cell surface proteins in order for the complement attack complex to assemble on the cell surface. If the cells are permeabilized they will already be dead and thus the complement won't have any additional affect.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.November 27, 2012, 12:06 PM

    Thanks Bonnie. I figured that the antibodies have to recognize surface proteins but I have also heard of gentle permeabilization methods that don't affect cell viability.
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 27, 2012, 1:05 PM

    The attack complex assembles on the surface of the cells and forms a pore in the cell membrane that leads to cell lysis. This system would not work intracellularly.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.November 27, 2012, 1:17 PM

    Has anyone tried B-cell depletion using CD19 (mouse) clone 1D3 (IgG²a)? I can deplete both CD4 and CD8 T-cells just fine with this protocol using IgG²a antibodies but I'm having trouble with the B-cells. Any suggestions?
    Reply

    Posted by: Jesse V.May 2, 2013, 9:14 AM

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