Name: Electroeluting frammenti di DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Impara l'elettroeluzione per purificare frammenti di DNA con alta efficienza fino all'80%. Questo metodo economico consente di recuperare campioni da diverse fonti per clonazione e sequenziamento.

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Lavoro in Dr. Bermudez laboratorio è stato finanziato dalla Conacyt (Grant # 82622). Ringraziamo Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez e Ximena Rodriguez-Torres per la registrazione video della procedura electroleution.

<ol><li> Al fine di selezionare frammenti di DNA di interesse da depurare, questi dovrebbero essere risolti in gel di agarosio o acrilamide gel colorati con bromuro di etidio tramite elettroforesi utilizzando tampone TBE 0.5X (Tris borato, EDTA) a 120 volt per 1 ora. Per questo, ~ 700 ng di plasmide pProEx-GdMre11S (6000-bp) precedentemente digerito con NdeI e HindIII è stato utilizzato per rilasciare un frammento di 900-bp (560 ng di plasmide e 84 ng di frammento). </li><li> Il serbatoio electroeluter (Figura 1) devono essere riempiti con TBE 0.5X equamente distribuiti in ogni parte del plateau metà avendo cura di non versare sul pianoro a metà. </li><li> La band selezionate (o bande) è tagliato fuori dal gel, e posto in camera di campione il più vicino possibile al canale V (una fetta per pozzetto). Tampone di corsa deve essere aggiunto ad ogni camera; appena sufficiente a coprire la fetta gel. </li><li> Ogni canale V utilizzati deve essere lavata con una pipetta Pasteur per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate. </li><li> Allora 100 ul di 10 M NH 4 acetato (per facilitare la visualizzazione una piccola quantità di blu di bromofenolo si aggiunge, quanto basta per colorarlo) sono gentilmente aggiunti all'interno del canale V. </li><li> Il coperchio deve essere chiuso delicatamente per evitare la risospensione del cuscino di sale. </li><li> Electroelution è iniziato a 100 volt per 25 minuti. </li><li> Quando electrolution è completato, 400 ul vengono rimossi dal V-canale, e messo in una provetta per microcentrifuga da precipitare con 2 volumi di etanolo freddo e glicogeno (consigliato per migliorare il recupero del DNA) a 4 ° C per 1 ora o durante la notte. </li><li> Centrifugare per 20 minuti, rimuovere il surnatante e lavare con etanolo al 70%. </li><li> Tubo secco e quantificare il DNA a OD 260 nm. </li><li> Il recupero ottenuto è stata del 75% (63 ng recuperato 84 ng quando sono stati immessi sul V-canale). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma Electroeluter. Anodizzato un catodo sono indicati su ogni lato del serbatoio, il DNA contenuto nel gel a fette (illustrato come un quadrato nero) migreranno verso il catodo a causa della sua carica negativa. Allora sarà intrappolato nel cuscino sale (rappresentato come un triangolo rovesciato) che si trova nel V-canale.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La durata della corsa dipenderà fortemente dalle dimensioni dei frammenti, normalmente per frammenti fino a 20 kb 50 minuti a 1 ora è sufficiente, mentre per i piccoli frammenti di luce UV monitoraggio ogni 10 minuti è necessaria per evitare il frammento di passare attraverso il cuscino di sale e di conseguenza alla camera di buffer di anodica diminuzione di recupero. E &#39;importante assicurarsi che quando si imposta l&#39;alimentazione a 100 volt, c&#39;è una corrente di almeno di 10 mAmp. La banda del DNA può essere monitorato tramite una lampada UV-mano e rilevare quando questa abbandona la fetta gel. Il sale cuscino può essere fatta anche con 3 M Na acetato. Questa procedura permette la purificazione di frammenti di DNA o RNA di diverse dimensioni con un buon recupero (~ 80%) da radiomarcato, digerito dagli enzimi di restrizione, trattati con enzimi che modificano, ecc

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>acetato di NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>agarosio</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>Electr&amp;#8211;luter</td><td>IBI</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

electroeluting frammenti di dna

Electroeluting DNA Fragments

Frammenti di DNA purificati vengono utilizzati per scopi differenti in Biologia Molecolare e possono essere preparati con procedure diverse. La maggior parte di essi richiedono una precedente elettroforesi dei frammenti di DNA al fine di separare la banda di interesse. Poi, questa band è escisse fuori da un gel di agarosio o acrilamide e purificate utilizzando: vincolanti e eluizione di particelle di vetro o di silice, DEAE-cellulosa membrane, &quot;cotta e immergere metodo&quot;, electroelution o molto spesso costosi kit di purificazione commerciale. Così, la selezione di un metodo dipende per lo più di ciò che è disponibile in laboratorio. La procedura electroelution permette di purificare il DNA molto pulito per essere utilizzato in un gran numero di applicazioni (sequenziamento, radiomarcatura, restrizione enzimatica, modificazione enzimatica, ecc clonazione). Questa procedura consiste nel mettere DNA banda contenenti fette di agarosio o acrilamide nei pozzetti campione del electroeluter, allora in corso l&#39;applicazione farà il frammento di DNA di lasciare l&#39;agarosio e quindi essere intrappolati in un sale cuscino da recuperare in seguito dalla precipitazione dell&#39;etanolo.

Questa procedura permette la purificazione di frammenti di DNA con alto rendimento.

Electroeluting frammenti di DNA

I frammenti di DNA purificato vengono utilizzati per diverse finalità in biologia molecolare e possono essere preparati attraverso diverse procedure. La maggior parte di esse richiede un...

Ciao. Oggi vi mostreremo come si esegue l'elettroeluzione per purificare frammenti di DNA, come prodotti di digestione e di PCR. Per scopi successivi come il clonaggio e il sequenziamento, l'elettroeluzione può essere uno dei metodi di elezione. Sfruttando la carica elettrica negativa del DNA, viene posizionata una barriera cellulare all'interno del campo elettrico, trattenendo i frammenti e impedendone l'ulteriore migrazione.Questo metodo consente la purificazione di un'ampia gamma di dimensioni di frammenti di DNA provenienti da diverse fonti, con un'efficienza relativamente elevata fino all'80%. Il suo basso costo rappresenta un ulteriore vantaggio della elettroeluzione rispetto ad altri metodi di purificazione, come colonne, kit a resina, tra gli altri. Il campione di DNA viene innanzitutto visualizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio colorato con bromuro di etidio, al fine di visualizzare e identificare il frammento desiderato da purificare; successivamente, deve proseguire l'elettroforesi.Quando i frammenti sono ben separati, è possibile determinare con precisione quelli di dimensioni inferiori. Dopo l'elettroforesi, il frammento desiderato viene accuratamente escisso dal gel utilizzando una lametta nuova di zecca e avendo cura di tagliare il pezzo di gel il più vicino possibile alla banda di interesse.Questa procedura deve essere eseguita con adeguata protezione dalla luce UV e indossando guanti. Dopo aver riempito l'elettrolizzatore con il tampone di corsa appropriato e aver cura di farlo fuoriuscire sulla superficie della piastra centrale, la fetta di gel viene posizionata all'interno di una delle ruote il più vicino possibile al canale a V. Non devono essere presenti bolle d'aria all'interno del canale a V.Questo può essere evitato lavando il canale con tampone per rimuovere qualsiasi aria intrappolata. Successivamente, 100 microlitri della barriera ad alto contenuto salino vengono aggiunti con attenzione al canale V a partire dal sito prossimale al pozzetto. La camera viene chiusa e gli elettrodi vengono collegati alla fonte di alimentazione per iniziare l'elettrolisi a 100-120 volt.L'intervallo di tempo dipenderà dalle dimensioni del frammento per frammenti di grandi dimensioni fino a 20 kbp. Dovrebbero essere sufficienti da 50 minuti a un'ora, mentre per frammenti piccoli è necessario effettuare un monitoraggio ogni 10 minuti con luce UV per evitare un'ulteriore eluizione attraverso la soluzione salina e nella catena del tampone finale. In questo caso, abbiamo digerito 560 nanogrammi di plasmide con gli enzimi ND uno ed entry per rilasciare un frammento di 900 basi, equivalente a 84 nanogrammi di campione.Di conseguenza, dopo aver posizionato il frammento di gel all'interno del pozzetto, l'elettroeluzione proseguirà per 25 minuti a 100 volt. Una volta completata l'elettroeluzione e i frammenti di DNA intrappolati nel cuscinetto sud all'interno del canale in V, si recuperano 400 microlitri di soluzione dal canale, dal lato distale del contenitore, e si trasferiscono in una microprovetta da 1,5 microlitri utilizzando una punta fine applicata a una micropipetta. Procedere quindi alla precipitazione alcolica aggiungendo due volumi di etanolo assoluto freddo e mescolando mediante vortex. Inoltre, è possibile aggiungere da due a tre microlitri di glicogeno per migliorare il rendimento del recupero del DNA. Lasciare in incubazione a –20 gradi Celsius per un'ora oppure, in alternativa, conservare a questa temperatura per tutta la notte. Centrifugare a 4 gradi Celsius alla velocità massima per 25 minuti.Questo soprannatante cardiaco e il lavaggio aggiungendo un millilitro di etanolo freddo al 70%. Centrifugare a quattro gradi Celsius alla velocità massima per cinque-dieci minuti, scartare il soprannatante e lasciare asciugare a temperatura ambiente con i tubi in posizione capovolta. Ricostituire il pellet in 10-15 microlitri di acqua priva di nucleasi ed eseguire la determinazione della concentrazione del campione. In questo caso, il campione purificato è stato risospeso in 10 microlitri di acqua e quantificato mediante spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 260 nanometri, mostrando una concentrazione di 6,3 nanogrammi per microlitro, corrispondente a un'efficienza del 75%. Potrebbe venire in mente che sarebbe meglio investire soltanto 10 minuti del proprio tempo prezioso utilizzando un kit.Tuttavia, nonostante il tempo richiesto da questo processo, sarà possibile controllare molte delle variabili che consentono di purificare un'ampia gamma di campioni di diverse dimensioni e origini. Come si è potuto osservare nel caso presente, è stata riscontrata un'efficienza del 75%, pari o superiore a quella della maggior parte dei kit per la purificazione del DNA. Grazie per aver partecipato alla nostra sessione odierna.Speriamo che questo protocollo si sia rivelato utile per i vostri progetti di ricerca.

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"E-DNA" sensori, reagentless, biosensori elettrochimici che ottengono buoni risultati anche quando sfidato direttamente nel sangue e altre matrici complesse, sono stati adattati per il rilevamento di una vasta gamma di acidi nucleici, proteine ​​e analiti di piccole molecole. Qui vi presentiamo una procedura generale per la fabbricazione e l'uso di sensori di questo tipo.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

Un protocollo di base per la separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio descritto.

Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

In questo video, analizziamo la distribuzione dimensionale dei frammenti di DNA libero da cellule o cfDNA utilizzando l'elettroforesi capillare automatizzata. Questa tecnica aiuta a ottenere informazioni sul profilo dei frammenti di DNA rilasciati dalle cellule tumorali durante l'apoptosi.

Analisi automatizzata della distribuzione dimensionale dei frammenti basata sull'elettroforesi capillare del cfDNA: un metodo basato su microchip di DNA per studiare la distribuzione dimensionale dei frammenti di DNA isolati dai biofluidi

Questo video descrive la tecnica di elettroforesi capillare microfluidica per separare gli ampliconi PCR in base alle loro dimensioni. Questa tecnica aiuta nel dimensionamento dei frammenti utilizzando coloranti fluorescenti e marcatori di dimensioni molecolari standard.

Elettroforesi capillare microfluidica per il dimensionamento dei frammenti dei prodotti PCR: una tecnica di separazione elettroforetica basata su microchip per separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni

Vi presentiamo un biochip elettrochimico basato microfluidica-per la rilevazione ibridazione DNA. A seguito di ssDNA sonda funzionalizzazione, la specificità, sensibilità, e il limite di rilevazione sono studiati con obiettivi ssDNA complementari e non complementari. I risultati illustrano l'influenza degli eventi di ibridazione DNA sul sistema elettrochimico, con un limite di rilevazione di 3,8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta potenziata è un metodo per la preparazione di librerie di sequenziamento per l'analisi della metilazione del DNA basata sulla digestione dell'enzima di restrizione combinata con la conversione del bisolfito di citosina. Questo protocollo richiede 50 ng di materiale di partenza e produce dati di risoluzione delle coppie di basi in regioni genomiche ricche di GC.

ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

Gli esperimenti tradizionali di elettroforesi a gel di lastre (SGE) richiedono un apparato complicato e un elevato consumo di sostanze chimiche. Questo lavoro presenta un protocollo che descrive un metodo a basso costo per separare i frammenti di DNA entro un breve lasso di tempo.

Monitoraggio in tempo reale della separazione del frammento di DNA tramite smartphone

Un protocollo per la selezione in vitro e caratterizzazione di aptameri di DNA specifico del gruppo acido ftalico estere-associazione è presentato. È inclusa anche l'applicazione dell'aptamero selezionato in un aptasensor elettrochimico.

Acido ftalico Ester-associazione DNA aptamero selezione, caratterizzazione e applicazione di un Aptasensor elettrochimica

Qui, presentiamo una semplice tecnica per valutare la resistenza antimicrobica ambientale (AMR) aumentando la proporzione di DNA extracellulare a basso peso molecolare. Il trattamento precedente con PEG al 20%-30% e NaCl 1,2 M consente di rilevare sia i geni genomici che quelli AMR trasferiti orizzontalmente. Il protocollo si presta a un processo senza kit con un'ulteriore ottimizzazione.

Estrazione avanzata di DNA a basso peso molecolare dalle acque reflue per una valutazione completa della resistenza agli antimicrobici 

Impara l'elettroeluzione per purificare frammenti di DNA con alta efficienza fino all'80%. Questo metodo economico consente di recuperare campioni da diverse fonti per clonazione e sequenziamento.

Electroeluting frammenti di DNA

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