Name: 腺病毒介导的基因去除信号分子在原代培养的小鼠胚胎成纤维 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 了解利用腺病毒向原代小鼠胚胎成纤维细胞递送Cre重组酶以实现Rac1基因高效切除的方法。该技术有助于研究Rac1在肌动蛋白动态调控中的功能作用。

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作者谨此感谢多伦多安大略省西奈医院的 Rizaldy Scott 博士惠赠原代 Rac1flox/flox 小鼠胚胎成纤维细胞。本研究工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR, MOP 2009-93526）和加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC, RG 327372-06）向 NJ 提供的运营资助。SH 和 MW 分别获得了 CIHR 和 NSERC 提供的 CGSMA 和 CGS-M 奖学金支持。
Steve Hawley 和 Melanie Wills 对本论文贡献相同。

解冻细胞
<ol>
 <li> 从液氮中取出先前由单个胚胎原代培养制备的冻存小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。</li>
 <li> 将冻存管置于37°C水浴中轻轻摇动，直至内容物完全融化，以解冻细胞。</li>
 <li> 向一个10 cm细胞培养皿中加入9 mL DMEM培养基，该培养基已添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。</li>
 <li> 将解冻后的细胞悬液逐滴加入培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞分散均匀，随后将培养皿置于37°C、5% CO2培养箱中过夜培养。需注意，若细胞对冻存过程中使用的DMSO敏感，可在细胞贴壁后（约接种后四小时）更换为新鲜培养基。此外，解冻后细胞的汇合度取决于冻存细胞的数量、冻存后的复苏率以及细胞的生长速率。</li>
</ol>
细胞传代
<ol start="5">
 <li> 当细胞生长至几乎 100% 汇合度（即次日）时，吸除培养基，并用 5 mL 无菌 PBS 洗涤细胞。</li>
 <li> 移除 PBS，加入含 10 mM EDTA 的 1 mL 胰蛋白酶溶液，将培养板放入培养箱中孵育约 5 分钟，使细胞从培养板上脱落。</li>
 <li> 待细胞脱落后，向胰蛋白酶消化的细胞中加入 9 mL 培养基，吹打 2–3 次以分散细胞团块，取 1 mL 该悬液逐滴加入另一新培养板中（该板内已含 9 mL 培养基），并将培养板置于 37°C 培养箱中过夜。培养基中的 FBS 可使胰蛋白酶失活；或者，也可先洗涤细胞以稀释胰蛋白酶。</li>
</ol>
将细胞计数并接种到盖玻片上
<ol start="8">
 <li> 从培养箱中取出细胞，按先前方法洗涤并进行胰蛋白酶消化，但此次向消化后的细胞中加入5-6 mL培养基，而非9 mL。 </li>
 <li> 用移液器充分吹打细胞，确保完全解离成单细胞悬液，并移除 15μL 结合 15μL 在另一个微量离心管中加入台盼蓝。 </li>
 <li> 用移液器将细胞/台盼蓝悬浮液上下吹打混匀数次，然后加入 15μL 到血细胞计数板。 </li>
 <li> 在显微镜下，死细胞呈蓝色。计数血细胞计数板上其中一个4×4方格内的透明/无色（活细胞）数量。重复计数其余三个4×4方格（标记为A、B、C和D），并使用以下公式计算每毫升细胞数量： μL 悬浮液： 
 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="细胞计数公式方程，使用 A、B、C、D 的平均值计算每 µL 的细胞数；乘法因子" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"></li>
 <li> 通过方案优化，我们确定每孔接种 30,000 个细胞可在实验结束时获得适合观察的细胞密度。</li>
 <li> 为计算获得30,000个细胞所需的细胞悬液体积，请使用以下公式： 
 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="细胞浓度公式，细胞培养体积计算；公式：体积（µL）=30,000/每µL细胞数。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"></li>
 <li> 现在将无菌玻璃盖玻片放入六孔板的每个孔中，每孔加入 2 mL 培养基，然后将细胞悬液逐滴加入每孔，使每孔接种 30,000 个细胞。注意，本实验使用玻璃盖玻片是因为后续需要通过荧光显微镜观察细胞；并非所有应用都需要显微观察，因此不一定需要使用盖玻片。</li>
</ol>
病毒转导
<ol start="15">
 <li> 数小时或过夜后（确保细胞已充分贴附于盖玻片），吸除培养基，并用 1 mL 无血清 DMEM 洗涤细胞。</li>
 <li> 每孔加入 1 mL 无血清培养基以用于病毒添加。本实验所用的腺病毒-Cre（adeno-Cre virus）购自 Vector Biolabs。</li>
 <li> 此前的方案优化结果表明，感染复数（MOI）为 500 时，可实现原代 MEFs 中高效的基因转导，且对细胞活力影响极小或无影响。MOI 可按以下公式计算： 
 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="计算病毒用量的公式，所需 MOI × 细胞数量 = 所需病毒量，公式。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 3"> 
 
 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="病毒原液体积计算公式；适用于实验室实验和病毒学研究的方程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 4"> </li>
 <li> 将计算好的病毒体积直接加入待感染的每孔中，轻轻摇动培养板以分散病毒，随后将细胞置于 37°C 培养箱中过夜。</li>
 <li> 次日早晨，吸除含病毒的培养基，用 1 mL 无菌 PBS 洗涤细胞，然后每孔加入 2 mL 正常培养基。</li>
 <li> 以本实验中示例的 Rac1 细胞为例，转导后约 72 小时可观察到细胞出现形态学变化。</li>
</ol>
代表性结果
通过使用肌动蛋白染料鬼笔环肽（仅用于成像目的）对细胞进行染色，并在圭尔夫大学先进分析中心利用Leica TCS-SP5多光子共聚焦激光扫描显微镜进行成像。图1显示了经腺病毒-Cre感染的Rac1flox/flox细胞呈现出收缩和伸长的形态，而未暴露于病毒的相同细胞则无此形态变化。
<img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Rac1^flox/flox; Cre 系统的显微镜红荧光图像，显示细胞比较结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 来自相同来源的 Rac1flox/flox 细胞经腺病毒-Cre 感染（左）与未感染细胞（右）的比较。

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

动物实验按照加拿大动物护理委员会制定的指南和规定进行。

配套视频示例展示了如何利用重组病毒切除特定基因 体外 使用 Cre 重组酶。然而，该实验方案的开发过程中揭示了一些值得特别关注的问题。
<ul>
<li>	操作腺病毒时应始终遵循适当的安全规程。操作病毒时必须全程穿戴实验服和手套。培养基和塑料器皿应使用10%次氯酸钠溶液处理至少30分钟，之后塑料器皿需进行高压灭菌。</li>
<li>	避免对病毒原液反复冻融，以免影响病毒滴度，从而降低转导效率。病毒原液应预先分装至多个独立管中，每管含少量体积。</li>
<li>	在方法开发过程中测试了50–500范围内的感染复数（MOI），大多数情况下均观察到高效的转导率，且对细胞活力无不良影响。</li>
<li>	在方法开发过程中还使用了Adeno-GFP，以快速评估转导效率。实验过程中应设置该对照（或空载体对照），以确认病毒感染本身不会引起细胞变化。同样，若在细胞中切除目标floxed基因未引起任何细胞变化（如形态或活力改变），则使用相同细胞类型感染adeno-GFP是一个重要的对照，用以证明病毒转导确实发生。</li>
</ul>
除了在培养条件下研究信号级联反应外，腺病毒介导的Cre重组酶（adeno-Cre）方法还被应用于活体（in vivo）实验，以条件性地从实验动物中剔除特定基因3,4，并标记生物体内特定的细胞群体6。腺病毒系统还可被改造，用于将除Cre重组酶以外的其他基因导入宿主细胞。使用该递送载体的两个主要优势在于其高效的转导和基因递送能力，以及不会整合到宿主DNA中。然而，构建新的重组腺病毒过程较为耗时。因此，本方案利用已有的adeno-Cre病毒，结合我们所拥有的Rac1基因的floxed等位基因，充分发挥腺病毒系统的功能。通过这一条件性基因敲除实验，我们证实了利用adeno-Cre病毒感染携带floxed Rac1等位基因的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），确实可导致Rac1基因的切除，从而引起细胞形态发生改变，呈现出Rac1缺陷型细胞的典型特征2,5。

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-Cre 病毒</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>DME 高糖培养基 500mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS 加拿大来源 500mL</td><td>VWR 国际公司</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 1X 溶液 100mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>德克萨斯红-X 标记鬼笔环肽</td><td>英杰公司</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>西格玛奥德里奇公司</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

腺病毒介导的培养原代小鼠胚胎成纤维细胞中信号分子的基因剔除

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

通过遗传学手段特异性敲除细胞信号转导级联中特定组分的能力，已成为现代信号转导研究中的重要工具。实现条件性基因删除的一种常用方法是利用 Cre-loxP 系统。该方法通过在目标基因两侧插入 loxP 位点（loxP sites）来实现，loxP 位点是 Cre 重组酶蛋白的特异性识别序列。当含有此类两侧带有 loxP 位点（即“floxed”）的 DNA 暴露于该酶时，Cre 重组酶会在 loxP 位点处介导重组事件，从而导致中间基因序列的切除3。目前存在多种将 Cre 重组酶递送至特定部位的方法。在本视频中，我们演示了使用携带 Cre 重组酶基因的腺病毒（adenovirus）感染来源于含有 floxed Rac1 等位基因胚胎的小鼠原代胚胎成纤维细胞（MEFs）的方法1。我们选择 Rac1 MEFs 进行实验的原因在于，Rac1 基因的缺失会引起细胞骨架中肌动蛋白结构的改变，从而产生明显的形态学变化2,5。在病毒转导并表达 Cre 重组酶 72 小时后，使用鬼笔环肽（phalloidin）对肌动蛋白进行染色，并通过共聚焦激光扫描显微镜成像。观察发现，与未感染细胞相比，接受腺病毒-Cre（adeno-Cre virus）感染的 MEFs 在形态上呈现收缩和拉长的特征，这与先前报道的结果一致2,5。采用腺病毒递送 Cre 重组酶的方法具有优势，因为腺病毒-Cre 易于获取，并且通过优化腺病毒感染条件，可在接近 100% 的细胞中实现基因删除。

在本视频中，我们使用携带 Cre 重组酶基因的腺病毒来感染携带 floxed Rac1 等位基因的原代小鼠胚胎成纤维细胞。

特异性剔除各种细胞信号转导级联中特定组分的遗传学能力，一直是现代信号转导研究中的重要工具……

现代遗传学分析在很大程度上依赖于能够实现从细胞、器官或整个生物体中靶向移除特定基因的技术。这些基因敲除实验有助于揭示基因在其细胞环境中的功能。基因敲除所导致的分子、形态和生理表型均可为被删除序列所编码的基因产物的功能提供线索。在小鼠等模式生物中，实现条件性基因敲除的常用方法是将目标基因或外显子两侧连接loxP位点，这些位点作为Cre重组酶的识别序列。Cre酶可催化所谓的“floxed”等位基因发生不可逆的切除，从而将该序列从基因组中去除。目前存在多种将Cre重组酶引入系统的方法，包括在体（in vivo）方法以及直接作用于已建立细胞的方法。对于这一特定应用，我们将使用腺病毒将Cre递送至从携带flox等位基因的转基因小鼠中分离并培养的成纤维细胞。该方法可实现接近100%的转基因递送效率。当病毒施加于细胞后，会被内吞进入内吞囊泡，并被转运至核膜，在此处其DNA（包括目的转基因）可通过核孔复合体进入细胞核。细胞机制随后可以转录被注入的基因，并使其蛋白质产物作用于细胞。在此情况下，病毒编码的Cre重组酶从宿主细胞基因组中切除被终止的等位基因。我们来自加拿大安大略省圭尔夫市圭尔夫大学的Jones实验室。在我们的实验室中，我们关注信号转导的概念，以及当去除不同信号转导级联中的特定组分时会发生什么。今天我们将研究与肌动蛋白组织相关的级联过程。信号转导通过一系列生化组分实现，这些组分传递信息并引发表型变化，例如肌动蛋白的重新组织。我们感兴趣的目标蛋白是RAC1，这是一种在介导肌动蛋白动态过程中起重要作用的小GTP酶，包括细胞黏附、迁移和形态变化。在本项研究中，我们将利用CRE LAX P系统敲除该基因，并验证其在细胞中的功能。此前，已从受精后12天的胚胎小鼠中分离出携带flox RAC1等位基因的成纤维细胞。随后将这些细胞置于液氮中进行长期保存，我们将从解冻代表一个胚胎的一支冻存细胞开始。在进行细胞培养实验时，维持无菌环境至关重要。这包括用70%乙醇擦拭经认证的超净工作台的暴露表面，并对所有进入超净台的试剂瓶和实验设备进行喷洒消毒。在准备好超净工作台后，将细胞冻存管浸入盛有37摄氏度水的烧杯中，直至内容物完全融化。接着，用70%乙醇对冻存管进行消毒，然后将细胞悬液逐滴加入一个10厘米培养皿中，该培养皿内已含有9毫升DMEM高糖培养基，该培养基已添加10%胎牛血清和1%青霉素。链霉素，轻轻摇动培养板以分散细胞，并将培养板放入含5%CO2的37°C培养箱中，注意用适当信息标记培养板。细胞通常在24小时内达到100%融合度。此时，可将细胞传代至新的培养板中。为此，首先吸除旧的培养基。加入5 mL无菌PBS洗涤细胞，然后同样吸除。接着加入1 mL含有10 mmol/L EDTA的胰蛋白酶溶液。将培养皿放入37摄氏度的培养箱中，孵育约五分钟，使细胞从基质上脱落。随后返回超净台，向消化后的培养皿中加入九毫升培养基，使细胞稀释十倍，用移液器将液体上下吹打数次以分散细胞团块，然后吸取一毫升细胞悬液，逐滴加入含有九毫升新鲜培养基的新10厘米培养皿中。再次轻轻摇动培养皿以均匀分散细胞，并将培养皿放入37摄氏度培养箱中继续培养。当细胞达到汇合状态时，下一步是将它们接种到玻璃盖玻片上，以便通过显微镜进行观察。采用与包装过程中相同的技术处理细胞，包括向细胞中加入三重溶液，并将其放入37摄氏度的培养箱中。在细胞从培养皿上脱落的同时，准备六孔板，每孔放入一片经高压灭菌的玻璃盖玻片。待细胞从培养板上脱落之后，向消化后的细胞中重新加入5到6毫升培养基。在实验的下一阶段，将进行细胞计数，以便接种适量的细胞，从而实现高效的病毒感染。进行细胞计数时，取15微升样品与等体积的台盼蓝混合，吹打混匀，然后取15微升该混合液加入血细胞计数板中。在此制备条件下，死细胞将呈现蓝色，仅计数四乘四网格中活细胞或无色细胞，以计算每微升的细胞数量。首先，在四个独立的网格 A 至 D 中分别计数细胞，并取平均值。然后将该数值乘以 2，以校正台盼蓝稀释因素。由于方格容纳十分之一微升，需乘以10，将数值表示为每微升的细胞数。接下来，通过将所需细胞数量除以先前计算的细胞浓度，确定所需的体积。然后将计算出的细胞悬液体积逐滴加入六孔板的每个孔中。将这些细胞在37摄氏度培养箱中孵育过夜。次日将病毒加入细胞中。从Vector B实验室获得的登溪病毒已分装并储存于负80摄氏度。取出该病毒并放回生物安全柜中。将六孔板从培养箱中取出，移至生物安全柜内。吸除培养基，并用1 mL无血清DMEM洗涤细胞。现在向每个孔中加入1 mL无血清培养基，用于添加病毒。在病毒感染实验中，我们采用500的感染复数（MOI）。此前已使用不同MOI进行过方案优化，结果表明MOI为500时可实现高效的感染率，同时对细胞活力几乎没有或完全没有影响。计算感染复数（MOI）时使用以下公式。首先计算所需的病毒数量，可通过将目标 MOI（本例中为 500）乘以每孔细胞数（即 30,000）得到。为确定应使用的病毒储存液体积，将病毒数量乘以 1000，再除以病毒的初始浓度。本例中，我们将向每个待感染的孔中加入 1.5 µL 的病毒储存液。轻轻摇动培养板以分散病毒，并将培养板置于37摄氏度培养箱中过夜。次日早晨，从细胞中移除病毒培养基，用PBS洗涤，然后向细胞中加入2 mL常规培养基。在本实验中，我们发现细胞的表型变化大约在72小时后出现。使用Acton染料染色的细胞在圭尔夫大学先进分析中心采用Leica T-C-S-S-P五通道多光子共聚焦激光扫描显微镜进行成像。结果显示了感染细胞与非感染细胞之间的形态学变化。缺乏RAC1的细胞呈现细长形态，而未感染的细胞则较为宽大且扁平。在此，我们已证明ADOC折痕系统是一种高效的基因递送方法，可用于信号转导研究之外的细胞基因传递。然而，您也可以利用该方法在实验动物中敲除基因，或对生物体内的特定细胞群体进行标记。腺病毒系统还可用于导入除Cree以外的其他基因。使用该递送方法的优点包括其高感染率、高效性以及不会与宿主细胞 DNA 整合。然而，普通腺病毒的制备过程可能较为耗时。因此，本方案利用先前开发的 ocre 病毒与我们的 flocking RAC 一种方法相结合的腺病毒系统，通过该条件性基因敲除，我们已证明。因此，细胞形态确实在一定程度上依赖于小GTP酶RAC1。总之，来自Jones实验室的我们想对观看本视频的您表示感谢，并祝您未来的所有研究工作顺利成功。

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