JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

1

1BloodCenter of Wisconsin, Blood Research Institute

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Kendi arıtma genellikle gerekli bağışıklık hücre popülasyonlarının fonksiyonunu etkili bir şekilde incelenmesi. Kompleman tükenmesi, izolasyonu için yüksek saflıkta bağışıklık hücre popülasyonlarının hızlı ve ucuz bir tekniktir.

    Date Published: 2/05/2010, Issue 36; doi: 10.3791/1487

    Cite this Article

    Dittel, B. N. Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion. J. Vis. Exp. (36), e1487, doi:10.3791/1487 (2010).

    Abstract

    Bağışıklık hücre popülasyonlarının arıtma genellikle kendilerine özgü işlevleri araştırmak için gereklidir. , Yüksek saflıkta hücre popülasyonlarının izolasyonu, özellikle real-time PCR ve mikroarray analizi gibi moleküler yaklaşımlar gerektirir. Yaygın olarak kullanılan arıtma stratejileri floresan aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), manyetik boncuk ayırma ve tamamlayacak tükenmesi içerir. Üç strateji, kompleman tükenmesi, hızlı, ucuz, hücreler ve yüksek bir hücre verimi nazik olmanın avantajları sunmaktadır. Kompleman sistemini aktive edildiğinde, hücre ölümü ile sonuçlanan hücre yüzeyinde gözenek oluşturan bir zar-saldırı kompleksinin oluşumu sonuçlanan bir proteolitik kaskad başlatmak plazma proteinlerine çok sayıda oluşur.

    Protocol

    A. Tavşan Kompleman

    1. Stok tavşan tamamlayıcı oda sıcaklığında çözülmüş ve daha sonra 0.5 ve / veya 1 ml hacimleri içine aliquoted ve uzun süreli depolama için -20-80 ° C arasında dondurulup olmalıdır.
    2. Kompleman Her şey optimal çalışma konsantrasyonunu belirlemek için titre edilmelidir. Tipik olarak, bir seyreltme 1:10-01:20 en uygunudur.
    3. Tavşan tamamlayıcı hücrelerin nihai kullanımına ilişkin bağlı olarak her zaman, önce satışa presterilized değil, tamamlayıcı aliquoted zaman sterilize filtrelenmiş ve hücrelerin yanı sıra önce dondurulmuş ya da olmalıdır.

    B. Antikor Seçimi

    1. Tüm antikorlar böylece antikorlar ilk etkinliği test edilmelidir, kompleman aktivasyon etkili.
    2. Fare ve sıçan mAb de kompleman aktivasyon etkilidir.
    3. IgM antikorlar genellikle IgG takip kompleman kaynaklı hücre parçalama kullanmak için en verimli. Kompleman aktivasyonu için en iyi IgG isotypes türler arasında değişir.
    4. Her antikor, 10 7 hücre / ml bir hücre yoğunluğu optimal kullanımı için titre edilmelidir .

    C. Temel Protokolü

    1. 5 başlangıç ​​hücre popülasyonu ayarlayın orta içeren ısı inaktive FCS x 10 7 hücre / ml. Hücrelerin son hacmi iki kez başlangıç ​​hacmi olacak. Tükenmesi sayısal böylece bazı hücreler kaydetmeyi unutmayın.
    2. Her antikor hücre süspansiyonu uygun önceden belirlenmiş bir konsantrasyon veya seyreltme eklenmelidir. Hücreleri de tersine çevirerek karıştırın.
    3. Gerekli tamamlayıcı miktarını hesaplayın. Oda sıcaklığında tamamlayıcı stok çözülme. Kompleman steril değilse, düşük protein bağlama şırınga ucu filtre kullanılarak sterilize edin. Şırıngaya kompleman ek olarak önce orta birkaç ml ekleyin ve hücreleri ve antikor içeren tüp içine doğrudan filtre.
    4. Tüpünde son hacim hücreleri 1 x 10 7 hücre / ml olacak şekilde ayarlayın.
    5. Karıştırma, her 15 dakikada bir, bir saat süreyle 37 ° C'de hücreleri inkübe edin.
    6. Hücrelerin Santrifüj ve supernatant atın.
    7. Orta iki kez yıkayın. Hücre enkaz polistiren tüplerin yan sopa. Ölü hücreleri ve enkaz hücre süzgeç veya yoğunluk gradiyenti santrifüj kullanılarak ortadan kaldırılabilir.
    8. Hücre saflık tükenmesi öncesi ve sonrasında faiz hücre popülasyonu karşılaştırarak kontrol edin. Flow sitometri ve immünohistokimya hücre saflık belirlenmesinde iki yöntem vardır.

    Temsilcisi Sonuçlar

    Sonra bir tur sonra tamamlayıcı, hücre tükenmesi aktive yüksek verimli bir mAb kullanırken% 95 daha fazladır. Bu, Şekil 1'de flow sitometri ile TCRβ ifade (eBioscience, San Diego, CA) tarafından tespit edilen% 32.2 αβ T hücreleri oluşur fare dalak ile başlayan gösterilmiştir. Biz T hücreleri kullanarak mAb Thy1 özel, tüm T hücreleri tarafından ifade edilen bir protein, ancak diğer lökosit tükenmiş. Kullanılan antikor Y-19 IgG2c 2 sıçan. Açıklanan prosedürü izleyerek, TCRβ nüfusun% 1.56,% 95 daha fazla azalma azaldı.

    Şekil 1
    Şekil 1. Thy1, tükenmesi + kompleman aktivasyonu ile dalak T hücreleri Toplam fare dalak, dalak ve eritrosit lizis homojenizasyon elde edildi . Anti-thy1 ve önceden belirlenmiş konsantrasyonlarda bebek tavşan tamamlayıcı son hücre konsantrasyonu 1 x 10 7 hücre / ml olduğu gibi dalak tek bir hücre süspansiyonu eklendi. 37 az 1 saat inkübasyondan sonra ° C, hücreler iki kez yıkanır ve hücre canlılığı tripan mavi dışlama tarafından değerlendirilir. Tükenmesi verimliliği tükenmesi önce (sol panel) ve tükenmesi (sağ panel) sonra TCRβ + hücrelerin yüzdesi karşılaştırarak flow sitometri ile değerlendirildi. Yatay çubuk pozitif boyanma gösterir ve bar yukarıdaki sayı pozitif bir yüzde.

    Discussion

    Hücre popülasyonlarının arıtma işlevlerin çalışması için gerekli olan ortak bir işlemdir. Burada antijen-spesifik antikorlar ve kompleman tükenmesi kullanarak hücre popülasyonlarının tüketen bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. Kompleman aktive antikor soyundan bir marker varsa, herhangi bir hücre popülasyonunun tükenmesine elde edilebilir. Burada Thy1 için mAb spesifik T hücrelerinin tükenmesi gösterdi, protein, aslında tüm T hücre popülasyonlarının dile getirdi. Biz,% 95 αβ T hücreleri üzerinde tükenmiş ve geri kalan splenositlerin% 68% 98 artmıştır. Bu düzeyde hücre saflık FACS ve manyetik boncuk ayrılması da dahil olmak üzere diğer arıtma stratejilerine benzer. Kompleman tükenmesi başlangıç ​​hücre popülasyonu elde bir kez 1.5 saat yapılabilir hızlı bir tekniktir. Tamamlayıcı tükenmesi diğer bir avantajı, pahalı ekipman ve reaktifler gerektirmez, çünkü herhangi bir laboratuvar tekniği gerçekleştirebilirsiniz. Gerekli ekipman sadece büyük parçalarını, bir su banyosu ve bir santrifüj. Tavşan tamamlayıcı makul bir maliyetle çeşitli satıcılardan satın alınabilir (reaktiflerin tabloya bakınız) ve birçok mAb ATTC alınan ve maliyetleri kontrol etmek için yörede yetiştirilen olabilir. Buna karşılık, FACS altı rakamlar ve pahalı floresan etiketli mAb mal olacak hücre sıralama kapasitesine sahip bir akış sitometresinin gerektirir. Manyetik boncuk ayrılması orta fiyatlı, ama pahalıya mal olabilir bir mıknatıs ve manyetik boncuk, satın gerektirir. Buna ek olarak, bazı manyetik boncuk ayırma stratejileri de sütun satın alınmasını gerektirebilir.

    Ana engel hücre tükenmesi için tamamlayıcı kullanımı için gerekli olan antijen özgüllüğü mAb aktive kompleman durumu. Insan, fare ve sıçan antikorlar tüm düzeltmek için tamamlayıcı kapasitesi olmasına rağmen, bazı isotypes diğerlerinden daha iyidir. Her üç türün IgM tamamlayıcı tespit son derece etkili olmasına rağmen IgG isotypes değişir. Böylece her mAb ilk etkinliğini belirlemek için bir pilot çalışmada test edilmelidir. Yüksek verimli değildir antikorlar için, iki tur tamamlayıcı tükenmesi kalan hücre popülasyonlarının canlılığı etkilemeden yapılabilir. Maliyet tasarrufu gibi, antikorlar optimal etkinliği için titre edilmelidir. Buna ek olarak, kullanılan antikorların arıtılmış olması gerekmez. Arındırmak için zor IgM antikorlar, özellikle uygun olduğu gibi etkin bir şekilde Hibridoma süpernatantlar ve asit sıvısı iş. Antikorlar gibi, tamamlayıcı bir pilot çalışmada titre şarttır. Konsantrasyonu çok yüksek hedefli olmayan hücre popülasyonlarının canlılığı kaybına neden olacaktır. Ayrıca önemli inkübasyon süresi 60 dakikayı aşmayacak şekilde.

    Protokolde, antikor ve kompleman birlikte co-kuluçkaya yatmaktadır. Bununla birlikte, hücrelerin antikor ile 15-30 dakika etiketli ve kompleman eklenmeden önce yıkanmış olabilir. Bu stratejiyi kullanarak, yama ve kapaklama veya reseptör içselleştirilmesi, bazı proteinler oluşur, hücre yüzeyinde hücre antijen kaybını önlemek için buz üzerinde antikor inkubasyon gerçekleştirmek için emin olun. Yüksek verimli olmasına rağmen, diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında tükenmesi tamamlamak için büyük dezavantajı olumlu seçimi için kullanılan olamaz. Böylece hücre alt popülasyonlar elde etmek zordur. Örneğin, en iyi FACS tarafından yapılabilir foliküler B hücreleri, marjinal zon B hücreleri arındırmak için zor olurdu. Bu durumda, kompleman aktivasyonu sıralanmış olan hücrelerin sayısını azaltmak için T hücreleri tüketmek için kullanılabilir. Bu strateji, tasarruf hangi sıralama zamanı azaltmak ve hücrelerin daha az sert olurdu.

    Özel hücre popülasyonlarının arıtma ortak bir gereklilik olduğu için bir dizi strateji geliştirilmiştir olmuştur. Tamamlayıcı tükenmesi stratejinin ana avantajları ekonomiklik, teknik kolaylık ve zaman tasarrufu.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Sreemanti Basu Şekil 1 için veri sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe AI069358 ve BloodCenter Araştırma Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    3-4 week baby rabbit complement Pel-Freez Biologicals 31061-3
    Water bath Various various An incubator set at 37 °C can also be used.

    References

    1. Janeway, C., Travers, P. Immunobiology : The Immune System in Health and Disease. London; San Francisco; New York: Current Biology Limited; Garland Pub. Inc (1994).
    2. Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens. II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol 12, 30-37 (1982).

    Comments

    11 Comments

    Hello!
    Thank you for this experimental video. I have a question about rabbit complement. Whether only 3-4 week baby rabbit complement could be applied in this experiment. How about RABBIT COMPLEMENT (31060-1)?
    Thank You!!
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 25, 2011, 4:45 AM

    I have always used the newborn complement. However, I am sure that the rabbit complement would work. If you try it and it works well, please make a posting letting everyone know.

    Thanks
    Reply

    Posted by: Bonnie D.April 27, 2011, 12:02 PM

    Hi, do you think rat, human or mouse complement dŒs the same job as rabbit complement?
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 11, 2012, 2:43 AM

    I don't have any experience using rat, human or mouse complement to deplete cells. I know that guinea pig complement also works. You would need a lot of plasma if you were going to used rat or mouse.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.January 11, 2012, 10:03 AM

    Ok, I was thinking of using rat, mouse or human complement as I have frozen aliquots of them. I guess I will give it a try. If anyone has prior experience in using them, please let me know! Thanks!
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 11, 2012, 8:08 PM

    Dear Bonnie, Can you tell me if your method works for adherent cell cultures? Thanks, Katherine
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 26, 2012, 7:05 PM

    Also, I assume the antibodies have to recognize cell surface proteins. Will the method work for if the cells are permeabilized?
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 26, 2012, 7:07 PM

    Katherine,

    I have never tried complement depletion on adherent cells, but in theory it should work. The antibodies do need to recognize cell surface proteins in order for the complement attack complex to assemble on the cell surface. If the cells are permeabilized they will already be dead and thus the complement won't have any additional affect.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.November 27, 2012, 12:06 PM

    Thanks Bonnie. I figured that the antibodies have to recognize surface proteins but I have also heard of gentle permeabilization methods that don't affect cell viability.
    Reply

    Posted by: Katherine L.November 27, 2012, 1:05 PM

    The attack complex assembles on the surface of the cells and forms a pore in the cell membrane that leads to cell lysis. This system would not work intracellularly.
    Reply

    Posted by: Bonnie D.November 27, 2012, 1:17 PM

    Has anyone tried B-cell depletion using CD19 (mouse) clone 1D3 (IgG²a)? I can deplete both CD4 and CD8 T-cells just fine with this protocol using IgG²a antibodies but I'm having trouble with the B-cells. Any suggestions?
    Reply

    Posted by: Jesse V.May 2, 2013, 9:14 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter