Aislamiento de ratón las células epiteliales respiratorias y la exposición al humo del cigarrillo Experimental de la interfaz de aire líquido

El protocolo general requiere de dos días para aislamientos de células de tejido animal, de 5-10 días para la proliferación celular, y un adicional de 10 a 14 días para la diferenciación celular en la interfaz aire-líquido. Un día adicional se requiere para las exposiciones de la célula y la recolección de muestras.

1. Aislamiento de ratón traqueobronquial las células epiteliales (MTEC).

Nota: Todos los procedimientos descritos a continuación han sido revisados ​​y aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Brigham y el Hospital de la Mujer / Area de Harvard Medical School.

Antes de empezar:

• Prepare F12 Ham medios que contienen antibióticos. F12 medio basal de 250 ml de Ham (Cellgro) añadir 2,50 ml de una penicilina 100 X / estreptomicina (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) y 250 l de una solución de 1000 X Fungizone. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas.
• Prepare una solución de 0,15% Pronasa. Añadir 15 mg Pronasa a 10 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos. Hacer libre y mantenerla en hielo hasta su uso.
• Prepare una superficie de trabajo limpia y estéril de instrumentos quirúrgicos apropiados para cirugía de pequeños animales, y una capucha de cultivo de tejido laminar para aislamientos de células. El resto del equipo se considera estándar para el cultivo de células animales incluyendo humidificado incubadoras de CO _2, cuarto frío, células de mesa centrífugas, microscopio invertido, y una pipeta de plástico desechables y utensilios de la cultura.
• Prepare una solución de colágeno I (50 mg / mL en 0,02 N de ácido acético). Pipetear 1,0 ml de solución de colágeno en cada pocillo de una placa de 12 y Transwell (Corning). Envuelva en parafina y se deja reposar durante la noche sobre una superficie plana a temperatura ambiente.

1. Utilizando una cepa de ratón comercialmente disponible (es decir, C57BL / 6, masculino 6-8 semanas de edad), la eutanasia a los ratones usando un método aprobado de la eutanasia como el CO ₂ inducida por la narcosis. Generalmente de 6 ratones rendimiento suficiente de células (1,5-2,0 x 10 ⁵ células / ratón) a las semillas de una placa de 12 pocillos Transwell.
2. Rocíe los cadáveres de animales con el 70% de solución de EtOH para esterilizar el campo.
3. Con unas tijeras quirúrgicas limpias y el bisturí, quitar la piel alrededor del área de la tráquea, y exponer la tráquea. Abrir el abdomen, corte a lo largo del esternón, y quitar la caja torácica. Eliminar el tejido hasta el final de la tráquea está expuesto.
4. Tráqueas lugar en un tubo cónico de 50 ml que contienen 30 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos, sobre el hielo.
5. En una campana de flujo laminar estéril, la transferencia de tejido traqueal a un estéril 100 mm placa de Petri que contiene 10 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos.
6. Suavemente diseccionar tejido conectivo con una pinza estéril y tijeras quirúrgicas.
7. La transferencia de tejido traqueal a un nuevo plato de 100 mm de Petri con 10 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos para enjuagar. Cortar tráqueas largo del eje vertical para exponer luz.
8. Transferencia de tráqueas a un tubo de 50 ml que contienen 10 ml 0,15% de solución Pronasa e incubar durante la noche a 4 ° C.
9. En el segundo día, se han preparado:
   • Prepare una solución de DNAsa I. A 18 ml de Ham F12 medios que contienen antibióticos agregar 2 ml de 10 mg / ml de suero bovino solución de albúmina de acciones (BSA), y 10 mg de crudo de páncreas DNAsa I. Hacer alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 ° C (descongelados a hielo antes de su uso).
   • Prepare F12 Ham medios que contienen antibióticos con un 20% de suero fetal bovino (FBS). F12 medio basal de 200 ml de Ham (Invitrogen), agregar 50 ml de FBS inactivado por calor, 2,5 ml de penicilina 100 X / estreptomicina (10 ² U/mL-10 ² mg / ml), y 250 l de una solución de 1000 X Fungizone .
   • Preparar el medio MTEC básica que contenga antibióticos. A 475,5 ml DMEM/F12 los medios básicos (Cellgro) añadir 7,5 ml de solución de HEPES 1 M, 10 ml de solución de 200 mM de glutamina, 2 ml de un 7,5% _solución de NaHCO3, 5 ml de penicilina 100 X / solución de estreptomicina, 500 l de una solución X 1000 Fungizone
   • Prepare MTEC% de SFB medium/10. A 45 mL de medio MTEC básico que contiene antibióticos, añadir 5 ml de FBS inactivado por calor.
10. Agite suavemente el tubo (del Paso 1.8) 10.12 veces, y luego se deja reposar durante 30-60 minutos a 4 ° C.
11. Agregar 10 ml de Ham F12 medios de comunicación que contiene 20% de SFB y antibióticos para el tubo y la roca en 12 ocasiones.
12. Prepare tres tubos de 15 ml cónicos que contienen 10 ml de Ham F12 medios de comunicación que contiene 20% de SFB y antibióticos.
13. Quite las tráqueas de la solución Pronasa, dejando de lado esta solución en el hielo. Transferencia de tráqueas de primer tubo cónico que contiene F12 Ham e invierta el tubo 12 veces. Repita este proceso dos veces más.
14. Combine solución Pronasa con los tres sobrenadantes de paso 1,13 en un tubo de 50 ml. Deshágase de los pañuelos restantes.
15. Centrifugar a 1400 rpm (390 xg, Eppendorf 5810R centrífuga equipada con un rotor A-4-62) durante 10 min a 4 ° C, y desechar el sobrenadante.
16. Suavemente resuspender el precipitado en 1 ml de solución de DNAsa (100-200 l / tráquea)e incubar 5 min en hielo.
17. Centrifugar a 1400 rpm (390 xg) durante 5 min a 4 ° C, y desechar el sobrenadante.
18. Resuspender el botón celular en 8 ml de medio MTEC contiene 10% de SFB
19. Placa de suspensión celular en placas de Primaria (Falcon). Se incuba a 37 ° C en una atmósfera de aire del 95%, 5% de CO ₂ durante 5 horas (Nota: esta es una etapa de selección negativa de los fibroblastos).
20. Recoger la suspensión de células de las placas y aclare las placas dos veces con 4 ml MTEC contiene 10% de SFB. Suspensión de reserva de las células y se lava en un tubo cónico de 50 ml.
21. La conservación de 1 ml por citocentrifugación y el recuento de células. Girar en una centrífuga de mesa durante 5 min a 5.000 rpm (Eppendorf 5415D). Eliminar 500 l y el pellet se resuspende en el sobrenadante restante. Use 100 L para el recuento de células utilizando el método de azul de tripano tinción vital. La conservación de 4 alícuotas de 100 l para el análisis citospina
22. Girar otros 15 ml de suspensión celular a 1400 rpm (390 xg), a 4 ° C durante 10 min.

2. La propagación y la diferenciación de MTEC En la interfaz aire-líquido

Preparar soluciones estándar de ácido retinoico. Una solución de archivo: Pesar ácido retinoico en la oscuridad (Sr. 300,44 g / mol) para hacer una solución 5 mM de valores en EtOH al 95%. Almacenar en un tubo de papel de aluminio envuelto a -80 ° C. Según sea necesario, preparar una solución de archivo B (5 mM) mediante la adición de 50 l de archivo A, 500 l solución de BSA (100 mg / ml) y 49,5 ml de Hank solución salina balanceada (HBSS). Almacenar en un tubo de papel de aluminio envuelto a -80 ° C durante un máximo de 4 semanas.

Preparar el medio de la proliferación MTEC que contienen ácido retinoico. A 45,7 mL medios MTEC basal contiene antibióticos, añadir 2,5 ml SFB inactivado por calor, 1 mL ácido retinoico archivo B, 250 l solución de insulina (2 mg / ml de insulina en 4 mM HCl), 250 l solución de factor de crecimiento epidérmico (5 mg / mL FEAG en HBS con 1 mg / ml de BSA), 200 l extracto de pituitaria bovina (15 mg / ml en HBS con 1 mg / ml de BSA), 50 l solución de transferrina (5 mg / ml de transferrina en HBS con 1 mg / ml de BSA ), 50 l solución de la toxina del cólera (100 mg / mL en HBS con 1 mg / ml de BSA). Filtro de esterilización de la preparación de medios y el uso final de un plazo de 2 días de preparación.

1. Retire la solución de colágeno a partir de placas Transwell, deje reposar bajo el capó durante 5 minutos y lavar con PBS 2 veces.
2. Después de la centrifugación, resuspender el botón celular en un volumen adecuado de la proliferación de los medios de comunicación (500 l) para facilitar la chapa de 7,5 x 10 ⁴ -1,0 x10 ⁵ células por pocillo. Pipetear 500 l de suspensión celular sobre la superficie apical de la inserción de la membrana de policarbonato Transwell. Añadir 1,5 ml de los medios de comunicación la proliferación en el compartimento basal de la Transwell.
3. Incubar las culturas MTEC sumergido a 37 º C en un incubador humidificado contiene 95% de aire, 5% de CO ₂ durante 7-10 días.
4. Esperar tres días antes de cambiar los medios de comunicación por primera vez. Cambiar los medios de comunicación todos los días. Monitor de culturas mediante la inspección visual y la medición de resistencia de las células transepitelial utilizando un electrodo (EVOM Ohmvoltometer, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL).
5. Cuando las células parecen confluir y resistencia epitelial llega a 1000 Ω / cm ^2, las células están preparados para diferenciar a ALI.
6. Prepare MTEC medio basal que contiene 2% NuSerum. Añadir NuSerum a medio MTEC básicos para una concentración final de 2% V / V. Añadir B retinoico archivo ácido a una concentración final de 1 x 10 ^-7 M antes de usar. Prepare frescos y el uso dentro de 2 días.
7. Permiten diferenciar células durante 10-14 días, mediante la eliminación de los medios de comunicación apical y reemplazar el medio basal con 750 l de medios MTEC basal que contiene 2% de ácido retinoico y Nuserum. Cambiar el medio basal y lavar la parte apical con MTEC que contiene 2% NuSerum cada dos días.

3. Aplicación de humo del cigarrillo a cultivos de células epiteliales

1. Exponer la parte apical de las culturas Transwell al humo del cigarrillo convencional usando una celda de CS sistema de exposición (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Ver Figura 1 para la fotografía de los aparatos. Ver Tabla de reactivos y equipos específicos para las especificaciones técnicas. En resumen, el aparato consiste en una bomba peristáltica que fuma cada cigarrillo en ~ 7-8 inhalaciones, basándose en la corriente principal de humo en una línea de polipropileno que se conecta a una cámara de exposición ventilados. La cámara de exposición se mantiene a 37 ° C haciendo circular agua, y se mantiene en una atmósfera de 5% de CO ₂ en una línea de gas. Las células pueden estar expuestos al humo utilizando Kentucky 3R4F de investigación de referencia cigarrillos con filtro (El Instituto de Investigaciones del Tabaco de la Universidad de Kentucky, Lexington, KY). Normalmente, las células están expuestas al humo de 1 a 2 cigarrillos, produciendo 100 a 200 mg / m ³ de material particulado total (TPM). Control de las culturas están expuestos al aire ambiental para un período de exposición equivalente.
2. La TPM se mide de acuerdo con el protocolo del fabricante suministra con el TE-10c máquina de fumar (Empresas Teague). En resumen, un filtro (Pallflex) se coloca en un soporte de acero inoxidable en línea en un tubo de muestreo que va desde el puerto de muestreo en la cámara de ahumado a una bomba de caudal constante (unidad de muestreo). Un tubo de salida se conecta la unidad de muestreo a un medidor de gas (medidor de gas seco, ONM61, de 67 años, AEM). El filtro se pesa antes y después del muestreo de gas. El total del material depositado en el filtro en mg se normaliza el volumen total de aire muestreado.
3. Las células se pueden cosechar en cualquier momento (es decir, 0-24 horas) después de la exposición a nivel celular procedimientos analíticos (por ejemplo, Western inmunoblot análisis, análisis de ARNm, etc) o microscopía (es decir, la microscopía confocal o electrónica). Los medios de cultivo también pueden ser analizados por las citocinas o la liberación de LDH de los ensayos de citotoxicidad.

4. Resultados representante

Éxito en el aislamiento del epitelio, proliferación y diferenciación en ALI debe producir una monocapa intacta, con una morfología de adoquines. Resistencia de las células Transepithelilal de culturas sanas debe ser de aproximadamente 1000-2000 Ω / cm ^2. La figura 2 muestra una monocapa de ratón las células epiteliales respiratorias manchadas de células epiteliales y los marcadores de los cilios en condiciones de control y después de la exposición al humo de cigarrillo. La Figura 3 muestra micrografías de electrones representante de las culturas saludables MTEC, que representan la morfología y ultraestructura ciliar.

Figura 1. Preparación del producto las células epiteliales a través de tres fases, una etapa de aislamiento, una etapa de propagación, y una etapa de diferenciación en la interfaz aire-líquido (esquema). Las células epiteliales están aislados de ratón tráquea, sembradas en transwells donde proliferan en cultivo sumergido, y luego se convierte en la interfaz aire-líquido donde se diferencian totalmente. Los experimentos se suele realizar de los ²⁴ días de cultivo continuo. La imagen muestra un sistema modelo de la exposición de las células en cultivo al humo del cigarrillo convencional. Un sistema de Transwell ALI cultura se coloca dentro de un sistema personalizado de entrega modular el humo del cigarrillo, que es controlada por temperatura, humedad y CO _2.

Figura 2 cultivos de células epiteliales fueron fijadas y teñidas de núcleos (Hoechst 33258), F-actina (verde, Alexa-Fluor faloidina 488-conjugado). Y el marcador de los cilios α-tubulina acetilada (rojo, Cy3-anticuerpo secundario conjugado). Los paneles inferiores muestran imágenes equivalentes de las células epiteliales tomadas 4 horas después de la exposición al humo del cigarrillo (2 cigarrillos, 150 mg / m ^3). (B) La lactato deshidrogenasa (LDH) se midió la liberación en el medio basal de 24 horas después de la exposición a diferentes dosis de humo de cigarrillo, como se indica.

Figura 3. Aire-líquido interfaz culturas de las células epiteliales aisladas del epitelio traqueal del ratón se diferencian en varios subtipos que por microscopía electrónica de transmisión (TEM) tienen las características de las células ciliadas, basal, y no ^ciliadas-1. Estas células del epitelio respiratorio seudoestratificado tipifican. Las etiquetas de la figura corresponden a: bb: basal, a: axonema, m: n las mitocondrias,: núcleo, s: sustrato (policarbonato membrana), mv: microvili

El protocolo que describe el aislamiento de las células epiteliales de ratón traqueal es una adaptación de los protocolos de You et al., ^{1, 2.3} y otros con modificaciones. Como con cualquier protocolo que describe aislamientos de células, el aspecto más importante es evitar la contaminación de bacterias u hongos patógenos mediante el uso de técnicas asépticas estrictas. Un segundo paso crítico es evitar la contaminación de fibroblastos de las culturas, que puede ser evitado por una cuidadosa disección de la tráquea, y la selección negativa como se describe en el paso 1.19. A condición de que las culturas son monitoreados, se lavan, y los medios de cultivo repone cada dos días después de la hora de incubación inicial de 72 años, las culturas totalmente deberían diferenciar en aproximadamente dos semanas desde el inicio de la LPA.

Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), que es en gran parte causada por la exposición crónica humo del cigarrillo, sigue representando un importante problema de salud global de ^4-7. EPOC, se caracteriza por una limitación progresiva del flujo aéreo, la pérdida alveolar destructivos (enfisema), y la exagerada respuesta inflamatoria de los pulmones al humo del tabaco ^7.4. Un gran número de estudios han utilizado alveolar bronquial, y los sistemas de las vías respiratorias epiteliales de células para tratar de respuestas de los modelos de pulmón de células de CS. Muchos de estos estudios se han realizado en las células epiteliales o líneas de transformación (es decir, Beas-2b), ver Refs ^8.11 para los ejemplos. El sistema ALI Transwell la cultura permite el cultivo de células epiteliales pulmonares en la moda que está más cerca de su orientación fisiológicas en la vía aérea, a la que puede ser proporcionada por líquido convencional (sumergido) la cultura ^1.3. Aunque el protocolo presentado se describe la aplicación de este sistema de cultivos primarios de ratón traqueal ^1, en ​​principio, otras células epiteliales primarias se puede aplicar (es decir, el ratón células de tipo II epiteliales, las células epiteliales bronquiales, etc.) La aplicación de corriente en directo CS a cultivos de células representa un modelo que tal vez se aproxima más a la exposición humana al CS de la aplicación del extracto acuoso de humo de cigarrillo (CSE), que se utiliza comúnmente en estudios celulares de la exposición al CS ^15/12. CSE representa una fracción soluble de la corriente principal de humo que no tiene muchos componentes químicos del humo del conjunto. Si bien ambos sistemas de exposición CS tienen limitaciones, el CSE tiene la ventaja de ser más fácilmente calibrados, ya que una sola preparación se puede utilizar para múltiples experimentos, y la dosificación se logra mediante la dilución ^15-16. Por otro lado, incluimos aquí un método para cuantificar la emisión de humo convencional basado en las mediciones de TPM. La elucidación de las respuestas celulares y moleculares de la exposición a tóxicos, en particular CS como lo demuestra en este artículo, será avanzar en la comprensión del impacto de la contaminación del aire en la salud humana, en particular, la etiología de las enfermedades crónicas del pulmón.