Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Genel protokol, hayvan doku, hücre çoğalması için 5-10 gün ve hava-sıvı arayüzü hücre farklılaşması için ek bir 10-14 gün için 2 gün hücre izolasyonların gerektirir. Ek bir gün hücre pozlama ve numune hasat için gereklidir.

1. Fare Trakeobronşiyal Epitel Hücreleri (Mtec) izolasyonu.

Not: Aşağıda açıklanan tüm prosedürler ve Brigham ve Kadın Hastanesi / Harvard Tıp Okulu Alanı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

Başlamadan önce:

• Ham F12 Medya antibiyotik içeren hazırlayın. 250 ml Ham F12 bazal medya (Cellgro) 2.50 mL 100 X Penisilin / Streptomisin (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) solüsyonu, 1000 X Fungizone çözüm 250 mcL ekleyin . 4 haftaya kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.
• % 0,15 Pronase bir çözüm hazırlayın. Ham F12 Medya antibiyotik içeren 10 ml için 15 mg Pronase ekleyin. Taze ve kullanana kadar buz üzerinde tutmak.
• Temiz bir çalışma yüzeyine ve steril cerrahi aletler, küçük bir hayvan ameliyatı için uygun ve hücre izolasyonların için bir lamelli doku kültürü kaputu hazırlayın. Hayvan hücre kültürü için nemlendirilmiş CO ₂ inkübatör, soğuk oda, masa hücre santrifüjler, ters mikroskop ve tek kullanımlık plastik pipet ve kültür eşya da dahil olmak üzere diğer tüm ekipmanları standart olarak kabul edilir.
• Kollajen hazırlayın solüsyonu (0.02 N asetik asit, 50 mg / ml). 12 transwell plaka (Corning) her kuyuya Pipet 1.0 mL kollajen çözüm. Parafilm sarın ve oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde bir gece bekletin.

1. Piyasada satılan bir fare suşu (eski, yani erkek 6-8 hafta C57BL / 6) kullanarak, fareler gibi _{CO 2-kaynaklı} narkoz ötenazi onaylanmış bir yöntem kullanarak euthanize . Genelde 6 fareler 12-iyi transwell plaka tohum için yeterli hücreleri (1.5-2.0 x 10 ⁵ hücre / fare) verecektir.
2. Alanında sterilize etmek için 70% EtOH çözüm ile hayvan leşleri püskürtün.
3. Temiz cerrahi makas, neşter ile trakeal alanı çevresinde deri kaldırmak ve trakea maruz. Karnın aç, sternum boyunca kesme ve göğüs kafesi kaldırmak. Trakea sonuna maruz kadar doku çıkarın.
4. Buz üzerinde, antibiyotik içeren 30 ml Ham F12 medya içeren 50 ml konik bir tüp içine yerleştirin tracheas.
5. Steril bir lamel akış kaputu, antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren steril bir 100 mm Petri kabında trakeal doku transferi.
6. Yavaşça steril forseps ve cerrahi makas ile bağ dokusu disseke.
7. Durulamak için antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren yeni bir 100 mm Petri kabında trakeal doku aktarın. Tracheas lümen maruz dikey eksen boyunca kesin.
8. 10 ml% 0,15 Pronase çözüm içeren 50 ml tüp tracheas aktarın ve 4 gece boyunca inkübe ° C
9. Ikinci gününde, hazır bulundurun:
   • DNAz Ben çözümü hazırlayın. Içeren antibiyotikler -20 1 ml alikotları ve mağaza olun, 10 mg / ml Sığır Serum Albumin (BSA) stok solüsyonu 2 ml, 10 mg ve ham pankreas DNAz I. eklemek Ham F12 Medya ° C 18 ml (üzerinde çözülmüş Kullanmadan önce buz).
   • % 20 fetal sığır serumu (FBS) ile antibiyotik içeren Ham F12 ortamı hazırlayın. 200 ml Ham F12 bazal medya (Invitrogen) 50 ml ısı inaktive FBS 2.5 ml, 100 X Penisilin / Streptomisin (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) çözeltisi ve 250, 1000 X Fungizone çözüm mcL ekleyin .
   • Mtec Temel Orta antibiyotik içeren hazırlayın. 475,5 ml DMEM/F12 temel medya (Cellgro -) 7.5 mL 1 M Hepes çözüm, 200 mM glutamin çözüm, 2 mL% 7.5 _NaHCO 3 çözümü, 100 X penisilin / streptomisin çözüm 5 ml, 10 ml, 500 mcL ekleyin 1000 X Fungizone çözüm
   • Mtec medium/10% FBS hazırlayın. Mtec temel orta antibiyotik içeren 45 ml, 5 ml ısı inaktive FBS ekleyin.
10. Yavaşça tüp (Adım 1.8) 10-12 kez, rock ve sonra 4 oC de 30-60 dakika bekletin ° C.
11. Tüp ve kaya 12 kez% 20 FBS ve antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya ekleyin.
12. 3,% 20 FBS ve antibiyotik içeren 10 ml Ham F12 medya içeren 15 ml konik tüpler hazırlayın.
13. Buz üzerinde bu çözüm bir kenara koyarak, Pronase çözüm tracheas çıkarın. Ham F12 içeren ilk konik tüp tracheas transferi ve tüp 12 kez ters. Bu işlem iki kez daha tekrarlayın.
14. Biri 50 ml tüp içine adım 1.13 üç süpernatantlar Pronase çözüm birleştirin. Kalan doku atın.
15. 4 dakika 10 ° C ve supernatant atmak için; 1400 Santrifüj (A-4-62 rotor ile donatılmıştır Eppendorf 5810R santrifüj 390 xg).
16. Yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin, 1 ml DNAz çözüm pelet (100-200 mcL / trakea)ve 5 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
17. 5 dakika 4 ° C ve supernatant atmak için 1400 (390 xg) santrifüjleyin.
18. 8 mL Mtec orta% 10 FBS içeren hücre pelletini tekrar
19. Primaria Plakalar Plaka hücre süspansiyonu (Falcon). 37 inkübe ° C% 95 hava atmosferi,% 5 CO _2, 5 saat (Not: Bu fibroblastlar için negatif bir seçim adım) .
20. Plakalar hücre süspansiyonu toplayın ve 4 mL Mtec% 10 FBS içeren plakalar iki kez yıkayın. Havuz hücre süspansiyonu ve 50 ml konik bir tüp içinde birlikte yıkar.
21. Sitospin ve hücre sayımı için 1 ml koruyun. 5,000 rpm (Eppendorf 5415D) 5 dakika için bir masaüstü santrifüj Spin. Kalan süpernatant 500 mcL ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Tripan Blue hayati boyama yöntemi kullanılarak hücre sayımı için 100 mcL kullanın. Sitospin analizi için 4 alikotları 100 mcL tasarruf
22. 4, 1400 (390 xg) Spin kalan 15 ml hücre süspansiyonu ° C'de 10 dakika.

2. Mtec Hava-Sıvı Arayüz, Yayılması ve türevleri

Retinoik asit stok çözelti hazırlayın. Stok çözelti A:% 95 EtOH bir 5 mM stok solüsyonu yapmak için karanlıkta Retinoik asit (Bay 300,44 g / mol) tartılır. -80 ° C bir folyo sarılmış tüp içinde saklayın Gerektiğinde Hazır B çözeltisi (5 mcM), 50 mcL Menkul Kıymetler A, 500 mcL BSA çözüm (100 mg / ml) ve 49.5 ml Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ekleyerek hazırlayın. Bir folyo ile muhafaza için -80 ° C'de 4 hafta kadar tüp tamamladı.

Retinoik asit içeren Mtec çoğalması ortamı hazırlayın. Antibiyotik içeren 45,7 mL Mtec bazal medya için, 2.5 ml ısı inaktive FBS, 1 ml Retinoik asit Menkul Kıymetler B, 250 mcL İnsülin solüsyonu (2 mg / ml insülin 4 mM HCl), 250 mcL Epidermal büyüme faktörü çözüm (5 mg / eklemek , 1 mg / ml BSA içeren HBS ml EGF), 200 mcL sığır hipofiz ekstresi (HBS 1 mg / ml BSA içeren 15 mg / ml), 50 mcL Transferrin solüsyonu (HBS 1 mg / ml BSA içeren 5 mg / ml transferrin ), 50 mcL kolera toksin solüsyonu (HBS 1 mg / ml BSA içeren 100 mg / ml). Filtre son medya sterilize hazırlık ve hazırlık 2 gün içinde kullanın.

1. Transwell plakaları kollajen çözüm çıkarın, kaputun altında 5 dakika boyunca bekletin ve PBS 2 kez yıkayın.
2. Ardından santrifüj, proliferasyon medya (500 mcL) uygun bir hacmi de ortalama 7.5 x 10 ⁴ -1.0 x10 ⁵ hücre kaplama kolaylaştırmak için hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Transwell polikarbonat membran eklemek apikal yüzeye Pipet 500 mcL hücre süspansiyonu. 1,5 mL çoğalması medya transwell bazal bölmesine ekleyin.
3. 37 batık Mtec kültürler inkübe ° C,% 95 hava içeren bir nemlendirilmiş inkübatör 7-10 gün için% 5 CO _2.
4. Medya ilk kez değiştirmeden önce üç gün bekleyin. Her gün medya değiştirin. (EVOM Ohmvoltometer, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL), bir elektrot kullanarak transepitelyal hücre direnci görsel denetim ve ölçüm kültürler izleyin.
5. Hücreleri konfluent görünür ve epitel direnci 1000 Ω / cm ² ulaştığında, hücreler ALİ ayırt etmek için hazırız.
6. % 2 NuSerum içeren Mtec bazal ortamı hazırlayın. % 2 V / V nihai konsantrasyonu Mtec temel orta NuSerum ekle Kullanmadan önce son konsantrasyonu 1 X 10 ^-7 M retinoik asit Menkul Kıymetler B ekleyin. Taze hazırlayın ve 2 gün içinde kullanın.
7. Hücre apikal medya kaldırılması ve yerine% 2 Nuserum ve retinoik asit içeren 750 mcL Mtec bazal medya ile bazal medya, 10-14 gün için ayırt etmek için izin verin. Bazal medya değiştirin ve apikal tarafında% 2 NuSerum içeren Mtec her gün yıkayın.

3. Sigara Duman Uygulama Kültür Epitel Hücreleri

1. CS hücre poz sistemi (EMI Instruments, Pittsburgh, PA) kullanarak ana sigara dumanı transwell kültürlerin apikal tarafında Açığa. Cihazın fotoğraf için Bkz: Şekil 1. Teknik özellikler için özel reaktifler ve ekipman Tablo bakın. Kısacası, aparat, havalandırmalı bir pozlama odasına bağlı bir polipropilen hattı ana duman çizim ~ 7-8 ponponları her sigara içiyor peristaltik bir pompa oluşur. Maruz kalma odasında dolaşan su ° 37 ° C'de muhafaza ve% 5 CO ₂ gaz hattı üzerinde bir atmosfer korunur. Hücreleri Kentucky 3R4F araştırma referans filtre sigara (Tütün Araştırma Enstitüsü, University of Kentucky, Lexington, KY) kullanarak dumanına maruz kalabilirler. Genelde hücrelerin toplam partikül madde (TPM) 100-200 mg / m ³ verimli 1-2 sigara dumanına maruz kalmaktadır. Kontrol kültürleri eşdeğer bir pozlama süresi oda havaya maruz kalır.
2. TPM, TE ile birlikte üreticinin protokole göre ölçülür.-10c sigara makinesi (Teague'nin Şirketler). Kısaca, bir filtre (Pallflex) bir satır içi paslanmaz çelik tutucu bir sabit akış pompası (örnekleme birimi) için sigara içme odası örnekleme port önde gelen bir örnekleme tüp yerleştirilir. Bir çıkış tüp gaz sayacı (Kuru Gaz Sayacı, ONM61, 67, AEM) örnekleme birimi bağlanır. Filtre gaz örnekleme önce ve sonra tartılır. Mg filtre üzerinde biriken toplam malzeme örneklenir havanın toplam hacmi için normalize.
3. Hücreler daha sonra herhangi bir zaman noktasında (örneğin, 0-24 saat) mesaj standart hücre analitik prosedürler için maruz kalma (yani Batı immunoblotting analizi, mRNA analizi, vb..) Ya da mikroskobu (yani, konfokal veya elektron mikroskobu) hasat edilebilir. Kültür ortamı da sitokinler veya sitotoksisite deneyleri için LDH serbest için analiz edilebilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

ALİ başarılı epitel izolasyon, proliferasyon ve farklılaşma bir arnavut kaldırımlı morfolojisi ile sağlam bir tek tabaka boyun eğmek zorundadır. Sağlıklı kültürlerin Transepithelilal hücre direnci yaklaşık 1000-2000 Ω / cm ² olmalıdır. Şekil 2 fare solunum yolu epitel hücreleri, kontrol koşulları altında ve sigara dumanına maruz kaldıktan sonra, epitel hücre ve kirpikler belirteçler için lekeli bir tek tabaka gösteriyor. Şekil 3 ultrastrüktür ve kirpikler morfoloji gösteren, sağlıklı Mtec kültürlerin temsilcisi elektron mikrograflar gösterir.

Şekil 1 üç faz, bir izolasyon adım, bir yayılma aşamasında, ve bir farklılaşma aşamasında hava-sıvı arayüzü (düzeni) ile epitel hücreleri gelirleri hazırlanması. Epitel hücreleri, fare batık kültürü yayılmaya transwells üzerine numaralı seribaşı trakea, izole edilmiş, ve sonra tam olarak ayırt hava-sıvı arayüzü dönüştürülür. Deneyler genellikle sürekli kültürün ^24. gününde yapılmaktadır. Resmi kültür hücreleri ana sigara dumanına maruz kalma için bir model sistem gösteriyor. Transwell ALİ kültür sistemi, sıcaklık, nem ve _CO 2 kontrollü özel modüler sigara dumanı dağıtım sistemi içine yerleştirilir .

Şekil 2 Epitel hücre kültürleri sabit ve lekeli çekirdekleri (Hoechst 33.258), F-aktin (yeşil; Alexa Fluor 488-konjuge Phalloidin) ve kirpikler işaretleyici asetillenmiş α-tubulin (kırmızı, Cy3-konjuge sekonder antikor). Alt paneller, 4 saat sigara dumanına (2 sigara, 150 mg / ^m 3) maruz kalmaktan sonra alınan epitel hücreleri eşdeğer görüntüleri göstermek. (B) Laktat dehidrogenaz (LDH) yayın gösterildiği gibi sigara dumanı değişen dozlarda maruz kalma 24 saat sonra bazal ortamda ölçüldü.

Şekil 3 fare trakeal epitel epitel hücreleri izole Hava-sıvı arayüzü kültürler, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), bazal ve non-siliyalı tüycüklü ^hücreleri 1 özelliklere sahip çok sayıda alt tipi ayırt . Bu hücreler, yalancı solunum yolu epitel örneğini oluşturmaktadır. Şekil etiketler karşılık: bb: Bazal vücut, bir axoneme m: mitokondri, n: nükleus, s: substratı (polikarbonat membran), mv: microvili

Fare trakeal epitel hücreleri izole açıklayan protokol ^1, Sen ve ark protokolleri adapte ve diğer modifikasyonlar ile ^2-3. Hücre izolasyonların açıklayan herhangi bir protokol olduğu gibi, en kritik yönü, sıkı aseptik teknikler kullanılarak bakteriyel veya fungal patojenlerin bulaşmasını önlemek için. Ikinci bir kritik adım fibroblast tracheas dikkatli diseksiyon ile önlenebilir kültürlerin kirlenme, Adım 1.19 açıklandığı gibi negatif seçim önlemek için. Kültürleri, kültürler, izlenir, yıkanmış ve kültür ortamı, ilk 72 saat inkübasyon sonrası, her gün doldurulan olduğunu tam ALI başlangıcından itibaren yaklaşık iki hafta içinde ayırmak gerekir.

Kronik sigara dumanına maruz kalma büyük ölçüde neden olan kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), büyük bir küresel ^sağlık sorunu 4-7 temsil etmeye devam edecektir. KOAH, ilerleyici hava akımı kısıtlılığı, yıkıcı alveol kaybı (amfizem) ve ^4-7 sigara dumanı akciğer abartılı inflamatuar yanıtlar ile karakterize edilir. Çalışmaların çok sayıda CS modeli akciğer hücre yanıtlarını girişimi için alveoler, bronş ve hava yolu epitel hücresi sistemleri kullandık. Bu çalışmaların çoğu epitel hücre veya dönüştürülmüş hatları (yani, Beas-2b) yapılmıştır refs örnekler için ^8-11, bkz. ALİ transwell kültür sistemi, daha geleneksel sıvı (batık) ^kültür 1-3 sağlanabilir, solunum yollarında fizyolojik yönlendirme yakın moda pulmoner epitel hücrelerinin kültürü sağlar . Özellikli protokol fare trakeal primer kültürlerinde ^1, bu sistemin uygulama açıklar olsa da, ilke olarak, diğer birincil epitel hücreleri (örneğin, fare Tip II epitel hücreleri, İnsan bronşiyal epitel hücreleri, vb) uygulanabilir . Hücre kültürleri canlı ana CS uygulama belki de daha yakından CS ^maruz 12-15 hücresel çalışmalar yaygın kullanılan sulu sigara dumanı ekstraktı (CSE), uygulaması daha CS insan maruz kalma yaklaşık bir model temsil eder . CSE, bütün duman birçok kimyasal bileşenleri yoksun ana duman çözünebilir bir bölümünü temsil etmektedir. Hem CS pozlama sistemleri sınırlamalar olsa da, CSE bu yana tek bir hazırlık birden fazla deneyler için kullanılabilir, daha kolay kalibre olmanın avantajı vardır, ve dozaj ^seyreltme 15-16 sağlanır . Öte yandan, burada ana duman teslim TPM ölçümlere göre ölçülmesi için bir yöntem sayılabilir. Toksinlere maruz kalma, moleküler ve hücresel yanıtların aydınlatılması, özellikle CS olarak bu makalede örneklediği, özellikle akciğer, kronik hastalıkların etiyolojisi anlayış, hava kirliliğinin insan sağlığı üzerindeki etkisi daha fazla olacaktır.