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 JoVE Biology

A gran escala basado en pez cebra En vivo Pantalla de moléculas pequeñas

1, 1, 1, 1,2,3,4

1Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine, 4Research Medicine, Veterans Affairs TVHS, Vanderbilt University School of Medicine

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    Summary

    Pez cebra se ha convertido en un poderoso

    Date Published: 12/30/2010, Issue 46; doi: 10.3791/2243

    Cite this Article

    Hao, J., Williams, C. H., Webb, M. E., Hong, C. C. Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen. J. Vis. Exp. (46), e2243, doi:10.3791/2243 (2010).

    Abstract

    Debido a su tamaño pequeño embrión, el rápido desarrollo, la transparencia, la fecundidad, y numerosas similitudes moleculares, morfológicas y fisiológicas de los mamíferos, el pez cebra se ha convertido en un poderoso

    Protocol

    1) la recolección de huevos de pez cebra

    1. En la tarde antes del día de la pantalla químicos, creado desde 10 hasta 20 tanques de cría de pez cebra. Llenar cada tanque con agua del sistema de la acuicultura. Utilizando una red de pesca, la transferencia de un macho adulto y uno o dos hembras adultas en el recipiente interior de cada tanque de cría. Separar los peces machos y hembras de unos a otros con un divisor. Etiqueta de las jaulas y poner una tapa sobre ellos.
    2. En la mañana de la pantalla, quitar los separadores de los tanques de cría y permitir que el pez cebra para el apareamiento. En el transcurso del próximo 1 hora, permiten a los óvulos fertilizados a caer a través de la red en la parte inferior de cada envase interior.
    3. Después de 1 hora, vuelva adultos de pez cebra de nuevo a los tanques de almacenamiento permanente, retirar el recipiente interior y recoger los huevos por el esfuerzo del agua en cada tanque de crianza a través de un colador de té de plástico.
    4. Invertir el tamiz sobre una placa de Petri y lavar el filtro con cuidado para eliminar los huevos en la placa de Petri con una botella de lavado que contiene el medio E3.
    5. Todos los huevos no fertilizados, lo que parece opaco, debe ser removido con una pipeta de plástico desechable. Cada cruz de apareamiento debe producir alrededor de 200 embriones.

    2) arraying embriones en placas de 96 pozos

    1. La transferencia de alrededor de 5 embriones en un medio de E3 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos utilizando una pipeta Pasteur de vidrio.
    2. Una vez que los embriones son dispuestos sobre la placa de 96 pozos, extraer la mayor cantidad del medio E3 como fuera posible de los pozos con una de 12 canales (30 - 300 l) pipeta, teniendo cuidado de no perforar el embrión. Usando la pipeta de 12 canales, entrega 250 l de medio E3 que contiene kanamicina 0.5μg/ml a cada pozo lo más rápido posible para no permitir que los embriones se sequen.
    3. Ponga las placas de 96 pozos en 28,5 ° C incubadora hasta que alcancen la etapa deseada cuando los compuestos que se añaden.

    3) La transferencia de la biblioteca de moléculas pequeñas

    Mientras que la transferencia de compuestos pueden ser automatizadas con métodos de transferencia de robótica, vamos a describir el método de transferencia manual.

    1. Bibliotecas de moléculas pequeñas son típicamente suministrados en un formato de 96 pozos, con cada compuesto almacenados en DMSO como una reserva de 10 mm. Unos 60 minutos antes de que los embriones llegan a la etapa cuando los compuestos se van a agregar al deshielo de un número deseado de placas de 96 pozos que contienen alícuotas de pequeñas moléculas (placa de la fuente). Tome nota del número de serie de identificación u otro de los platos de origen. Para minimizar la condensación en las placas, el deshielo puede ocurrir en una cámara de desecación que contiene Drierite (WA Hammond Drierite CO, Xenia, OH).
    2. En pocas palabras de girar los platos en una centrífuga de mesa equipada con placa adaptadora múltiples también.
    3. Retire el precinto de aluminio de la placa de la fuente. Con una pipeta de 12 canales, diluir los compuestos de la placa de la fuente a la concentración de 0,5 mm (por ejemplo, si a partir de 250 nL alícuotas de las acciones 10 mM, añadir 4,75 l de DMSO a cada pocillo).
    4. Cuando los embriones en la placa de 96 pocillos (placa receptor) llegan a la etapa deseada, el uso de 12 canales (20-20 l) pipeta para transferir 2.5μL de compuestos (0,5 mM) de las placas de origen en las placas que contienen el receptor embriones.
    5. Anote el número de identificación de las placas de origen en las placas de receptores embrión. Se cubren las placas receptor ya que contiene los embriones y los compuestos con tapa, mezcle suavemente las placas girando suavemente, y colocarlos en una incubadora de 28,5 ° C.
    6. Cubrir cada plato de origen que contiene sin usar pequeñas moléculas (0,5 mm) con un precinto de aluminio y colocarlo en un congelador -80 ° C para almacenamiento a largo plazo.

    4) La detección de los efectos de moléculas pequeñas mediante una inspección visual de los fenotipos

    1. Antes de realizar la pantalla, formular un criterio específico para lo que constituiría un "golpe".
    2. En el momento deseado en el desarrollo, eliminar las placas de 96 pocillos que contienen el compuesto tratados con embriones de la incubadora y examinar cada bien bajo un microscopio estereoscópico. Para una mejor visualización de los cambios sutiles, tales como cambios en el patrón circulatorio, un microscopio de contraste de fase invertida se puede utilizar. Microscopía fluorescente se puede utilizar para examinar la perturbación de la expresión de las buenas prácticas agrarias o de las proteínas DsRed bajo un promotor tejido-específica.
    3. Analiza rápidamente las placas de 96 pozos para cualquier pozo en el que por lo menos 3 de los 5 embriones exhiben las prescritas "hit" fenotipo. Registro de la identidad de la placa y la ubicación del pozo de potencial de cada golpe.
    4. Volver a confirmar un éxito potencial de volver a probar los efectos del compuesto en varias dosis (1 uM, 5 uM, M 10 y M 50). Para cada dosis, 10 embriones son examinados en 0,5 ml de los medios de comunicación E3 en un formato de placa de 48 pocillos. El momento de la adición de compuestos para volver a probar debe ser idéntica a la de la proyección original. Un golpe se confirma cuando el fenotipo provocado se reproduce en un nuevo análisis de la compound
    5. Identifique el compuesto golpe de la base de datos de moléculas pequeñas en la biblioteca de química.

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    Discussion

    Cuando se planifica una pantalla de química basada en el pez cebra, se debe prestar especial atención a la solidez del fenotipo en estudio y la tasa previa de tal fenotipo. Esto es particularmente importante para las pantallas de los supresores de química de un fenotipo inducido. Por ejemplo, para un fenotipo causado por la inducción de choque térmico de un transgén, la condición que induce el fenotipo debe ser reproducible con precisión trazado antes de iniciar la pantalla para evitar inaceptablemente altos índices de falsos positivos. Con una planificación cuidadosa, las pantallas de pez cebra químicos, que requieren inversión de capital modesta, puede conducir al descubrimiento de nuevos modulador de la señalización celular y fisiología, así como compuesto líder para revertir los modelos de enfermedades humanas. Por último, por analogía con el clásico adelante cribados genéticos, el pez cebra basado en pantallas de químicos puede ser muy valioso para la disección genética química de los procesos biológicos fundamentales.

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    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material Name Type Company Catalogue Number
    Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
    Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
    Petri dishes (10 cm).
    Plastic tea strainer.
    Wash bottle containg embryo water.
    Disposable polyethylene transfer pipettes.
    Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
    Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
    Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
    E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
    12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
    12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
    Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
    Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
    Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
    DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
    Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
    Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).

    References

    1. Bayliss, P.E. et al. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology 2, 265-273 (2006).
    2. Burns, C.G. et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology 1, 263-264 (2005).
    3. Hao, J. et al. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology 5, 245-253 (2010).
    4. Hong, C.C., Peterson, Q.P., Hong, J.Y. & Peterson, R.T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol 16, 1366-1372 (2006).
    5. Milan, D.J., Peterson, T.A., Ruskin, J.N., Peterson, R.T. & MacRae, C.A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation 107, 1355-1358 (2003).
    6. Peterson, R.T., Link, B.A., Dowling, J.E. & Schreiber, S.L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 12965-12969 (2000).
    7. Yu, P.B. et al. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology 4, 33-41 (2008).
    8. Zon, L.I. & Peterson, R.T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews 4, 35-44 (2005).
    9. Stern, H.M. et al. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology 1, 366-370 (2005).
    10. Peterson, R.T. et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology 22, 595-599 (2004).

    Comments

    1 Comment

    Hi,
    I would like to complement the author on the video as this is a really good video for beginners who want to screen drugs.
    I will be screening for small molecules on zebrafish larvae(7² hpf). I would like to ask when you are screening a library for small molecules, are there any parameters you would keep in mind while selecting the compounds or is that we can randomly select any of the compounds available?
    Reply

    Posted by: Shruti D.January 23, 2013, 2:00 AM

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