Name: Electroeluting DNA-Fragmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Lernen Sie die Elektroelution von DNA-Fragmenten für die molekularbiologische Forschung. Diese Methode erreicht bis zu 80 % Effizienz und ermöglicht die kostengünstige Reinigung verschiedener DNA-Größen aus unterschiedlichen Quellen.

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Die Arbeit in Dr. Bermudez Labor wurde von CONACYT (Grant # 82622) gefördert. Wir danken Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez und Ximena Rodriguez-Torres für die Videoaufzeichnung der electroleution Verfahren.

<ol><li> Um DNA-Fragmente von Interesse zu reinigenden wählen, sollten diese in Agarose aufgelöst werden oder Acrylamidgelen Gel mit Ethidiumbromid durch Elektrophorese mit 0,5 X TBE-Puffer (Tris-Borat, EDTA) bei 120 Volt für 1 Stunde gefärbt. Dafür ~ 700 ng Plasmid pProEx-GdMre11S (6000-bp), die zuvor mit NdeI und HindIII verdaut wurde ein 900-bp-Fragment (560 ng Plasmid und 84 ng des Fragments) freizugeben. </li><li> Die electroeluter Tank (Abbildung 1) sollte mit 0,5 X TBE gleichermaßen in jeder Seite der Mitte Plateau verteilt ausgefüllt werden betreut nicht verschütten es auf die Mitte der Hochebene. </li><li> Die ausgewählten Bands (oder Bands) aus dem Gel ausgeschnitten, und in Probenkammer so nah wie möglich an den V-Kanal (eine Scheibe pro Well). Laufpuffer sollte jeder Kammer hinzugefügt werden; gerade genug, um das Gel Scheibe abdecken. </li><li> Jeder V-Kanal verwendet werden, müssen mit einer Pasteurpipette gespült werden, um jede Luftblase gebildet zu beseitigen. </li><li> Dann wurden 100 ul von 10 M NH 4-Acetat (zur Visualisierung erleichtert eine kleine Menge von Bromphenolblau hinzugefügt wird, gerade genug, um es Farbe) werden sanft in die V-Kanal hinzugefügt. </li><li> Der Deckel sollte sanft geschlossen werden keine Aufwirbelung des hohen Salz-Kissen zu verhindern. </li><li> Elektroelution ist bei 100 Volt für 25 Minuten begonnen. </li><li> Wenn electrolution abgeschlossen ist, werden 400 ul von V-Kanal entfernt, und in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 2 Volumina kaltem Ethanol und Glykogen (empfohlen DNA-Ausbeute zu erhöhen) bei 4 ° C für 1 Stunde oder über Nacht ausgefällt werden. </li><li> Zentrifuge für 20 Minuten, entfernen Sie den Überstand und wäscht mit 70% Ethanol. </li><li> Dry Rohr und Quantifizierung der DNA bei OD 260 nm. </li><li> Die Erholung erhalten wurde, 75% (63 ng erholt Wenn 84 ng auf dem V-Kanal gelegt wurden). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Electroeluter Diagramm. Anod ein Kathode auf jeder Seite des Tanks, DNA im Gel geschnitten enthalten sind, angegeben (dargestellt als ein schwarzes Quadrat) wird in Richtung Kathode durch ihre negative Ladung zu migrieren. Dann wird es in das Salz Kissen (dargestellt als ein umgekehrtes schwarzes Dreieck) in der V-Kanal befindet sich gefangen zu sein.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

Die Dauer des Laufs wird in hohem Maße abhängig von der Größe der Fragmente, die normalerweise für Fragmente bis zu 20 kb 50 Minuten bis 1 Stunde ist genug, während für kleine Fragmente UV-Licht Überwachung alle 10 Minuten ist erforderlich, um das Fragment zu verhindern, um durch die go Salz Kissen und damit auf die anodische Pufferkammer abnehmender Erholung. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass, wenn Sie Ihr Netzteil, eingestellt auf 100 Volt, gibt es eine aktuelle mindestens von 10 MAMP. Die DNA-Bande kann durch Verwendung eines UV-Handlampe überwacht werden und erkennen, wenn diese verlässt das Gel in Scheiben schneiden. Das Polster Salz kann auch mit 3 M Na-Acetat werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Aufreinigung von DNA oder RNA-Fragmente unterschiedlicher Größe mit einer guten Erholung (~ 80%) auf radioaktiv werden, verdaut durch Restriktionsenzyme, verarbeitet durch modifizierende Enzyme, etc.

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; acetate</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>Electr&amp;#8211;luter</td><td>IBI</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

electroeluting dna-fragmenten

Electroeluting DNA Fragments

Gereinigte DNA-Fragmente werden für verschiedene Zwecke in Molecular Biology eingesetzt und sie können durch mehrere Verfahren hergestellt werden. Die meisten von ihnen erfordern eine vorherige Elektrophorese der DNA-Fragmente, um die Band von Interesse zu trennen. Dann wird dieses Band aus einem Agarose oder Acrylamid Gel ausgeschnitten und gereinigt, indem Sie entweder: Bindung und Elution aus Glas oder Silica-Partikel, DEAE-Cellulose-Membranen, &quot;crush und genießen Methode&quot;, Elektroelution oder sehr oft teuren kommerziellen Aufreinigungskits. So wird die Auswahl einer Methode hängt vor allem von dem, was im Labor zur Verfügung. Die Elektroelution Verfahren erlaubt es, sehr sauber DNA in einer Vielzahl von Anwendungen (Sequenzierung, Radiomarkierung, enzymatische Restriktion, enzymatische Modifikation, Klonen usw.) verwendet werden zu reinigen. Dieses Verfahren besteht in Platzierung DNA-Bande enthaltende Agarose oder Acrylamid Scheiben in Probenvertiefungen der electroeluter, dann Anlegen von Strom wird das DNA-Fragment auf die Agarose zu verlassen und damit in ein Kissen Salz gefangen werden, um später durch Ethanolfällung gewonnen werden.

Dieses Verfahren ermöglicht die Aufreinigung von DNA-Fragmenten mit hoher Ausbeute.

Electroeluting DNA-Fragmenten

Gereinigte DNA-Fragmente werden in der Molekularbiologie für verschiedene Zwecke verwendet und können durch verschiedene Verfahren vorbereitet werden. Die meisten davon erfordern ein ...

Hallo. Heute zeigen wir Ihnen, wie die Elektroelution durchgeführt wird, um DNA-Fragmente wie Verdauungs- und PCR-Produkte zu reinigen. Für weitere Anwendungen wie das Klonen und Sequenzieren kann die Elektroelution eine Methode der Wahl sein. Aufgrund der negativen elektrischen Ladung der DNA wird eine hohe Zellbarriere im elektrischen Feld platziert, wodurch die Fragmente abgefangen und ihre weitere Migration verhindert wird.Diese Methode ermöglicht die Aufreinigung einer breiten Palette von DNA-Fragmentgrößen aus verschiedenen Quellen mit einer relativ hohen Effizienz von bis zu 80 %. Ihre geringen Kosten stellen einen weiteren Vorteil der Elektroelution im Vergleich zu anderen Aufreinigungsmethoden wie Säulen, Harz-Kit-Systemen und anderen dar. Die DNA-Probe wird zunächst mittels Bromid-gefärbter Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht, um das gewünschte Fragment zur Aufreinigung zu visualisieren und zu identifizieren; anschließend sollte die Elektrophorese fortgesetzt werden.Wenn die Fragmente gut getrennt sind, können zu kleine Fragmente genau bestimmt werden. Nach der Elektrophorese wird das gewünschte Fragment sauber aus dem Gel geschnitten, wobei ein nagelneues Rasierklingenblatt verwendet wird und darauf geachtet wird, das Gelschnitz so nah wie möglich an dem Band von Interesse abzuschneiden.Dieses Verfahren sollte unter angemessenem Schutz vor UV-Licht und mit Handschuhen durchgeführt werden. Nachdem die Elektrolutte mit dem geeigneten Brennpuffer gefüllt wurde und darauf geachtet wurde, dass dieser die Oberfläche der mittleren Platte benetzt, wird der Gelausschnitt so nah wie möglich an den V-Kanal in eines der Räder eingelegt. Es sollten keine Blasen im Vch-Kanal vorhanden sein.Dies kann vermieden werden, indem der Kanal mit Puffer durchgespült wird, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Anschließend werden vorsichtig 100 Mikroliter der Hochsalz-Barriere von der der Vertiefung zugewandten Stelle aus in den V-Kanal gegeben. Die Kammer wird verschlossen und die Elektroden mit der Stromquelle verbunden, um die Elektrophorese bei 100 bis 120 Volt zu beginnen.Die Zeitdifferenz hängt von der Fragmentgröße ab, insbesondere bei großen Fragmenten bis zu 20 kb. 50 Minuten bis eine Stunde sollten ausreichen; bei kleinen Fragmenten ist eine Überwachung im Abstand von jeweils 10 Minuten mittels UV-Licht erforderlich, um eine weitere Elution durch die Salzlösung und in die endständige Pufferkette zu vermeiden. In diesem Fall haben wir 560 Nanogramm Plasmid mit den Enzymen ND1 und Entry verdaut, um ein Fragment von 900 Basenpaaren freizusetzen, was 84 Nanogramm einer Probe entspricht.Dementsprechend erfolgt nach dem Einlegen des Gelstücks in die Mulde die Elektroelution 25 Minuten lang bei 100 Volt. Sobald die Elektroelution abgeschlossen ist und die DNA-Fragmente im südlichen Kissen innerhalb des V-Kanals festgehalten werden, werden 400 Mikroliter Lösung aus dem Kanal gewonnen, und zwar von der distalen Seite des Behälters, und mithilfe einer feinen Spitze, die an einem Mikropipettiergerät befestigt ist, in ein 1,5-Mikroliter-Mikroröhrchen überführt. Danach wird die Alkoholpräzipitation durch Zugabe von zwei Volumina kaltem absolutem Ethanol durchgeführt und mittels Vortexen vermischt. Zusätzlich können zwei bis drei Mikroliter Glykogen zugegeben werden, um die Ausbeute an DNA zu verbessern. Die klassischen Röhrchen werden eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius oder alternativ über Nacht bei dieser Temperatur gelagert, anschließend bei vier Grad Celsius mit maximaler Drehzahl 25 Minuten lang zentrifugiert.Dieses Cardio-Supernatant und Waschmittel durch Zugabe von einem Milliliter kaltem, 70 %igem Ethanol. Zentrifugieren Sie bei vier Grad Celsius mit maximaler Geschwindigkeit für fünf bis 10 Minuten, verwerfen Sie das Supernatant und lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen, wobei die Röhrchen invertiert positioniert sind. Lösen Sie das Pellet in 10 bis 15 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser auf und bestimmen Sie anschließend die Konzentration der Probe. In diesem Fall wurde die gereinigte Probe in 10 Mikrolitern Wasser resuspendiert und in einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 260 Nanometern quantifiziert, was eine Konzentration von 6,3 Nanogramm pro Mikroliter ergab und eine Reinigungseffizienz von 75 % darstellt. Sie könnten denken, es wäre besser, nur 10 Minuten Ihrer kostbaren Zeit mit einem Kit zu investieren.Jedoch, trotz des Zeitaufwands, der bei diesem Verfahren entsteht, werden Sie viele der Variablen kontrollieren können, die es Ihnen ermöglichen, eine breitere Palette von Proben unterschiedlicher Größe und Herkunft zu reinigen. Wie Sie im vorliegenden Fall sehen konnten, wurde eine Reinigungseffizienz von 75 % beobachtet, die gleich gut oder besser ist als die der meisten DNA-Reinigungskits. Vielen Dank, dass Sie heute dabei waren.Wir hoffen, dass Sie dieses Protokoll als nützlich für Ihre Forschungsprojekte empfunden haben.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

"E-DNA"-Sensoren, Reagenzienfreier haben elektrochemische Biosensoren, die gute Leistungen, auch wenn direkt in Blut und anderen komplexen Matrices in Frage gestellt, um den Nachweis einer Vielzahl von Nukleinsäure-, Protein-und Small Molecule Analyten angepasst. Hier präsentieren wir ein allgemeines Verfahren für die Herstellung und Verwendung solcher Sensoren.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

Ein Basis-Protokoll für die Trennung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese beschrieben.

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

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Dieses Video beschreibt die mikrofluidische Kapillarelektrophorese-Technik, um PCR-Amplikons nach ihrer Größe zu trennen. Diese Technik hilft bei der Fragmentgrößenbestimmung unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und Standardmarkern für die Molekülgröße.

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Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen 

Lernen Sie die Elektroelution von DNA-Fragmenten für die molekularbiologische Forschung. Diese Methode erreicht bis zu 80 % Effizienz und ermöglicht die kostengünstige Reinigung verschiedener DNA-Größen aus unterschiedlichen Quellen.

Electroeluting DNA-Fragmenten

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