Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717, doi:10.3791/1717 (2010).

1. Un pesce zebra maschio sarà sezionato per primo, seguito da un pesce femmina. Prima di iniziare la dissezione, anestetizzare un pesce nello 0,2% Tricaine e poi l'eutanasia dalla incubazione in acqua ghiacciata per 15 minuti.
2. Iniziare con una leggera accarezzando il pesce secco su un tovagliolo di carta e posizionarlo su una stuoia dissezione. Esternamente, pesce zebra hanno un'unica dorsale, pinna caudale e anale e associato pinne pettorali e pelviche (Figura 1).
   
   
   
   Figura 1. Adulto pesci di sesso maschile con le pinne etichettati.
   
3. Pin il pesce al tappeto dissezione attraverso la parte carnosa della coda e la parte ventrale della cavità oculare.
4. Tagliare la pelle del ventre del pesce appena anteriormente alla pinna anale. Tagliare la pelle e il muscolo sottostante lungo il ventre dalla pinna anale per l'opercolo (il rivestimento duro sopra la branchia) (Figura 2, punto 1).
   
   
   
   Figura 2. Passi nella rimozione della pelle e la parete muscolare del corpo per esporre gli organi interni.
   
5. Quindi, rimuovere l'opercolo e la pinna pettorale, tra cui la cintura pettorale (la spessa, regione ossea alla base della pinna) (Figura 2, punto 2). Tagliare la pelle e l'inizio del muscolo sottostante dall'alto del ora esposti branchie posteriormente lungo il lato del pesce e poi giù per la pinna anale (Figura 2, punto 3).
6. Rimuovere con cura la pelle e muscolo sottostante dal lato del pesce. Molti degli organi interni sono ora visibili (Figura 3).
   
   
   
   Figura 3. Pesci adulti di sesso maschile con la parete del corpo e dei muscoli rimossi permettendo la visualizzazione degli organi interni.
   
7. I testicoli sono lunghe, bianche, organi accoppiati che sono attaccate alla parete dorsale del corpo. Rimuovere un testicolo e mettetelo in un piatto di PBS. Esaminare il testicolo di luce riflessa di visualizzare i tubuli seminiferi (Figura 4), che contengono le cisti con varie fasi di sviluppo di cellule germinali da spermatagonia a spermatidi (Leal et al., 2009).
   
   
   
   Figura 4. Dissezione di un testicolo. Le strutture bianche tondeggianti sono i tubuli seminiferi.
   
8. Quindi, rimuovere il sistema gastrointestinale dalla cavità del corpo del pesce. Il fegato può essere identificato per le grandi dimensioni, morfologia lobi, colore tannish, e la vascolarizzazione estesa. La colecisti, un verde traslucido sacco pieno di liquido, e la milza, che appare rosso vivo, si trovano all'interno del viscere.
9. Separare l'intestino dal resto degli organi e tratto fuori. L'anteriore, le regioni a metà, e posteriore dell'intestino sono definiti da l'altezza delle pieghe epiteliali (Wallace et al., 2005).
10. Posizionare un pezzo di intestino in PBS e osservare le pieghe epiteliali a luce trasmessa.
11. Successivamente, esaminare la vescica natatoria. La vescica natatoria è costituito da una camera posteriore, che è collegato all'esofago attraverso il dotto pneumatico, e una camera anteriore, che è collegata all'orecchio interno attraverso l'apparato weberiano (Finney et al., 2006).
12. Rimuovere e gettare la vescica natatoria. Sblocca il pesce e ri-pin che lato ventrale fino a sezionare il rene, che si trova lungo la parete del corpo dorsale. Il rene è una struttura trasparente rosa, associata con l'aorta dorsale e cellule pigmentate. Il rene è suddiviso in regioni della testa, corpo e coda (Figura 5). Sezionare un pezzo del rene e metterlo in PBS. Prendere in giro a parte il tessuto renale per rivelare i tubuli renali.
    
    
    
    Figura 5. Posizione testa, corpo, e rene coda lungo la parete dorsale del corpo.
    
13. Sezionare un pesce femmina. Come descritto in precedenza, l'eutanasia il pesce in acqua ghiacciata e pat asciugare prima di pinning al tappeto dissezione. Togliere la pelle dal lato del pesce come precedentemente dimostrato. L'ovaio è una struttura bilobata che è sospeso nella cavità del corpo da un mesovarium vascolarizzato.
14. Rimuovere un lobo delle ovaie, è posto in PBS, ed esaminarlo con luce trasmessa. Gli ovociti possono essere presi in giro a parte utilizzando aghi sottili e poi messo in scena (Figura 6, Selman et al., 1993). Stadio I ovociti sono circa 10 - 150 micron di dimensione e traslucido. Ovociti fase II sono circa 150 - 350 micron nel formato e definito dalla comparsa di granuli corticali. Ovociti stadio III sono 350-750 micron e sono opachi a causa dell'accumulo di tuorlo. Ovociti maturi stadio IV e V sono trasparenti e generalmente non si trovano nelle ovaie delle femmine che hanno recentemente accoppiato.
    
    
    
    Figura 6. Palco dal vivo I, II, III e ovociti osservati sotto undissezione microscopio a luce trasmessa.
    
15. Successivamente, sezionare il cuore dal pesce. Il cuore si trova posteriore e ventrale alla branchia. Iniziate tagliando fuori il cuore e tutto il tessuto circostante e mettendolo in PBS. Con attenzione sezionare via il tessuto che circonda il cuore, facendo attenzione a non danneggiare l'atrio delicato.
16. Mettere il cuore sezionato in soluzione di Ringer per osservare il battito cardiaco.
    Identificare l'atrio, ventricolo e bulbo arterioso (Figura 7, Hu et al., 2001).
    
    
    
    Figura 7. Dissected cuore adulto.
    
17. Completa la dissezione rimuovendo il cervello dal pesce. Inizia unpinning il pesce e la rimozione della testa con una lama di rasoio. Rimuovere il più possibile i tessuti molli dal lato ventrale del cranio con una pinza. Rimuovere gli occhi con le forbici piccola sorgente. Rompere il cranio e togliere l'osso dalla parte ventrale del cervello. Ora posto la testa in un piatto di PBS e togliere la pelle e le ossa del cranio dal lato dorsale del cervello.
18. Identificare i bulbi olfattivi, telencefalo, habenula, tetto ottico, cervelletto e midollo (Figura 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002).
    
    
    
    Figura 8. Dissected zebrafish cervello adulto. Vista dorsale, anteriore verso l'alto.
    

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla University of Animal Care Pennsylvania e del Comitato Istituzionale Usa.

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01 HD050901 di MCM e americana Cancer Society Postdoctoral Fellowship # PF-05-041-01-DDC al TG.

1. Finney, J.L., Robertson, G.N., McGee, C.A., Smith, F.M., Croll, R.P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
2. Hu, N., Yost, HJ., Clark, EB. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
3. Leal, M.C., Cardoso, E.R., Nóbrega, R.H., Batlouni, S.R., Bogerd, J., França, L.R., Schulz, R.W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-87 (2009).
4. Schilling, T.F. The morphology of larval and adult zebrafish. In Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series, 261). Eds. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Oxford University Press, (2002).
5. Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
6. Wallace, K.N., Akhter, S., Smith, E.M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
7. Wullimann, M.F., Rupp, B., and Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. Birkhäuser Verlag, (1996).

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