腺病毒介导的基因去除信号分子在原代培养的小鼠胚胎成纤维

现代基因分析在很大程度上依赖于有助于从细胞、器官或整个生物体中靶向去除特定基因的技术。这些敲除实验有助于揭示基因在其细胞环境中的功能。敲除的分子形态学和生理表型都提供了有关缺失序列编码的基因产物作用的线索。

在模式生物（如小鼠）中，实现条件基因缺失的常用方法是将目标基因或外显子的侧翼锁 P 位点，这些位点用作 Cree 重组酶的识别序列。然后由 Cree 催化所谓的植绒等位基因的不可逆切除，从而从基因组中消除该序列。有几种不同的方法可以将 Cree 重组酶引入系统，包括体内方法和直接处理已建立细胞的方法。

对于这个特定的应用，我们将使用腺病毒将 Cree 递送到成纤维细胞中，这些细胞是从携带羊群等位基因的转基因小鼠中分离和培养的。这种方法导致转基因递送的效率几乎为 100%。当病毒被施用于细胞时，它被内吞囊泡内化并运输到核膜，在那里它的 DNA，包括感兴趣的转基因，可以通过 Poor 复合物穿透细胞核。

然后，细胞机制可以转录注射的基因，并允许其蛋白质产物作用于细胞。在这种情况下，病毒编码的 Cree 重组酶从宿主细胞基因组中切除植绒等位基因。我们来自加拿大安大略省圭尔夫市圭尔夫大学的琼斯实验室。

在我们的实验室中，我们对信号转导的概念以及当您去除各种信号转导级联反应的特定组分时会发生什么感兴趣。今天，我们将研究与肌动蛋白组织相关的级联反应。信号转导是通过一系列生化成分完成的，这些生化成分传递信息并引发肌动蛋白重组等表型变化。

我们感兴趣的蛋白质是 RAC one，这是一种小的 gtpa，在介导肌动蛋白动力学（包括细胞粘附、迁移和形态）中很重要。在这项研究中，我们将使用 CRE LAX P 系统去除该基因并确认其在细胞中的作用。以前，来自胚胎小鼠的成纤维细胞在受精后 12 天分离出一个植绒架，一个等位基因。

然后将这些细胞置于液氮中长期储存，我们将首先解冻代表一个胚胎的这些细胞的单瓶。在进行细胞培养实验时，保持无菌环境非常重要。这包括擦拭经批准的流动罩的裸露表面，以及用 70% 乙醇喷洒所有进入罩的试剂瓶和实验室设备。

准备好流动罩后，将样品瓶浸入 37 摄氏度水的烧杯中，直到内容物呈液体，以解冻细胞。接下来，用 70% 乙醇对小瓶消毒，然后加入细胞悬液。滴入含有 9 密耳 DMEM 的 10 厘米平板上，DMEM 是一种高葡萄糖培养基，补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素。

链霉素轻轻摇动板以分散细胞，并放入含 5% CO2 的 37 度培养箱中，记住用适当的信息标记板。细胞通常在 24 小时内达到 100% 的 co 流畅度。此时，我们可以将细胞传代到新板上。

要做到这一点，首先要吸出旧媒体。加入 5 密耳无菌 PBS 冲洗细胞，然后将其也去除。现在加入 1 mil 含有 10 毫摩尔 EDTA 的胰蛋白酶。

将板放入 37 度培养箱中约 5 分钟，让细胞从基质中分离。返回流动罩，将 9 密耳的培养基加入回胰蛋白板中，从而将细胞稀释为 10 分之 1，上下移液数次以打碎细胞团块，然后取出 1 密耳的悬浮液，将其滴加到新的 10 厘米板中的 9 密耳新鲜培养基中。再次轻轻摇动板以分散细胞并放入 37 度培养箱中。

当细胞达到汇合时，下一步是将它们接种到玻璃盖玻片上，以便通过显微镜观察它们。使用与包装细胞相同的技术制备细胞，包括将行程添加到细胞中，然后将它们放入 37 摄氏度的培养箱中。当细胞从板中取出时，每孔使用一个高压灭菌的盖玻片准备一个带有玻璃盖玻片的六孔培养皿。

细胞从板中分离后，向胰蛋白酶化的细胞中加入 5 到 6 mil 的培养基。对于实验的下一阶段，将进行细胞计数，以便可以放置适当数量的细胞以进行有效的病毒感染。为了对细胞进行计数，将 15 微升样品与等量的 trian blue 移液管上下混合混合，并将 15 微升该溶液添加到血细胞仪中。

死细胞将显示为蓝色：在此制剂下，仅计数 4 x 4 网格上的活细胞或无色细胞，以计算每微升的细胞数。首先对 A 到 D 四个单独网格中的单元格进行计数，然后取平均值。然后将该值乘以 2 以考虑 trian blue 中的稀释。

由于网格可容纳 1/10 微升，因此乘以 10 以将数字表示为每微升细胞数。接下来，通过将所需细胞数除以先前计算的细胞浓度来确定所需的体积。将计算出的细胞悬液体积逐滴加入六个焊接皿的每个孔中。

将这些细胞在 37 度培养箱中放置过夜。第二天，病毒将被添加到细胞中。从 Vector B 实验室获得的 den creek 病毒被分装并在负 80 摄氏度下储存。

检索此病毒并返回到 Flow Hood。从培养箱中取出六孔培养皿，将其带到通风橱中。吸出培养基，用 1 mil 无血清 DMEM 洗涤细胞。

现在向每个孔中加入 1 mil 的无血清培养基以添加病毒。对于病毒应用，我们使用感染倍数或 500 的 MOI。之前使用各种 MOI 进行了方案优化，我们发现 500 的 MOI 提供了高效的感染率，对细胞活力的影响很小或没有影响。

要计算 MOI，请使用以下公式。首先计算所需的病毒数量，这可以通过将目标 MOI 乘以每孔的细胞数（在本例中为 500 乘以每孔的细胞数）或 30， 000 来确定应使用的病毒原液体积，将病毒数乘以 1000 并除以病毒的初始浓度。在这种情况下，我们将向每个要感染的孔中加入 1.5 微升病毒原液。

轻轻摇动板以分散病毒，并将板放入 37 度培养箱中过夜。第二天早上，从细胞中去除病毒培养基，用 PBS 洗涤，并向细胞中加入 2 mil 的常规培养基。在这个实验中，我们发现细胞在大约 72 小时内发生了表型变化。

使用圭尔夫大学高级分析中心的徕卡 T-C-S-S-P 五多光子共聚焦激光扫描显微镜对使用 Acton din 染色的细胞进行成像。这揭示了感染细胞和非感染细胞之间的形态变化。与未被感染的宽而扁平的细胞相比，那些缺乏 RAC 的细胞显得细长而薄。

在这里，我们已经证明 ADOC 折痕系统是一种可靠的方法，可在信号转导研究之外将基因高效递送到细胞。但是，您也可以使用这种方法敲除实验动物中的基因，或者标记生物体中的特定细胞群。腺病毒系统也可用于将 Cree 以外的基因引入原则。

使用这种递送方法的优点包括其高感染性、效率和不与宿主细胞 DNA 整合。然而，常见腺病毒的产生可能是劳动密集型的。因此，此处描述的方案利用腺病毒系统的力量，使用先前开发的 ocre 病毒和我们的植绒 RAC one mes 通过这种有条件的敲除，我们已经证明了这一点。

所以形态确实部分依赖于小 GTP 作为 RAC 的 GTP。因此，总而言之，我们 Jones 实验室只想对观看我们的视频表示感谢，祝您未来的研究好运。