Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC)

Процедура

1. Положите шнур на чистую площадку и промокните лишнюю кровь. Сделайте свежие порезы на обоих концах кабеля.
2. Вставьте 21 1 / 2 G иглу с иглы пластиковый чехол ON, в вену. (Вены является крупнейшим открытием; 2 небольших них артерий)
3. Зажим иглу в месте с кровоостанавливающего и приложите 20cc шприц Хэнкс на иглу.
4. Нажмите Хэнкс через вену с умеренным давлением. Сбор отходов в стакан с хлоркой. (Холдинг иглу и шнур с одной стороны, выдвигая помешает иглы выкатились из вены.) Если есть много крови в вене, мыть второй раз.
5. Положите шнур на площадку и зажим другой конец вены. Залейте несколько мл Хэнкс и проверить на наличие утечек вдоль шнура. Вывод 5 мл и отсоединить нижний зажим.
6. Отключите 20cc шприц. Удалите поршень из 10cc шприц. Прикрепить 10cc шприц иглой, заливают в 10 мл коллагеназы и заменить поршень. Нажмите коллагеназы в вену, пока не появится первая сумма выхода открытый конец. Re-зажим открытым концом и залейте коллагеназы, пока не будет умеренным вздутие вен. Слишком много растяжение приводит к загрязнению гладкие мышцы.
7. Массаж шнур мягко.
8. Инкубируйте мозга (с hemostats, игл и шприцев прилагается) в DPBS при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
9. Хотя инкубации, продолжают шаги 1-8 с ^2-го мозга.
10. После инкубации взять шнур из стакана и, удерживая шнур в течение 50 мл трубки вырезать конца выше нижнего зажима. Будьте уверены, чтобы собрать все, что в трубке. Нажмите оставшиеся коллагеназы через шнур, затем приложите 20cc шприц и нажмите Хэнкс через с умеренным давлением.
11. Если не гладкомышечных клеток необходимы, отказаться от мозга на этот раз. В противном случае, место же шнур во второй 50 мл трубки с ~ 5 мл коллагеназы и инкубировать при 37 ° С в течение 30-60 мин.
12. Держите трубку, пока все шнуры сделаны.
13. Спиновые труб при ~ 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин.
14. Аспирируйте супернатант (за исключением ~ 1-2 мл). Ресуспендируют пеллет в 5mls PHEC + и пластины в T25.
15. Инкубировать при 37 ° C с 5% CO ₂ за одну ночь.
16. На следующий день удалить супернатант и заменить свежей информации. Если Есть много эритроцитов, мыть один раз с M199, затем добавить PHEC +. Продолжить инкубации, как обычно, пока пластина сливной (1-4 дней). Разделить на желатинизированный T75.
17. После T75 является вырожденным, разделен на три T75s. Замораживание два флакона в колбу.

Примечание: эндотелиальных клеток (неактивированных) имеют вид булыжника. Эндотелиальных клетках иногда активирован (длинные и заостренные) сразу после изоляции, после нескольких проходов они обычно возвращаются в неактивное состояние.

Уборка

1. Очень осторожно, распоряжаться иглы в контейнере острых предметов.
2. Утилизация шприцев в большой контейнер для биологически опасных.
3. Положите все ткани в небольшой сумке биологической опасности. Закройте пакет и заморозить при -20 ° до сжигания.
4. Замочить всех инструментов в virucide по крайней мере 10 мин.
5. Добавить инкубации СМИ отходов / отбеливатель стакан. Дайте настояться в течение 10 мин.
6. Отменить скамейке прокладки в биологически опасных отходов.
7. Спрей вниз внутри и снаружи стаканы, настольный и крышка водяной бане с vircide. Дайте настояться 10 минут, затем протереть.
8. Промыть стаканы и приборы с теплой водой и повесить на стойку для сухой (пятно от инструментов, чтобы они не ржавеют).
9. Утилизация отходов дезактивации в раковину.
10. Возврат неиспользованных средств массовой информации в холодильник.
11. Утилизировать перчатки в биологически опасных отходов.