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 JoVE General

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

*1, *1, 1

1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    이 비디오에서 우리는 floxed Rac1 allele를 갖고 기본 마우스 배아 섬유아 세포를 감염시킬 Cre 호텔 recombinase 유전자를 갖고 아데노 바이러스를 사용합니다.

    Date Published: 9/09/2010, Issue 43; doi: 10.3791/2160

    Cite this Article

    Hawley, S. P., Wills, M. K. B., Jones, N. Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts. J. Vis. Exp. (43), e2160, doi:10.3791/2160 (2010).

    Abstract

    유전자 다양한 세포 신호 폭포의 특정 구성 요소를 제거하는 능력은 현대적인 신호 전달 분석에 필수적인 도구가되었습니다. 이 조건 삭제를 달성하기 위해 하나의 특정 방법은 Cre 호텔 - loxP 시스템의 사용을 통해이다. 이 방법은 Cre 호텔의 recombinase 단백질에 대한 구체적인 인식 시퀀스 아르 loxP 사이트와 관심의 유전자를 측면이 포함됩니다. Cre 호텔 - 중재 재조합 loxP 사이트에서 이벤트 및 개입 유전자 3 후속 절단이 효소 결과 소위 floxed (loxP 사이트 둘러싸인) DNA의 노출. 여러 가지 방법은 관심의 사이트에 Cre 호텔 recombinase를 관리할 수 존재합니다. 이 비디오에서는, 우리는 floxed Rac1 allele 1 포함 배아에서 얻은 기본 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 감염하는 Cre 호텔 recombinase 유전자를 포함하는 아데노 바이러스의 사용을 보여줍니다. 우리의 실험 Rac1 MEFs 선택을위한 우리의 근거는 명확 형태학의 변경 사항이 굴지 cytoskeleton 2,5의 변경으로 인해 Rac1의 삭제,시 볼 수 있습니다. 바이러스 전달 및 Cre 호텔 식을 다음과 72시간은 세포가 굴지 염료 phalloidin를 사용하여 스테인드 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 이것은 adeno - Cre 호텔 바이러스에 노출되었던 MEFs가 감염되지 않은 세포에 비해 이전 보고서 2,5와 일치하는 계약을 체결하고 형태의 길쭉한 나타난 것을 관찰했다. Cre 호텔 recombinase 전달의 아데노 바이러스 방법은 adeno - Cre 호텔 바이러스가 쉽게 사용할 수로 유익하고, 세포의 거의 100 %에 Cre 호텔을 통해 유전자 삭제는 최적화된 adenoviral 감염 얻을 수 있습니다.

    Protocol

    해동 세포

    1. 액체 질소에서 냉동 배아 섬유아 세포 마우스 (MEFs)을 (개인 배아 차 문화에서 이전에 생성한) 구합니다.
    2. 37 병을 immersing로 녹여 세포 컨텐츠가 완전히 해동되기 전까지는 소용돌이와 함께 ° C 물.
    3. 10cm의 세포 배양 접시 10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보완되었습니다 DMEM의 9mL를 추가합니다.
    4. 판 드롭 현명한 해동 세포 현탁액을 추가, 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하룻밤 세포 및 장소 플레이트를 해산하기 위해 부드럽게 접시 바위. 세포 DMSO (냉동 과정에서)으로 구분하는 경우 세포 접시 (약 4 시간 게시물 도금)을 준수 후, 초기 미디어 신선한 매체로 대체될 수 있습니다. 또한 해동 후 세포의 합류를 참고하면 동결 세포의 숫자에 따라, 동결 후 세포의 회복 속도, 그리고 세포의 성장 속도.

    Passaging 세포

    1. 세포 confluency 본질적으로 100 % (예 : 다음날)로 성장하면, 미디어를 기음과 멸균 PBS의 5mL와 세포를 씻으십시오.
    2. PBS를 제거하고 세포가 접시에서 분리 수 있도록 약 5 분 동안 인큐베이터에서 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 장소 플레이트를 포함하는 트립신의 1mL를 추가합니다.
    3. 세포가 분리되면, 대단히 짧은 시간을 해산 미디어 9mL를 포함하는 새 접시에 드롭 현명이 정지 1mL을 추가하고 37 ° C 배양기 하룻밤에이 곳으로 trypsinized 세포 미디어 9mL를 추가, 피펫 2-3 회 . 미디어의 FBS의 존재 또는 트립신을 inactivate되며, 세포는 트립신을 희석 먼저 씻어 수 있습니다.

    커버 전표에 세포를 계산하고 도금

    1. 인큐베이터에서 세포를 제거, 이번에는 대신 9mL의 trypsinized 세포에 다시 5 6mL 미디어를 추가할 제외 씻어 및 이전과 trypsinize
    2. 피펫 세포는 철저하게 하나의 세포 현탁액에 완전한 분리를 보장하고, 별도의 microfuge 튜브에 trypan 블루 15μL와 결합 15μL 제거합니다.
    3. 몇 시간을 아래와 pipetting하여 세포 / trypan 파랑 정지를 혼용하고 hemocytometer에 15μL 추가할 수 있습니다.
    4. 현미경, 죽은 세포 파란색 나타납니다. hemocytometer에서 4X4 격자 중 하나에 (생활) 무색 / 취소 세포의 수를 계산합니다. 다른 세 4X4의 격자 (표시된 A, B, C 및 D)에서이 계산을 반복하고 정지 μL 당 세포의 수를 계산하려면 다음 공식을 사용
      방정식 1
    5. 프로토콜 최적화를 통해, 우리는 실험의 결론에서 시각화에 적합한 세포 밀도 30,000 전지 결과를 도금 것으로 나타났습니다.
    6. 30000 세포에 필요한 세포 현탁액의 볼륨을 계산하려면 다음 공식을 사용
      방정식 2
    7. 지금 여섯 잘 요리의 각 우물에 멸균 유리 커버 슬립을 배치하고 각 물론 미디어의 2mL를 추가하고, 다음 세포 현탁액 30000 세포에 필요한 볼륨에서 각 우물에 드롭 현명 추가할 수 있습니다. 우리가 나중에 지점에 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화되므로 유리 커버 풀렸는데이 실험에 사용되는 것에주의하라; 모든 애플 리케이션은 반드시 현미경을 필요로하고, 따라서 전표가 필요하지 않을 수 있습니다 다룹니다.

    바이러스 전달

    1. 몇 시간 또는 하루 (세포 커버 풀렸는데을 준수하는지 확인하는 데 충분한 시간) 후, 미디어를 제거하고 혈청없는 DMEM의 1mL와 세포를 씻으십시오.
    2. 바이러스의뿐만 아니라 각 잘하는 혈청이없는 미디어를 1mL를 추가합니다. 본 실험에서는, adeno - Cre 호텔 바이러스 벡터 Biolabs에서 상업적으로 얻은 것입니다.
    3. 이전 프로토콜 최적화 500 감염의 다중성이 (뫄) 세포 생존 능력에 거의 혹은 전혀 영향과 기본 MEFs으로 고효율 유전자 전달을 제공하는 것으로 나타났습니다. 뫄은 다음과 같이 계산 수 있습니다
      방정식 3

      방정식 4
    4. 감염된 것으로 각 물론 직접 바이러스의 계산된 볼륨을 추가 부드럽게 하루 37 ° C 배양기에 바이러스 및 장소 세포를 해산하기 위해 접시 바위.
    5. 다음날 아침, 제거 바이러스가 들어있는 세포에서 미디어과 1mL 멸균 PBS로 세포를 세척하고 다음 각 잘하기 위해 정기적으로 미디어의 2mL 추가할 수 있습니다.
    6. 이 실험에서 exemplified Rac1 세포의 경우, 형태학의 변화는 약 72시간 게시물 전달의 세포에서 발생했습니다.

    대표 결과

    세포는 시각화했다D 굴지 염료 phalloidin (이미징 목적만을 위해)와 얼룩과 겔프 대학에서 고급 분석 센터에서 Leica TCS SP5 - multiphoton 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 몇 군데. 그림 1은 바이러스에 노출되지 동일한 세포에 비해 adeno - Cre 호텔 바이러스에 노출되었던 Rac1 flox / flox 세포의 계약과 길쭉한 형태를 보여줍니다.

    그림 1
    그림 1. 같은 소스 (오른쪽)에서 감염되지 않은 세포에 비해 adeno - Cre 호텔 바이러스 (왼쪽)에 감염된 Rac1 flox / flox 세포 사이의 비교.

    Discussion

    함께 비디오는 재조합 바이러스가 Cre 호텔 recombinase를 사용하여 체외에서 소비세 특정 유전자하는 데 사용할 수있는 방법을 exemplifies. 이 프로토콜의 개발은 그러나 번지 가치가 어떤 특정 지점을 밝히지 않았다.

    • adenoviruses 작업을 할 때 적절한 안전 절차를 항상 고용해야합니다. 바이러스와 함께 작업하면서 실험 복과 장갑은 항상 착용해야합니다. 미디어 플라스틱 도자기는 적어도 30 분 동안 10 % 표백제와 함께 치료해야하며, 플라스틱 도자기는 그 이후 autoclaved해야합니다.
    • 피하은 반복 동결 - 해동이 바이러스 titer 영향을 따라서 전달의 효율성을 줄일 수로 바이러스 주식. 바이러스 주식의 작은 볼륨이 처음 별도의 튜브로 aliquoted해야합니다.
    • 50-500까지 MOIs는 방법을 개발하는 동안 테스트되었습니다 효율적인 전달 속도는 세포 생존 능력에 부정적인 영향없이, 대부분의 경우에서 관찰되었다.
    • Adeno - GFP는 신속하게 전달 효율성을 화면으로 방법을 개발하는 동안 사용되었다. 이 컨트롤 (또는 빈 벡터)는 세포 변화 발생하지 않습니다 혼자 바이러스 감염을 보장하기 위해 실험 기간 동안 실시한다. 마찬가지로, 당신의 세포에 대한 관심의 floxed 유전자를 절개하는 모든 세포 변화 (형태 또는 생존에 즉 변화)에 따라서하지 않는 경우, 그때 adeno - GFP와 동일한 셀 유형을 감염하면 해당 바이러스 전달이 입증하는 데 사용할 수있는 중요한 컨트롤입니다 발생.

    문화 캐스케이즈 신호의 심사 넘어, adeno - Cre 호텔 접근법은 또한 조건 실험 동물 3,4에서 유전자를 제거하고, 유기체 6 안에서 세포의 특정 인구 라벨 생체내에 채용되었습니다. 아데노 바이러스 시스템은 또한 호스트 세포에 Cre 호텔 recombinase 이외의 다른 유전자를 도입하기 위해 적용할 수 있습니다. 이 배달 벡터를 사용하는 두 가지 주요 장점은 높은 전달 및 유전자 전달 효율, 및 호스트 DNA와 통합의 부족입니다. 그러나, 소설 재조합 adenoviruses의 세대 집중적인 노동 수 있습니다. 프로토콜 여기서 설명하는 것은 이전에 개발 adeno - Cre 호텔 바이러스를 이용하여 adenoviral 시스템의 전원을 장비하고, 커플링 관심, Rac1 우리의 floxed allele과 함께. 실험 아웃이 조건부 노크를 통해, 우리는 MEFs가 floxed Rac1의 allele를 들고의 adeno - Cre 호텔 바이러스를 사용하여 전달 실제로 Rac1 - 결함 세포 2,5의 세포 형태 특성의 변화로 이어지는 Rac1의 절단을 일으킬 않는 것으로 확인되었습니다.

    Disclosures

    동물 실험 동물 관리에있는 캐나다 협의회가 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

    Acknowledgements

    저자는 기본 Rac1 flox / flox 마우스 배아 섬유아 세포의 자신의 선물 토론토, 온타리오 마운트시나이 병원에있는 닥터 Rizaldy 스콧 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR, 청소 2009-93526)와 자연 과학 및 캐나다 공학 연구위원회 (NSERC, RG 327372-06)의 캐나다 연구소에서 뉴저지에 보조금을 운영하여 지원했다. SH와 MW는 CGSMA 각각 CIHR과 NSERC에서 CGS - M 보너스에 의해 지원됩니다.

    스티브 홀리와 멜라니 윌스 마찬가지로이 문서에 기여.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ad-CMV-Cre virus Vector Biolabs 1045
    DME High glucose media 500mL Fisher Scientific SH3002201
    FBS Canadian origin 500mL VWR international CAA15-701
    PEN-STREP 1X solution 100mL Fisher Scientific SV30010
    Texas Red-X phalloidin Invitrogen T7471
    Trypsin Sigma-Aldrich T4549

    References

    1. Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D.A. & Zheng, Y. Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly. J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).
    2. Glogauer M., Marchal C.C., Zhu F., Worku A., Clausen B.E., Foerster I., Marks P., Downey GP., Dinauer M., Kwiatkowski D.J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions. J. Immunol. 170, 5652-7 (2003).
    3. Prost, S., S. Sheahan, D. Rannie, and D. J. Harrison. Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion. Nucleic Acids Res. 29, E80 (2001).
    4. Rijnkels, M., and J. M. Rosen. Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells. J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).
    5. Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y. & Kwiatkowski, D.J. Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor. Mol. Biol. Cell 17, 2377-2390 (2006).
    6. Wang, H., H. Xie, H. Zhang, S. K. Das, and S. K. Dey. Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus. Genesis. 44, 51-56 (2006).

    Comments

    1 Comment

    I sort of expected an experiment that actually demonstrated recombination of your floxed allele. PCR, LacZ or a GFP reporter would have been helpful.
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 16, 2011, 3:56 PM

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