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 JoVE Biology

确定在细胞培养的细胞数量,使用权杖细胞计数

1, 1, 1, 1, 1

1Bioscience Division, Millipore Inc

Article
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    Summary

    权杖细胞计数是一种手持式的自动化设备,可用于计数细胞,细胞的直径和体积的监测,用于检查从一种文化到下一个细胞群的健康和质量。

    Date Published: 11/26/2010, Issue 45; doi: 10.3791/2204

    Cite this Article

    Ongena, K., Das, C., Smith, J. L., Gil, S., Johnston, G. Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter. J. Vis. Exp. (45), e2204, doi:10.3791/2204 (2010).

    Abstract

    计数细胞, 在体外细胞培养往往是必要的,但繁琐的步骤。一致的细胞浓度,保证实验的重复性和准确性。细胞计数,细胞的健康和增殖率的监测,评估永生化或转化,播种随后的实验中,转染或感染的细胞,细胞检测准备的重要。重要的是准确,一致和快速的,特别是对于细胞反应的定量测量,细胞计数。

    尽管这种细胞计数的速度和准确性的需要,71%接受调查的400 研究人员 1人使用血球计数细胞。虽然hemocytometry价格低廉,它是费力,受到用户的偏见和误用,结果不准确计数。特种光学玻璃,装在指定的卷,并在显微镜下计数细胞悬液Hemocytometers。 hemocytometry错误的来源包括:样品中的细胞分布不均匀,太多或太少的细胞样品中,以一个给定的单元格是否落在定义的计数区域内的主观决定,血球污染,用户到用户的变化和血球变化充填率2。

    为了减轻人工计数的单调乏味,29%的研究人员使用自动细胞计数装置计数细胞,其中包括基于视觉的计数器,检测细胞使用库尔特原则的系统,或流式细胞 1 。对于大多数研究人员,使用一个自动化系统的主要障碍是与这些大型的台式仪器 1相关价格。

    权杖细胞计数器是一个自动化的手持设备,在一个相对较低的的成本提供了自动化和库尔特计数的准确性。该系统采用阻抗为基础的粒子探测,在一个小型化格式3库尔特原则使用的模拟和数字硬件相结合的传感,信号处理,数据存储,图形显示。一次性提示是设计一个微型的细胞感应区,使细胞大小和细胞在亚微米和子皮升的决议量歧视。精密液体处理渠道和电子增强,权杖的细胞的计数器报告细胞群统计图形直方图显示。

    Protocol

    1。细胞计数的重要性

    1. 计数细胞是在体外细胞培养的必要条件,但繁琐的步骤。
    2. 一致的细胞浓度,保证实验的重复性和准确性。
    3. 细胞计数,细胞的健康和增殖率的监测,评估永生化或转化,播种随后的实验中,转染或感染的细胞,细胞检测准备的重要。
    4. 尽管细胞计数的速度和准确性的需要,400研究人员调查了使用血球计数细胞的71%。虽然hemocytometry价格低廉,它是费力,受到用户的偏见和误用,结果不准确计数。
    5. hemocytometry错误的来源包括:样品中的细胞分布不均匀,太多或太少的细胞样品中,以一个给定的单元格是否落在定义的计数区域内的主观决定,血球污染,用户到用户的变化,和血球充填率的变化。
    6. 为了减轻人工计数的单调乏味,29%的研究人员使用自动细胞计数装置计数细胞。然而,大多数研究人员,与这些大型的台式仪器相关的价格是其使用的一个障碍。
    7. 权杖细胞计数器是一个自动化的手持设备,在一个相对较低的的成本提供了自动化和库尔特计数的准确性。
    8. 该系统采用一个微型传感,信号处理,数据存储和图形显示,使用了模拟和数字硬件相结合的格式的阻抗为基础的粒子探测库尔特原则。
    9. 一次性传感器的设计与一个微型的细胞感应区,使细胞大小和细胞在亚微米和子皮升的决议量歧视。
    10. 增强与高精度液体处理渠道和电子,权杖细胞计数图形显示直方图的细胞人口统计数字。

    2。为计数的单细胞悬液的制备

    1. 要使用的权杖细胞计数,开始稀释的细胞的单细胞悬液,磷酸盐缓冲。 10,000-500,000每毫升细胞浓度是最佳选择。
    2. 100μL稀释的细胞转移到1.5 mL离心管。

    3。表演细胞计数使用的权杖

    1. 打开权杖细胞计数,按住仪器背面的切换,并等待出现在屏幕上的说明。
    2. 提示时,附加传感器电极感应朝向仪器的前面板的权杖单位年底。
    3. 权杖传感器包括一个精密成型的采样室,电子感应区和综合性的细胞感应电极。该传感器有可能歧视在亚微米级分辨率的细胞大小,细胞体积子皮​​升分辨率。
    4. 一致的传感器工程,确保平等的样品量的计算和精确的尺寸测量。
    5. 一旦传感器连接,执行每一步的点票过程中,根据屏幕上的说明如下:
    6. 当屏幕上读取“按住柱塞开始,”抑制柱塞。屏幕将读“淹没传感器。”淹没传感器进入细胞悬浮液和释放柱塞吸进传感器的细胞悬液。
    7. 柱塞作为一个电信号,将吸引到传感器的样品加死体积。暴跌的速度或精度并不重要,因为它与吹打。这一过程将需要几秒钟。准备就绪后,仪器会发出哔声,和“样品装入”将显示在屏幕上。
    8. 一旦样品被装入,它是通过感应区画来评估细胞的大小和细胞体积,然后通过微传感器。一旦50μL的样品计数传感器告诉仪器停止计数。
    9. 计数完成后,仪器的屏幕上阅读“计数完成,请移除传感器和丢弃。”按照提示,并删除和丢弃的传感器。
    10. 该仪器将在其屏幕上显示一个细胞的大小或直径的直方图,以及细胞浓度为每毫升。

    4。数据分析

    1. 后计数完成,并在仪器上显示直方图,申请按下切换按钮的大门。选择“自动门控”或“使用上的”自动设置基于直方图姿态门要么,或使用从以前的计数闸门。
    2. 无论选择,盖茨可以手动移动微调的数据。按下切换按钮,再选择左边的门,然后滚动到ggle移动门。
    3. 然后按下切换再次激活右门和滚动切换到地方的权利门。再次点击,将显示一个新的细胞浓度,平均细胞体积和直径。
    4. 切换也可以移动到任何一方的开关之间的日期显示,时间,平均细胞大小,平均细胞体积。
    5. 仪器本身可以存储多达72直方图。要上传到个人电脑的数据,将通过在显示屏幕上的USB线接口的仪器。
    6. 在电脑上,双击权杖软件应用程序,以启动该软件,然后点击“连接”。所有的罪名将自动端口的软件。
    7. 权杖应用软件显示直方图,详细介绍了人口分布的文化,无论是体积或直径。下载的文件,然后可以导出到Microsoft Excel中,原始数据将显示的特定的细胞直径或细胞卷箱。

    5。代表性的成果

    1. 十九个不同的细胞系,准备计数使用库尔特计数器和理论出发浓度进行了测定。这些细胞悬浮液,然后进一步在理论的细胞浓度稀释至细胞悬浮液。
    2. 然后用权杖细胞计数,以确定细胞浓度。图1显示了5 5代表性的细胞系,以及与理论的细胞浓度测量的稀释。
    3. 的R2值表示高度的线性,表明权杖计数是一种可靠的方法测试,在很宽的线性工作范围,细胞株。
    4. 图2表明,其中权杖计数所得的数据与库尔特计数所得的计数相比整体权杖计数的相对精度。
    5. 权杖细胞计数的日志暗算库尔特计数的日志,并显示,所有单元测试线,权杖计数匹配库尔特计数。
    6. 使用一个Z2的库尔特计数器,权杖细胞计数,一个自动化的基于视觉VI -细胞或无数的系统,如计数器,一个hemocytemeter,19个细胞株的计数。
    7. 根据制造商的指示进行计数,使用相同的单元格开始悬挂和相同的稀释。在图3所示的结果表明权杖计数密切配合,具有高线性理论的细胞浓度,细胞浓度。
    8. %的变异系数,或CV,计算出每个点票系统的每个细胞系的每个稀释。图4显示了超过19细胞株的细胞浓度和计算方法方面的平均%的CV。
    9. 经营范围内,权杖细胞计数超过基于视觉的血球计数精确,显示较小的标准偏差和平均系数的变化较小。
    10. 权杖计数比hemocytometry快十倍,速度比其他自动计数器。在图5,SF9,MCF7细胞,HEK293细胞计数使用此影片中所描述的方法。
    11. 录得的平均所需时间来衡量细胞浓度。请注意,hemocytometry每个样本进行一次。
    12. 权杖使得基于细胞大小的测量。因此,在细胞形态变化,可以捕获在直方图。健康的文化展示一个漂亮的钟形高斯分布,而不健康的细胞,溶解,并导致在直方图左移(图6,左侧面板)。
    13. 同样,当了50%的死细胞人口与50%的活细胞混合,直方图的变化,也观察到(图6,右图)。

    图1

    图2

    图3

    图4

    图5

    图6

    图7

    Discussion

    权杖细胞计数的性能比较从其他计数方法的结果,我们得出结论,这种新的手持设备,自动细胞计数在较宽的工作范围内提供精确,快速和可靠的细胞计数。权杖计数的功能,是一个嵌入到传感器头和库尔特原则为基础的复杂的计数仪表精密工程技术的结果。的性能质量的建议权杖方法来提高速度和提高细胞检测的可重复性的计数。手持格式允许在细胞培养罩快速单调乏味的免费票的权利。

    Disclosures

    凯瑟琳Ongena,Chandreyee达斯,珍妮特史密斯索尼亚吉尔和格雷斯庄士敦受聘微孔,产生了本文中使用的仪器。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 40 μm Scepter Sensors EMD Millipore PHCC20040
    Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 60 μm Scepter Sensors EMD Millipore PHCC20060
    Scepter Sensors, 60 μm EMD Millipore PHCC60050 50 Pack of sensors
    Scepter Sensors, 40 μm EMD Millipore PHCC40050 50 Pack of sensors
    Universal Power Adapter EMD Millipore PHCCPOWER
    Scepter O-Ring Kit EMD Millipore PHCCOCLIP 2 O-rings and one filter cover

    References

    1. Barghshoon, S. Cell Counting Survey. Millipore (2009).
    2. Tucker, K.G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C.R. Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis. Enzyme Microb Technol 16 (1), 29-35 (1994).
    3. Houwen, B. Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. Medical Laboratory Observer (2003).

    Comments

    6 Comments

    Just wondering how much you going to charge for the instrument.
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 30, 2010, 3:26 PM

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    Thanks again.
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 14, 2011, 12:15 PM

    Is it possible to download this video?
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 18, 2011, 5:20 AM

    Please contact us at support@jove.com.
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 19, 2011, 10:39 AM

    do hemocytometer used to less or over-estimate cell conc. when it is employed to detect too low/ high conc. of cells when it is compared to the scepter?
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 19, 2011, 3:08 AM

    Hemocytometers can under or over estimate cell concentrations depending upon the user and their defined counting scheme. Furthermore because only a small fraction of cells are counted (on average 100-²00) any errors are magnified by scaling and dilution factors resulting in CVs up to 30% and on average around 17%.

    Sources of under or over counting, include improper loading, user bias as to whether something is counted as a cell or not a cell, counting or not counting cells that fall on the line, contamination of the hemocytometer, inconsistent conventions for counting.
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 20, 2011, 7:03 PM

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