JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

1, 1, 1

1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine (UCI)

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.167.238.60, User IP: 54.167.238.60, User IP Hex: 916975164

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    זה פרוטוקול וידאו ממחישה את הבידוד של התרבות האנושית וריד הטבור בתאי האנדותל (HUVEC) מ חבל הטבור האדם. לאחר מבודד את התאים האלה יכול לשמש ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה כמו Assay אופטימליים הפיברין ביד ג'ל הוכיח גם על ידי המעבדה יוז.

    Date Published: 4/28/2007, Issue 3; doi: 10.3791/183

    Cite this Article

    Davis, J., Crampton, S. P., Hughes, C. C. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183, doi:10.3791/183 (2007).

    Abstract

    אנגיוגנזה היא תהליך מורכב רב שלבי, שבו בתגובה לגירויים angiogenic, כלי חדש נוצרות vasculature הקיים. צעדים אלה כוללים: ירידה של התפשטות קרום, מרתף והגירה (נביטה) של בתאי האנדותל (EC) לתוך המטריצה ​​תאיים, יישור של EC לתוך מיתרי, היווצרות לומן, השקה, ועל היווצרות קרום מרתף חדשה. רבים מבחני חוץ גופית פותחו כדי ללמוד את התהליך הזה, אבל רוב לחקות רק בשלבים מסוימים של אנגיוגנזה, ואת מורפולוגית כלי לעתים קרובות לא דומים כלי in vivo. כאן אנו מדגימים אופטימיזציה assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC ו fibroblasts. זה המודל משחזר את כל השלבים המוקדמים המפתח של אנגיוגנזה, ואת כלי חשוב להציג לומן פטנט אינטר מוקף EC מקוטב. כלי ניתן להבחין בקלות לעומת שלב ואת זמן לשגות מיקרוסקופ, והחלים בצורה הטהורה עבור יישומים במורד הזרם.

    Protocol

    נוהל

    1. הנח חוט על משטח נקי טיפה את הדם העודף. לבצע חתכים טריים על שני קצוות של חוט.
    2. הוספת 21 02/01 מחט G עם נדן את המחט הפלסטיק, לתוך הווריד. (וריד היא הפתיחה הגדולה ביותר; 2 הקטנים הם העורקים)
    3. הצמד את המחט במקום עם hemostat ולצרף את המזרק 20cc של הנקס אל המחט.
    4. דחוף את הנקס דרך הווריד עם לחץ מתון. איסוף הפסולת בתוך כוס עם אקונומיקה. (מחזיק את המחט בחוט ביד אחת בזמן דוחפים ימנע את המחט קופצים מתוך הווריד.) אם יש הרבה דם בווריד, לשטוף בפעם השנייה.
    5. הנח חוט על משטח לצבוט את הקצה השני של הווריד. מלאו מ"ל כמה הנקס כדי לבדוק דליפות לאורך חוט. למשוך את 5 מ"ל ונתק את מהדק התחתונה.
    6. נתק את מזרק 20cc. הסר את הבוכנה של המזרק 10cc. צרף מזרק 10cc אל המחט, לשפוך 10 מ"ל collagenase ולהחליף הבוכנה. Push collagenase לווריד עד שתראה את כמות first לצאת את הקצה הפתוח. Re-לצבוט את הקצה הפתוח ולמלא עם collagenase עד בינוני יש התנפחות של וריד. התנפחות תוצאות יותר מדי זיהום שריר חלק.
    7. עיסוי חוט בעדינות.
    8. כבל דגירה (עם מחט, מזרק hemostats ו המצורפת) ב DPBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    9. בעוד דוגרים, המשך צעדים 1-8 עם כבל 2 nd.
    10. לאחר דגירה, לקחת חוט מתוך כוס ובעוד מחזיק את כבל על צינור 50 מ"ל לחתוך את הקצה התחתון מעל מהדק. הקפד לגבות כל הצינור. לחצו על collagenase הנותרים באמצעות כבל, ולאחר מכן לצרף את המזרק 20cc ולדחוף הנקס דרך עם לחץ מתון.
    11. אם לא בתאי שריר חלק יש צורך, לזרוק את כבל בשלב זה. אחרת, מקום את כבל אותו לתוך שפופרת 50 מ"ל השני עם collagenase ~ דגירה 5 מ"ל ו - ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות.
    12. שמור את הצינור עד שכל כבלי נעשים.
    13. ספין צינורות ב 1200 סל"ד ~ 5 דקות.
    14. לשאוב supernatant (למעט מ"ל 1-2 ~). Resuspend גלולה ב 5mls PHEC + ו צלחת T25
    15. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 לילה.
    16. למחרת supernatant להסיר ולהחליף עם מדיה חדשה. אם יש RBCs רבים, לשטוף פעם עם M199, ולאחר מכן להוסיף + PHEC. המשך דוגרים כרגיל עד צלחת הוא ומחוברות (1-4 ימים). פיצול לתוך T75 gelatinized.
    17. לאחר T75 הוא ומחוברות, מפוצל לשלושה T75s. הקפאת שתי צנצנות לכל בקבוק.

    הערה: לתאי אנדותל (לא ממושכת) יש מראה המרוצף. בתאי האנדותל מופעלים לעתים (ארוך מחודד) מיד לאחר הבידוד, לאחר כמה עובר הם בדרך כלל לחזור למצב unactive.

    ניקוי

    1. בזהירות רבה, תשליך מחטים במיכל החדים.
    2. השלך מזרקים במיכל Biohazard גדול.
    3. מכניסים את כל רקמת לשקית Biohazard קטן. תיק הקפאת סגור ב -20 ° עד שריפה.
    4. משרים את כל המכשירים virucide דקות לפחות 10.
    5. הוסף מדיה הדגירה לבזבז כוס / אקונומיקה. בואו לשבת לפחות 10 דקות.
    6. בטל כריות ספסל לתוך פסולת Biohazard.
    7. תרסיס את ומחוצה של כוסות, גבי הספסל ואת אמבטיה עם מים מכסה vircide. בואו לשבת 10 דקות, ולאחר מכן לנגב.
    8. לשטוף כוסות וכלי עם מים חמים לתלות על מתלה לייבוש (למחוק את המכשירים כך שהם לא חלודה).
    9. השליכו פסולת חיטוי לכיור.
    10. חזור התקשורת בשימוש למקרר.
    11. השלך את הכפפות פסולת Biohazard.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.1% Collagenase 10ml per cord, warmed to 37°C
    Tissue culture flasks T75, one per cord.
    Hanks medium
    scissors sterile
    beaker sterile
    50 ml tubes

    Comments

    10 Comments

    may you tell me wath kind of collagenase do you use? thank you!
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 16, 2008, 5:47 AM

    hi   i have been using dispase to isolate cells. iam succeeding in getting the cells but they are not spreading properly . even after two days iam not able to see  the typical cobble stone appearance. can you help.  Rathna  
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 1, 2008, 11:25 AM

    hallo,can you tell me what's the  PHEC+ ?thank you !
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 15, 2008, 6:27 AM

    Hi, do you have any idea how many cells I can get from a 90% confluent flask (²5 or 75 qcm)? Many thanks in advance, Karin
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 26, 2009, 8:06 AM

    From my experience working with HUVEC, a confluent T²5 flask has about 400,000 to 600,000 million cells while a confluent T75 flask has approximately ²-4 millions cells. From this, you can probably roughly deduce how many cells are in a 90% confluent T²5/T75 flask. I hope this help.
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 8, 2009, 5:45 AM

    hi
    how to i prepare collagenase for HUVEC isolation
    Reply

    Posted by: swati s.October 22, 2009, 1:45 PM

    Hi,

    I was a synthetic organic chemist and am trying to conduct a bio-organic project. I will be very thankful if you would share some info with me about how to lysate the HUVECs.

    Ge
    Reply

    Posted by: Ge Z.January 11, 2010, 6:56 PM

    To answer Ge's question, our lab lysate the HUVEC by adding lysate buffer 1x either in DPBS or water.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 20, 2010, 2:54 PM

    hi,

    Very Intresting way, but I wonder how many passages they can be usefull?
    Is there any difference between commercially available ones and freshly isolated ones(these ones)?
    Thanks in advance:-)
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 3, 2012, 11:57 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter