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 JoVE Biology

Electroeluting DNA-Fragmenten

1, 1, 1, 1

1Department of Genetics and Molecular Biology , Research and Advanced Studies Center of National Polytechnic Institute

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Dieses Verfahren ermöglicht die Aufreinigung von DNA-Fragmenten mit hoher Ausbeute.

    Date Published: 9/05/2010, Issue 43; doi: 10.3791/2136

    Cite this Article

    Zarzosa-Álvarez, A. L., Sandoval-Cabrera, A., Torres-Huerta, A. L., Ma. Bermudez-Cruz, R. Electroeluting DNA Fragments. J. Vis. Exp. (43), e2136, doi:10.3791/2136 (2010).

    Abstract

    Gereinigte DNA-Fragmente werden für verschiedene Zwecke in Molecular Biology eingesetzt und sie können durch mehrere Verfahren hergestellt werden. Die meisten von ihnen erfordern eine vorherige Elektrophorese der DNA-Fragmente, um die Band von Interesse zu trennen. Dann wird dieses Band aus einem Agarose oder Acrylamid Gel ausgeschnitten und gereinigt, indem Sie entweder: Bindung und Elution aus Glas oder Silica-Partikel, DEAE-Cellulose-Membranen, "crush und genießen Methode", Elektroelution oder sehr oft teuren kommerziellen Aufreinigungskits. So wird die Auswahl einer Methode hängt vor allem von dem, was im Labor zur Verfügung. Die Elektroelution Verfahren erlaubt es, sehr sauber DNA in einer Vielzahl von Anwendungen (Sequenzierung, Radiomarkierung, enzymatische Restriktion, enzymatische Modifikation, Klonen usw.) verwendet werden zu reinigen. Dieses Verfahren besteht in Platzierung DNA-Bande enthaltende Agarose oder Acrylamid Scheiben in Probenvertiefungen der electroeluter, dann Anlegen von Strom wird das DNA-Fragment auf die Agarose zu verlassen und damit in ein Kissen Salz gefangen werden, um später durch Ethanolfällung gewonnen werden.

    Protocol

    1. Um DNA-Fragmente von Interesse zu reinigenden wählen, sollten diese in Agarose aufgelöst werden oder Acrylamidgelen Gel mit Ethidiumbromid durch Elektrophorese mit 0,5 X TBE-Puffer (Tris-Borat, EDTA) bei 120 Volt für 1 Stunde gefärbt. Dafür ~ 700 ng Plasmid pProEx-GdMre11S (6000-bp), die zuvor mit NdeI und HindIII verdaut wurde ein 900-bp-Fragment (560 ng Plasmid und 84 ng des Fragments) freizugeben.
    2. Die electroeluter Tank (Abbildung 1) sollte mit 0,5 X TBE gleichermaßen in jeder Seite der Mitte Plateau verteilt ausgefüllt werden betreut nicht verschütten es auf die Mitte der Hochebene.
    3. Die ausgewählten Bands (oder Bands) aus dem Gel ausgeschnitten, und in Probenkammer so nah wie möglich an den V-Kanal (eine Scheibe pro Well). Laufpuffer sollte jeder Kammer hinzugefügt werden; gerade genug, um das Gel Scheibe abdecken.
    4. Jeder V-Kanal verwendet werden, müssen mit einer Pasteurpipette gespült werden, um jede Luftblase gebildet zu beseitigen.
    5. Dann wurden 100 ul von 10 M NH 4-Acetat (zur Visualisierung erleichtert eine kleine Menge von Bromphenolblau hinzugefügt wird, gerade genug, um es Farbe) werden sanft in die V-Kanal hinzugefügt.
    6. Der Deckel sollte sanft geschlossen werden keine Aufwirbelung des hohen Salz-Kissen zu verhindern.
    7. Elektroelution ist bei 100 Volt für 25 Minuten begonnen.
    8. Wenn electrolution abgeschlossen ist, werden 400 ul von V-Kanal entfernt, und in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 2 Volumina kaltem Ethanol und Glykogen (empfohlen DNA-Ausbeute zu erhöhen) bei 4 ° C für 1 Stunde oder über Nacht ausgefällt werden.
    9. Zentrifuge für 20 Minuten, entfernen Sie den Überstand und wäscht mit 70% Ethanol.
    10. Dry Rohr und Quantifizierung der DNA bei OD 260 nm.
    11. Die Erholung erhalten wurde, 75% (63 ng erholt Wenn 84 ng auf dem V-Kanal gelegt wurden).

    Abbildung 1
    Abbildung 1. Electroeluter Diagramm. Anod ein Kathode auf jeder Seite des Tanks, DNA im Gel geschnitten enthalten sind, angegeben (dargestellt als ein schwarzes Quadrat) wird in Richtung Kathode durch ihre negative Ladung zu migrieren. Dann wird es in das Salz Kissen (dargestellt als ein umgekehrtes schwarzes Dreieck) in der V-Kanal befindet sich gefangen zu sein.

    Discussion

    Die Dauer des Laufs wird in hohem Maße abhängig von der Größe der Fragmente, die normalerweise für Fragmente bis zu 20 kb 50 Minuten bis 1 Stunde ist genug, während für kleine Fragmente UV-Licht Überwachung alle 10 Minuten ist erforderlich, um das Fragment zu verhindern, um durch die go Salz Kissen und damit auf die anodische Pufferkammer abnehmender Erholung. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass, wenn Sie Ihr Netzteil, eingestellt auf 100 Volt, gibt es eine aktuelle mindestens von 10 MAMP. Die DNA-Bande kann durch Verwendung eines UV-Handlampe überwacht werden und erkennen, wenn diese verlässt das Gel in Scheiben schneiden. Das Polster Salz kann auch mit 3 M Na-Acetat werden.

    Dieses Verfahren ermöglicht die Aufreinigung von DNA oder RNA-Fragmente unterschiedlicher Größe mit einer guten Erholung (~ 80%) auf radioaktiv werden, verdaut durch Restriktionsenzyme, verarbeitet durch modifizierende Enzyme, etc.

    Disclosures

    Keine Interessenskonflikte erklärt.

    Acknowledgements

    Die Arbeit in Dr. Bermudez Labor wurde von CONACYT (Grant # 82622) gefördert. Wir danken Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez und Ximena Rodriguez-Torres für die Videoaufzeichnung der electroleution Verfahren.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NdeI New England Biolabs R0111L
    HindIII New England Biolabs R0104L
    NH4 acetate JT Baker 0596
    agarose Invitrogen 15510-027
    Biophotometer Eppendorf 6131 000 020
    Electr–luter IBI UEA CAT 46000

    References

    1. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 3 Volume Set (1989).

    Comments

    3 Comments

    What size can be the fragments to be electrŒluted? Is it e.g. posible to elute BAC fragmetns (100-²00 kb)?
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 28, 2011, 7:13 AM

    Dear Kai, I believe you can electrolute fragments of that length, for this you can try electroluting one hour a 100 volts and make sure by monitoring the fragment by UV lamp that the fragment has disappeared from the agarose gel.
    Reply

    Posted by: Rosa B.April 28, 2011, 7:45 PM

    Hi,
    I am trying to elute 10 Kb - 50 Kb fragments. Is it possible to elute with your technique?
    Also I cannot download your pdf file can you please send me to my adress, soumyaghosh@yahoo.com.
    I will be very much gratefull to you if you ccan kindly send me your detail postal adress and your telephone number.
    Thanks with regards,
    Soumya Ghosh
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 19, 2011, 7:07 AM

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