Electroeluting frammenti di DNA

Hi.Today vi mostreremo come viene eseguita l'elettrolubrificazione per purificare frammenti di DNA come i prodotti della digestione e della PCR. Per ulteriori scopi, come la clonazione e il sequenziamento, l'elettrolubrificazione può essere uno dei metodi di scelta. Sulla base della carica elettrica negativa del DNA, una barriera cellulare alta viene posizionata all'interno del campo elettrico, lasciando cadere i frammenti e impedendo la loro ulteriore migrazione.

Questo metodo consente la purificazione di un'ampia gamma di dimensioni di frammenti di DNA da diverse fonti con un'efficienza relativamente elevata fino all'80%Il suo basso costo. Rappresentano un altro vantaggio dell'elettroliuzione rispetto ad altri metodi di purificazione come colonne, kit di resina, tra gli altri. Il campione di DNA viene prima visualizzato mediante un'elettroforesi su gel Aris colorata con bromuro di tedio al fine di visualizzare e identificare il frammento desiderato da purificare, l'elettroforesi dovrebbe procedere.

I frammenti sottostanti sono ben separati, i sottodimensionati possono essere determinati con precisione. Dopo elettroforesi. Il frammento desiderato viene accuratamente asportato dal gel utilizzando una lama di rasoio nuova di zecca e avendo cura di girare la fetta di gel il più vicino possibile alla banda di interesse.

Questa procedura deve essere eseguita con un'adeguata protezione dai raggi UV e indossando guanti. Dopo aver riempito l'elettroliutaio con l'apposito tampone di combustione e aver avuto cura di versarlo sulla superficie del plateau centrale, la fetta di gel viene posizionata all'interno di una delle ruote il più vicino possibile al canale a V. Non dovrebbero esserci bolle all'interno del canale vch.

Questo può essere evitato lavando il canale con un tampone per rimuovere l'aria intrappolata. Quindi 100 microlitri di alta barriera salina vengono aggiunti con cura al canale V dal sito prossimale al pozzo. La camera è chiusa e gli elettrodi sono collegati alla fonte di alimentazione per iniziare l'elettroliutazione da 100 a 120 volt.

Il lasso di tempo dipenderà dalla dimensione del frammento per frammenti grandi fino a 20 kbs. Da 50 minuti a un'ora dovrebbero essere sufficienti e i frammenti piccoli dovrebbero essere monitorati ogni 10 minuti con luce UV per evitare ulteriori elioni attraverso la soluzione salina e nella catena tampone adulta finale. In questo caso, abbiamo digerito 560 nanogrammi di plasmide con gli enzimi ND one e entry per rilasciare una base di 900 per frammento, equivalente a 84 nanogrammi di campione.

Di conseguenza, dopo aver posizionato la fetta di gel all'interno del pozzetto, l'elettrolubrificazione procederà per 25 minuti a 100 volt. Una volta completata la soluzione elettrolitica e intrappolati i frammenti di DNA nel cuscino sud all'interno del canale V, vengono recuperati 400 microlitri di soluzione dal canale, dal lato distale del recipiente e posti in un microtubo da 1,5 microlitri utilizzando una punta fine attaccata a un micro pozzo, procedere alla precipitazione dell'alcol aggiungendo due volumi di etanolo assoluto freddo e miscelati a vortice. Inoltre, possono essere aggiunti due o tre microlitri di glicogeno per migliorare la resa delle provette classiche per il recupero del DNA A meno 20 gradi Celsius per un'ora o, in alternativa, conservare a questa temperatura la centrifuga notturna a quattro gradi Celsius alla massima velocità per 25 minuti.

Questo surnatante cardio e lavare aggiungendo un millilitro di freddo, centrifuga di etanolo al 70% a quattro gradi Celsius alla massima velocità per cinque a 10 minuti, scartare il surnatante e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente con le provette in posizione capovolta, grassi spesi in 10-15 microlitri di acqua libera dal nucleo e procedere a determinare la concentrazione del campione. In questo caso, il campione purificato è stato risospeso in 10 microlitri di acqua e quantificato in uno spettrofotometro a 260 nanometri di lunghezza d'onda che mostra una concentrazione di 6,3 nanogrammi per microlitro, che rappresenta un'efficienza del 75%. Potresti pensare che faresti meglio a investire solo 10 minuti del tuo tempo prezioso con un kit.

Tuttavia, nonostante il tempo impiegato in questo processo, sarete in grado di controllare molte delle variabili che vi permetteranno di purificare una gamma più ampia di campioni di dimensioni e fonti naturali. Come si può vedere nel caso in questione, è stata osservata un'efficienza del 75% uguale o migliore della maggior parte dei kit di purificazione del DNA. Grazie per essere qui con noi oggi.

Ci auguriamo che tu abbia trovato questo protocollo utile per i tuoi progetti di ricerca.