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 JoVE Biology

Capturez extension d'amorce: Retrieval séquence ciblée à partir de sources d'ADN fortement dégradées

1, 1, 1, 1, 1, 1, 1

1Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Nous présentons une méthode d'extraction ciblée de séquences d'ADN ancien, qui nous permettent de reconstituer le génome mitochondrial complet de cinq individus néandertaliens. La comparaison de ces séquences avec les humains d'aujourd'hui suggère que les Néandertaliens avaient une longue durée à faible taille de la population effective.

    Date Published: 9/03/2009, Issue 31; doi: 10.3791/1573

    Cite this Article

    Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., et al. Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources. J. Vis. Exp. (31), e1573, doi:10.3791/1573 (2009).

    Abstract

    Nous présentons une méthode de récupération séquence d'ADN cible à partir de sources d'ADN qui sont fortement dégradées et contaminées avec de l'ADN microbien, ce qui est typique des ossements anciens. La méthode réduit considérablement la destruction de l'échantillon et les exigences relatives à séquençage PCR directe ou approches de séquençage shotgun. Nous avons utilisé cette méthode pour reconstruire la complète ADN mitochondrial (ADNmt) des génomes de cinq Néandertaliens de partout leur aire géographique. L'ADNmt de la diversité génétique des Néandertaliens du retard a été environ trois fois inférieur à celui des hommes modernes contemporains. Ensemble, avec les analyses de l'évolution des protéines ADNmt, ces données suggèrent que la taille de longue durée effective de la population des Néandertaliens était plus petit que celui des humains modernes et existantes des grands singes.

    Protocol

    Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans Briggs et al., Science 325 (5938). 318-321 (2009) .

    Réactifs nécessaires:

    • Polymérase AmpliTaq ADN d'or
    • 10x GeneAmp PCR Buffer II
    • MgCl 2 25 mM
    • mélange de dNTP, 25 mM de chaque
    • BSA, 10 mg ml-1 dans l'eau
    • Biologie moléculaire de qualité de l'eau
    • EB tampon (fourni avec le kit MinElute PCR Purification), 10 mM Tris HCl, pH 8,5
    • Kit MinElute PCR Purification
    • M-270 streptavidine Dynabeads
    • 2x reliure et de lavage (BW) tampon (2 M de NaCl, 10 mM Tris-Cl, EDTA 1 mM, pH 8,0, 0,2% Tween 20)
    • 1x reliure et de lavage (BW) tampon (2x BindWash tampon dilué dans de l'eau 2X)
    • Laver à chaud (HW) tampon (2,5 mM MgCl, 1X Taq Or tampon, 0,1% Tween 20)

    Pour plus d'informations concernant la non-fabricant de réactifs et du matériel standard de voir plus loin tableau.

    Bibliothèque d'amplification 1)

    1. La matrice d'ADN est ici une bibliothèque 454 prêts d'une source de copies d'ADN faible nombre tel que décrit dans (Rohland et Hofreiter, 2007a, 2007b) et (Maricic et Pääbo, 2009). Pour amplifier la bibliothèque entière, préparer le mélange de PCR suivant:
      Réactifs ul par la réaction
      Eau 45
      Gene Amp PCR 10X tampon II 10
      MgCl 2 (25mm) 10
      BSA (10 mg / ml) 2
      dNTP (25 mM chacun) 1
      454 emPCR fwd primer/10uM 3
      454 emPCR rvs primer/10uM 3
      L'ADN polymérase AmpliTaq Gold (5 U / pl) 1
      454 modèle de banque d'ADN 25
      Total des 100
    2. Utilisez le programme suivant PCR dans un cycleur thermique pour 14 d'amplification des cycles
      1. 95 ° C 12min
      2. 95 ° C 30s
      3. 60 ° C (température de recuit ou désiré) 1 min
      4. 72 ° C 1 min
      5. Aller à 2 (x 13)
      6. 72 ° C 5min
      7. 10 ° C ∞
    3. Purifier la réaction sur une colonne Qiagen MinElute conformément aux instructions du fabricant. Eluer dans 50 pi de tampon EB.
    4. Quantifier le produit purifié amplifiée ainsi que d'une partie aliquote de la bibliothèque non amplifié par qPCR (Meyer et al., 2007). Si le produit amplifié a plus de 1 X 10 12 copies par UL, réduire la quantité de modèle dans l'étape d'extension d'amorces suivantes pour s'assurer que pas plus de 2 X 10 12 copies sont ajoutés à la réaction extension d'amorce.

    Extension d'amorce 2)

    1. Préparer un master mix pour le nombre requis de réactions.
      Réactifs ul par la réaction
      Eau 45
      Gene Amp PCR 10X tampon II 10
      MgCl 2 (25mm) 10
      BSA (10 mg / ml) 2
      dNTP (25 mM chacun) 1
      454 emPCR fwd primer/10uM 3
      454 emPCR rvs primer/10uM 3
      L'ADN polymérase AmpliTaq Gold (5 U / pl) 1
      454 modèle de banque d'ADN 25
      Total des 100
    2. Exécutez le programme suivant dans un thermocycleur pour la réaction d'extension d'amorces unique:
      1. 95 ° C 12min
      2. 60 ° C (ou votre apprêt PEC recuit température si différente) 1 min
      3. 72 ° C 5 min
      4. 72 ° C pour toujours!

        ÉTAPE CRITIQUE Gardez réaction après l'extension à 72 ° C. Puis directement pipette 150ul PBI ou PB tampon pour QIAGEN MinElute de purification dans les tubes avant de retirer le bloc thermique. Ceci est important pour éviter la non-amorce spécifique de recuit et de capturer que le mélange refroidit.
    3. Purifier la réaction sur une colonne Qiagen MinElute, conformément aux instructions du fabricant. Eluer dans 50 EB ul.

    3) la capture de produits d'extension

    1. Solution stock Resuspendre de M-270 billes par vortex. Sortez 25 ul de suspension de billes par échantillon. Laver les billes à deux reprises avec 500ul de tampon 2x BW et remettre en suspension dans 25 ul de tampon 2xBW par échantillon.
    2. Ajouter 25 ul éluat de l'étape de 2,3 à 25 pi de suspension de billes étape 3.1. Mélangez puis faites pivoter pour 15 min à température ambiante.

      Recommandés: conserver restante de 5 ul de l'éluat de l'étape 2.3 pour la quantification par qPCR.

    3. Transférer le mélange dans son ensemble à un nouveau tube de 1.5ml (cela permet de réduire l'entraînement des fragments de bibliothèque non-cible). Pellet le surnageant en utilisant le collecteur de particules magnétiques (MPC) et jeter le surnageant.
    4. Laver 5 fois avec 500 ul de tampon 1xBW (nombreux lavages aider à enlever le fond autant que possible). Après la dernière étape de lavage, centrifuger brièvement et éliminer les dernières traces de surnageant.
    5. Ajouter 500μl 1x chaud Laver (HW) tampon. Agiter pendant 2 min à 65 ° C (ou 5C-dessus de la Tm PEC amorce) sur un bloc thermique. Retirer le surnageant rapidement après cela, afin de minimiser le refroidissement. (Cette étape est d'enlever des fragments de fond reste associé à des amorces PEC, mais pas vraiment étendu sur le cours de l'étape d'extension). Enlevez les dernières traces de surnageant.
    6. Reprendre le culot de billes dans 30 ul de tampon EB. Transférer le mélange dans son ensemble à un nouveau tube de 1.5ml (cela permet de réduire l'entraînement des fragments de bibliothèque non-cible). Incuber à 95 ° C pendant 3 minutes dans un cycleur thermique pour l'élution. Placer dans les PPM et retirer le surnageant, en prenant soin de laisser les billes.

    4) Capture d'amplification produit

    1. Préparer un master mix PCR pour le nombre requis d'échantillons.
      Réactifs ul par la réaction
      Eau 45
      Gene Amp PCR 10X tampon II 10
      MgCl 2 (25mm) 10
      BSA (10 mg / ml) 2
      dNTP (25 mM chacun) 1
      454 emPCR fwd primer/10uM 3
      454 emPCR rvs primer/10uM 3
      L'ADN polymérase AmpliTaq Gold (5 U / pl) 1
      Produit de capture élué 25
      Total des 100
    2. Utilisez le programme suivant PCR dans un cycleur thermique pour 14 d'amplification des cycles:
      1. 95 ° C 12min
      2. 95 ° C 30s
      3. 60 ° C (température de recuit ou désiré) 1 min
      4. 72 ° C 1 min
      5. Aller à 2 (x 13)
      6. 72 ° C 5min
      7. 10 ° C ∞
    3. Purifier la réaction sur une colonne Qiagen MinElute tour de silice selon les instructions du fabricant. Eluer dans 50 ul de tampon EB. Le produit peut être désormais utilisé soit pour un second tour de la capture, à partir de l'étape 2.1, ou entrés directement dans le protocole d'émulsion 454 PCR, pour le séquençage.

    Les résultats représentatifs:

    Il est fortement recommandé lors du démarrage avec le protocole PEC à effectuer d'abord une réaction de capture où une petite quantité d'une «séquence cible de maîtrise de positif» (par exemple un ~ 100pb produit PCR - 1 picogramme est assez facilement) est mélangée avec la normale recommandée quantité de 454 amplifié modèle de bibliothèque (voir l'étape 2.1), et la capture est effectuée avec une seule amorce PEC conçu pour capturer le produit de contrôle positif. Si cette réaction de contrôle est effectué, à la fois avec qPCR contrôle positif spécifiques et 454 paires adaptateur amorce spécifique peut être utilisé pour quantifier le montant des «cibles de contrôle» par rapport au fond dans la réaction d'extension d'amorces purifiées (1,3), le produit d'extension d'amorces (2,3 ) et on élue produit de la capture billes (3,6). De cette façon, à la fois l'efficacité de la suppression du fond (la «spécificité») et l'efficacité de la récupération cible («sensibilité») dans votre conditions expérimentales peuvent être mesurées directement.

    Un succès PEC protocole a normalement les propriétés suivantes -

    Sensibilité (mesurée par le montant de la cible de maîtrise retenus par le protocole):
    Montant total de la cible de contrôle dans la capture des produits élués billes (3,6) = ~ 1-20% du montant total de la réaction d'extension d'amorces purifiées (2,3).

    Contexte (mesurée par 454 paire d'amorces emPCR):
    Montant total de l'expérience dans la capture des produits élués billes (3,6) <0,01% du montant total en réaction amorce d'extension purifiée (2,3).

    S'il ya moins de 1% de l'objectif restant dans le produit final, l'étape d'extension d'amorces peuvent avoir été infructueuse et devrait être étudiée.

    Si il ya beaucoup plus de 0,01% de l'arrière-plan restant dans le produit final, les étapes de lavage peuvent avoir été incorrectement effectuée et devrait être étudiée.

    Discussion

    La méthode PEC est simple, rapide, sensible et spécifique. C'est pourquoi nous les applications multiples auteurs envisagent en dehors d'ADN ancien, comme la capture des petits fragments d'ARN à partir d'une bibliothèque de l'ARN, l'interrogatoire de variation structurelle d'un échantillon groupé ou la capture de 16S (ou d'autres loci) la diversité d'un échantillon de métagénomique. Un point à mentionner est que la sensibilité de capture diminue en fonction du nombre de PEC des amorces dans une réaction augmente multiplexe capture. PEC n'est donc pas idéal pour la capture des régions capture de très grande taille (par exemple, une mégabase ou plus), mais est extrêmement bien adapté pour la capture des régions cibles petites ou même les positions du SNP de nombreuses personnes d'une manière rapide.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Nous tenons à remercier M. Meyer pour des conseils; l'Académie croate des Sciences et des Arts et l'Académie de Berlin-Brandebourg des sciences pour le soutien logistique et scientifique, et le Fonds d'innovation de la présidentielle la Société Max Planck pour le soutien financier. JMG a été soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de NSF International (OISE-0754461). Les séquences sont déposés à la base de données EBI nucléotides avec des numéros d'adhésion: Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33,25 FM865410, Mezmaiskaya une FM865411

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2 Applied Biosystems N8080241
    QIAGEN MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
    M-270 streptavidin beads Invitrogen 653.05
    Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
    DynaMag-2 magnetic particle separator Invitrogen 120.02D

    References

    1. Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science. 325, (5938), 318-321 (2009).
    2. Rohland, N., Hofreiter, M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques. 42, (3), 343-352 (2007).
    3. Rohland, N., Hofreiter, M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2, (7), 1756-1762 (2007).
    4. Maricic, T., Pääbo, S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands. Biotechniques. 46, (1), 51-57 (2009).
    5. Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res. 36, (1), e5-e5 (2007).

    Comments

    9 Comments

    thank you for sharing ! PEC ,it`s still confused in my mind ,can you explain it more commonly ?
    Reply

    Posted by: Qiu Q.March 28, 2010, 10:55 AM

    Do you have any recommendation in designing biotinylated primers?
    And, how many independent target biotin-primers could be pooled in a reaction?
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 15, 2010, 2:08 AM

    Primer optimal Tm = 60C (the target-specific part of the primer). Avoid similarity to repetitive DNA elements.

    Up to 150 primers can be used in a single reaction, more are not recommended although it has not been not extensively tested
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 15, 2010, 9:47 AM

    I read in the sup data from your original paper describing PEC that when designing primers you had also avoided complementarity to adaptors A and B. However it looks pretty much like these sequences are somewhat embargŒd by Roche. Of course, it is still possible to clone the adaptors but I guess you already did so (or managed getting the info from Roche?). Could you provide these seqs? Further, in your experience, are many primers discarded because of that kind of complementarity (guess that Roche designed the adaptors to only fit martian DNA:-)? Finally do you also check autocomplementarity of the spacer+specific primer sequences?
    Many thanks in advance!
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 6, 2010, 8:28 AM

    Hi
    We used the Roche 454-FLX adaptor sequences, which are published (e.g. Margulies et al, Nature ²005). The 454-Titanium adaptor sequences may be embargŒd, I don't know. If you really can't get the sequences you wish to use you can try it without the filtering step in primer design - not many primers get discarded in the process I used (maybe 1% of designs). Illumina sequences are known if you can use that platform.
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 6, 2010, 10:23 AM

    We haven't ever checked autocomplementarity of the primer and spacer sequence.
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 6, 2010, 10:25 AM

    Were your oligos biotinylated with simple biotin or biotin TEG? What purification method did you choose (DSL, HPLC...)?
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 6, 2010, 9:53 AM

    Many thanks in advance of course!
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 6, 2010, 9:57 AM

    I used simple biotin and HPLC purification for the oligos.
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 6, 2010, 10:04 AM

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