Electroeluting DNA-Fragmenten

Hi.Today zeigen wir Ihnen, wie die Elektro lution durchgeführt wird, um DNA-Fragmente wie Aufschluss und PCR-Produkte zu reinigen. Für weitere Zwecke wie Klonierung und Sequenzierung kann die Elektrolution eine der Methoden der Wahl sein. Basierend auf der negativen elektrischen Ladung der DNA wird eine hohe Zellbarriere innerhalb des Elektrofeldes platziert, die die Fragmente abwirft und ihre weitere Migration verhindert.

Diese Methode ermöglicht die Aufreinigung einer Vielzahl von DNA-Fragmentgrößen aus verschiedenen Quellen mit einem relativ hohen Wirkungsgrad von bis zu 80 %. Sie stellen einen weiteren Vorteil der Elektrolution im Vergleich zu anderen Reinigungsmethoden wie Säulen, Harz-Kits und anderen dar. Die DNA-Probe wird zunächst durch eine mit Tediumbromid gefärbte Aris-Gelelektrophorese visualisiert, um das gewünschte zu reinigende Fragment zu visualisieren und zu identifizieren, die Elektrophorese sollte fortgesetzt werden.

Untere Fragmente werden gut getrennt, Unterkorn kann genau bestimmt werden. Nach der Elektrophorese. Das gewünschte Fragment wird mit einer brandneuen Rasierklinge sauber aus dem Gel herausgeschnitten und dabei darauf geachtet, die Gelscheibe so nah wie möglich an das gewünschte Band zu drehen.

Dieser Vorgang sollte mit angemessenem Schutz vor UV-Licht und mit Handschuhen durchgeführt werden. Nachdem Sie die Elektro-Luter mit dem entsprechenden Brennpuffer gefüllt und darauf geachtet haben, dass er über die Oberfläche des mittleren Plateaus verschüttet wird, wird die Gelscheibe so nah wie möglich am V-Kanal in eines der Räder gelegt. Es sollten keine Blasen im vch-Kanal vorhanden sein.

Dies kann vermieden werden, indem der Kanal mit einem Puffer gespült wird, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Dann werden 100 Mikroliter der hohen Salzbarriere vorsichtig von der Stelle proximal zum Brunnen in den V-Kanal gegeben. Die Kammer ist gekapselt und die Elektroden werden an die Stromquelle angeschlossen, um die Elektro lution bei 100 bis 120 Volt zu beginnen.

Der Zeitraffer hängt bei großen Fragmenten von bis zu 20 kbs von der Fragmentgröße ab. 50 Minuten bis zu einer Stunde sollten ausreichen und kleine Fragmente sollten alle 10 Minuten mit UV-Licht überwacht werden, um ein weiteres Durchdringen der Salzlösung und in die endliche adulte Pufferkette zu vermeiden. In diesem Fall verdauten wir 560 Nanogramm Plasmid mit den Enzymen ND eins und setzten 900 Base pro Fragment frei, was 84 Nanogramm einer Probe entspricht.

Dementsprechend läuft die Elektro lution nach dem Einlegen der Gelscheibe in die Vertiefung 25 Minuten lang bei 100 Volt ab. Sobald die Elektrolösung abgeschlossen ist und DNA-Fragmente im Südkissen innerhalb des V-Kanals gefangen sind, werden 400 Mikroliter Lösung aus dem Kanal von der distalen Seite des Behälters zurückgewonnen und mit einer feinen Spitze, die an einer Mikrogrube befestigt ist, in ein 1,5-Mikroliter-Mikroröhrchen gegeben, mit der Alkoholfällung fortfahren, indem zwei Volumen kaltes absolutes Ethanol hinzugefügt und durch Vortex gemischt werden. Zusätzlich können zwei bis drei Mikroliter Glykogen zugesetzt werden, um die Ausbeute der klassischen Röhrchen zur DNA-Rückgewinnung bei minus 20 Grad Celsius für eine Stunde zu verbessern oder alternativ bei dieser Temperatur über Nacht bei vier Grad Celsius bei Höchstgeschwindigkeit für 25 Minuten zu lagern.

Dieser Kardio-Überstand und waschen Sie ihn, indem Sie einen Milliliter kaltes, 70%iges Ethanol hinzufügen, zentrifugieren Sie fünf bis 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei Höchstgeschwindigkeit, entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur trocknen, wobei sich die Röhrchen in einer umgekehrten Position befinden, Fette in 10 bis 15 Mikrolitern kernfreiem Wasser ausgegeben und fahren Sie mit der Bestimmung der Konzentration der Probe fort. In diesem Fall wurde die gereinigte Probe in 10 Mikrolitern Wasser resuspendiert und in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 Nanometern quantifiziert, was eine Konzentration von 6,3 Nanogramm pro Mikroliter zeigte, was einem Wirkungsgrad von 75 % entspricht. Vielleicht denken Sie, dass Sie besser dran wären, wenn Sie nur 10 Minuten Ihrer kostbaren Zeit in ein Kit investieren.

Trotz der Zeit, die für diesen Prozess aufgewendet wird, werden Sie in der Lage sein, viele der Variablen zu kontrollieren, die es Ihnen ermöglichen, eine breitere Palette von Proben zu reinigen, die Naturgrößen und -quellen enthalten. Wie Sie im vorliegenden Fall sehen konnten, wurde ein Wirkungsgrad von 75 % beobachtet, der gleich oder besser war als bei den meisten DNA-Aufreinigungskits. Vielen Dank, dass Sie heute bei uns sind.

Wir hoffen, dass Sie dieses Protokoll für Ihre Forschungsprojekte nützlich fanden.