Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. Diseksiyonu tampon hazırlama, 7.2 ve sterilize 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 mM _MgCl 2, 2mm KCl, 5mM Hepes ve 1000 ml, PH 36 mM Sakkaroz: Aşağıdaki bileşikleri ekleyerek hazırlayın .

2. Diseksiyon için hazırlanması

1. Siligard küp jel yaklaşık bir inç genişliğinde, 1 inç uzunluğunda ve yüksekliği yaklaşık 1cm kesilir. Jel küp Diseksiyon sırasında bir bardak slayt yerleştirilir. Küpleri birden fazla kez kullanılabilir.
2. Pimler: diseksiyon için kullanılan Pins kısa ekstra gerekir. Minutien pimleri keskin alt kısmında diseksiyonu en iyi çalışır.
3. Bir keskin mikrodiseksiyon bahar makas ihtiyacınız var.
4. Iki ince uçlu forseps ihtiyacınız var.

3. Larva, Toplanması

1. ^3. instar larvaları GFP etiketli vezikül proteini ifade Wandering petri üzerine toplanır.
2. Larva tüm gıda kurtulmak için deiyonize su ile yıkanır.

4. Larvaların Canlı diseksiyon

1. Bir larva, bir bardak slayt diseksiyonu jel küp aktarılır. Larva diseksiyonu tampon batırılır.
2. Larva ön ve arka dorsal yüzü iki güzel iğne kullanarak pined.
3. Mikrodiseksiyon makas kullanarak, arka sonuna yakın, orta hatta küçük bir kesi yapılır. Bu kesiden ön kesme ile yapılır. Iki iğne kullanarak, yan kenarları kesme manikür pin.
4. Tampon diseksiyon bir damla ekleyin. Gut, bağırsak ve yağ organları forseps ile dikkatlice çıkartın. Bu dokuların çoğu normalde dorsal kesim sırasında sızmak.
5. Taze diseksiyon tampon tampona değiştirin. Larva kuru olması asla ve sürekli tampon diseksiyon olmalıdır.
6. In vivo belirteçlerinin MitoTracker veya LysoTracker kullanarak inkübatörü diseksiyonu tampon in vivo marker seyreltilmesi, şu anda yapılır. In vivo işaretleyicisinde inkübasyondan sonra disseke larva taze diseksiyon tampon kullanarak birkaç kez (5 hızlı yıkama) yıkayın.
7. Değiştirdikten sonra son yıkama syligard ve hemen lamel pimleri itin. Larvaları artık gözlem için hazır.

5. Disseke larvaları Canlı görüntüleme

1. Ters bir mikroskop kullanılarak mikroskop sahne ve görüntü üzerine lamel ve jel yerleştirin.
2. Biz larva segmental sinirler içinde görüntü etiketli veziküller 100x bir objektif kullanın. GFP ifade ventral ganglion hücre organları segmental sinirler görüntülü önce ilk olarak değerlendirilir. Ventral ganglion hücre gövdeleri sağlam GFP boyama görülürse, sinirleri sonra görüntülü ve değerlendirme için kullanılır.
3. CFP / YFP veya RFP / YFP filtreleri ve in vivo olarak biz aynı anda görüntü iki etiketli protein split görünümü yazılımı ile ikili bir görüş sistemi kullanma.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1: bir larva segmental sinir içinde birçok aksonal pistlerde birçok aksonal veziküller gösteren temsili resim aksonal birikimleri temsil eden, GFP lekeler unutmayın .

Şekil 2: bir larva segmental sinir içinde birçok aksonal veziküller ile tek bir akson parça gösteren temsili resim.

Drosophila larva segmental sinirler içinde sinaptik vezikül taşıma in vivo görüntüleme aksonal taşıma mekanizmaları çalışmak için güçlü bir araçtır. Daha önce larva sinirler içinde tekrarlar geniÅŸleme vezikül taşımacılığı ³ dinamiklerini nasıl etkilediÄŸini aydınlatmak için geniÅŸletilmiÅŸ polyQ tekrarlar ifade taşıma dinamikleri deÄŸerlendirmek için bu protokolü kullandık. Bu protokolü kullanarak vezikül hareketinin hızı, video akışı bir kymograph dönüştürerek tespit edilebilir. Genetik kullanarak, GFP vezikül taşımacılığı GFP ifade sürücü belirli bir GAL4 sürücüsünü kullanarak tek bir akson içinde veya birkaç aksonların içinde görüntülenir olabilir. Ayrıca ulaşım dinamikleri de belirli genlerin mutasyonları taşıyan larva görülebilir. Ayrıca iki farklı GFP türevleri (OBP veya RFP) ile etiketlenmiÅŸ veziküller, aynı anda görüntülenmiÅŸtir olabilir.