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 JoVE Clinical and Translational Medicine

Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

1,2, 1, 1

1Department of Medicine, Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 2Cellular and Molecular Pathology, School of Medicine, University of Pittsburgh

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    Summary

    Pulmonale Epithelzellen aus den Atemwegen von Mäusen isoliert und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche als ein Modell der differenzierten respiratorischen Epithels. Ein Protokoll ist für die Isolierung, Kultivierung und Freilegen dieser Zellen zu Mainstream Zigarettenrauch beschrieben, um molekulare Antworten zu diesem Umweltgift zu studieren.

    Date Published: 2/21/2011, Issue 48; doi: 10.3791/2513

    Cite this Article

    Lam, H. C., Choi, A. M., Ryter, S. W. Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface . J. Vis. Exp. (48), e2513, doi:10.3791/2513 (2011).

    Abstract

    Pulmonale Epithelzellen aus den Atemwegen von Mäusen und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) als ein Modell der differenzierten respiratorischen Epithels isoliert werden. Ein Protokoll ist für die Isolierung und die Preisgabe dieser Zellen Mainstream Zigarettenrauch (CS) beschrieben, um epithelialen Zell-Antworten auf CS Exposition zu studieren. Das Protokoll besteht aus drei Teilen: der Isolierung von Epithelzellen der Atemwege von der Maus Luftröhre, die Kultivierung dieser Zellen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) als ausdifferenzierten Epithelzellen und die Lieferung von kalibrierten Mainstream CS, diese Zellen in Kultur. Die ALI Kultur-System ermöglicht die Kultur des respiratorischen Epithelien unter Bedingungen, die mehr ähneln ihren physiologischen Einstellung als gewöhnliche flüssige Kultur-Systemen. Die Untersuchung der molekularen und zellulären Reaktionen auf Lunge CS Exposition ist ein kritischer Faktor für das Verständnis der Auswirkungen von Umweltfaktoren Luftverschmutzung auf die menschliche Gesundheit. Forschungsergebnisse in diesem Bereich kann letztlich zum Verständnis der Ätiologie der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) und andere Tabak-bedingten Krankheiten, die wichtigsten globalen Gesundheitsprobleme darstellen beitragen.

    Protocol

    Die gesamte Protokoll benötigt 2 Tage für Zell-Isolierungen aus tierischem Gewebe, 5-10 Tage für die Zell-Proliferation und eine zusätzliche 10-14 Tage für die Zelldifferenzierung bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Ein weiterer Tag ist für die Zelle Engagements und der Ernte von Proben erforderlich.

    1. Isolierung von Maus Tracheobronchial Epithelzellen (MTEC).

    Hinweis: Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Brigham and Womens Hospital / Harvard Medical School Area.

    Bevor Sie beginnen:

    • Bereiten Ham 's F12 Medien mit Antibiotika. Bis 250 ml Hams F12 Basalmedien (CellGro) add 2,50 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin (10 2 U/mL-10 2 mg / mL) Lösung und 250 mL einer 1000 X Fungizone Lösung. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
    • Bereiten Sie eine Lösung von 0,15% Pronase. Add 15 mg Pronase bis 10 ml Hams F12 Medien mit Antibiotika. Machen Sie frisch und halten auf Eis bis zum Gebrauch.
    • Bereiten Sie eine saubere Arbeitsfläche und sterile OP-Instrumente geeignet für Kleintier-Chirurgie, und eine lamellare Gewebekultur Haube für die Zell-Isolierungen. Alle anderen Geräte gilt als Standard für die tierische Zellkultur einschließlich befeuchteten CO 2-Inkubatoren, kalten Raum, Tisch-Zell-Zentrifugen, das inverse Mikroskop und Einweg-Kunststoff-Pipette und Kultur ware.
    • Bereiten Kollagen I-Lösung (50 pg / mL in 0,02 N Essigsäure). Pipette 1,0 ml Kollagen-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well Transwell-Platte (Corning). Wrap in Parafilm und lassen Sie über Nacht stehen auf einer flachen Oberfläche bei Raumtemperatur.
    1. Mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Mausstamm (dh C57Bl / 6, männlich 6-8 Wochen alt), euthanize Mäusen mit einem anerkannten Methode der Sterbehilfe, wie CO 2-induzierte Narkose. In der Regel 6 Mäusen erbringt genügend Zellen (1.5-2.0 x 10 5 Zellen / Maus) das Seeding einer 12-well Transwell Platte.
    2. Sprühen Sie die Tierkadaver mit 70% EtOH-Lösung, um das Feld zu sterilisieren.
    3. Mit sauberen chirurgischen Schere und Skalpell, entfernen Sie die Haut um die trachealen Bereich, und setzen die Luftröhre. Öffnen Sie den Bauch, entlang des Brustbeins geschnitten, und entfernen Sie den Brustkorb. Entfernen Gewebe bis zum Ende der Luftröhre ausgesetzt ist.
    4. Legen Sie Luftröhre in einen 50 mL konische Röhrchen mit 30 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika, auf Eis.
    5. In einem sterilen lamellar-Haube, Transfer Luftröhrengewebe eine sterile 100 mm Petrischale mit 10 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika.
    6. Sanft sezieren Bindegewebe mit einer sterilen Pinzette und chirurgische Schere.
    7. Transfer Luftröhrengewebe, um eine neue 100 mm Petrischale mit 10 ml Hams F12 Medium mit Antibiotika zu spülen. Cut Luftröhre entlang der vertikalen Achse zu Lumen aussetzen.
    8. Transfer Luftröhre zu einem 50-ml-Tube mit 10 ml 0,15% Pronase-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
    9. Am zweiten Tag haben bereit:
      • Bereiten Sie eine DNAse I-Lösung. Um 18 ml Hams F12 Medien mit Antibiotika 2 mL einer 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung und 10 mg rohes Pankreas DNAse I. mach 1 mL aliquotiert und bei -20 ° C (aufgetaut auf Eis vor der Verwendung).
      • Bereiten Ham 's F12 Medium mit Antibiotika mit 20% fötalem Rinderserum (FBS). Zu 200 ml Hams F12 Basalmedien (Invitrogen) mit 50 mL hitzeinaktiviertem FBS, 2,5 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin (10 2 U/mL-10 2 mg / mL) Lösung und 250 mL einer 1000 X Fungizone Lösung .
      • Bereiten MTEC Basismedium mit Antibiotika. Um 475,5 mL DMEM/F12 basischen Medien (CellGro) add 7,5 ml 1 M HEPES-Lösung, 10 ml 200 mM Glutamin-Lösung, 2 ml einer 7,5% NaHCO 3-Lösung, 5 ml einer 100 X Penicillin / Streptomycin-Lösung, 500 mL einer 1000 X Fungizone Lösung
      • Bereiten MTEC medium/10% FBS. Um 45 ml MTEC grundlegende Medium mit Antibiotika, 5 ml hitzeinaktiviertem FBS.
    10. Schütteln Sie das Rohr (aus Schritt 1.8) 10-12 mal, und dann lassen Sie es für 30-60 Minuten stehen bei 4 ° C.
    11. Fügen Sie 10 ml Hams F12 Medium mit 20% FBS und Antibiotika, um die Röhre und rock 12 mal.
    12. Bereiten Sie 3 15 ml konische Röhrchen mit 10 ml Hams F12 Medium mit 20% FBS und Antibiotika.
    13. Entfernen Luftröhren von Pronase-Lösung, abgesehen von dieser Lösung auf Eis. Transfer Luftröhre zum ersten konischen Rohr mit Hams F12 und das Röhrchen 12 mal. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male.
    14. Kombinieren Sie Pronase-Lösung mit den drei Überstände aus Schritt 1,13 in eine 50 ml Tube. Verbleibende Gewebe.
    15. Zentrifugation bei 1400rpm (390 xg; Eppendorf 5810R-Zentrifuge mit einer A-4 bis 62 Rotor ausgestattet) für 10 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen.
    16. Vorsichtig das Pellet in 1 ml DNAse-Lösung (100-200 ul / Trachea)und inkubieren 5 min auf Eis.
    17. Zentrifugation bei 1400rpm (390 xg) für 5 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen.
    18. Zellpellet in 8 ml MTEC-Medium mit 10% FBS
    19. Platte Zellsuspension auf Primaria Platten (Falcon). Bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO 2 für 5 Stunden (Anmerkung: Dies ist eine negative Selektion Schritt für Fibroblasten).
    20. Sammeln Zellsuspension aus Platten und Spülen Platten zweimal mit 4 ml MTEC mit 10% FBS. Pool Zellsuspension und wäscht in einem 50 mL konischen Rohr.
    21. Conserve 1 mL für Zytospin und Zellzählung. Spin in einer Tischzentrifuge für 5 min bei 5.000 rpm (Eppendorf 5415D). Nehmen Sie 500 mL und Pellet erneut in verbleibende Überstand. Verwenden Sie 100 ul zur Zellzählung mit dem Trypanblau Vitalfärbung Methode. Conserve 4 Aliquots von 100 ul für Zytospin Analyse
    22. Spin restlichen 15 mL Zellsuspension bei 1400rpm (390 xg) bei 4 ° C für 10 min.

    2. Vermehrung und Differenzierung von MTEC Bei Air-Liquid-Interface

    Bereiten Retinsäure Stammlösungen. Stammlösung A: Wiegen Retinsäure in der Dunkelheit (Herr 300,44 g / mol) zu einer 5 mM Stammlösung in 95% EtOH zu machen. Shop in eine Folie eingewickelt Rohr bei -80 ° C. Bei Bedarf bereiten Stammlösung B (5 pM) durch Zugabe von 50 ul Stock A, 500 mL BSA-Lösung (100 mg / mL) und 49,5 ml Hanks balanced salt solution (HBSS). Shop in eine Folie eingewickelt Rohr bei -80 ° C für bis zu 4 Wochen.

    Bereiten MTEC Verbreitung Medium mit Retinsäure. Auf 45,7 mL MTEC Basalmedien Antibiotika enthalten, fügen Sie 2,5 ml hitzeinaktiviertem FBS, 1 ml Retinsäure Lager B, 250 ul Insulin-Lösung (2 mg / ml Insulin in 4 mM HCl), 250 ul Epidermal Growth Factor-Lösung (5 g / mL EGF in HBS mit 1 mg / mL BSA), 200 ul Rinder Hypophysenextrakt (15 mg / mL in HBS mit 1 mg / mL BSA), 50 ul Transferrin-Lösung (5 mg / ml Transferrin in HBS mit 1 mg / mL BSA ), 50 ul Cholera-Toxin-Lösung (100 mg / mL in HBS mit 1 mg / mL BSA). Filter sterilisieren endgültigen Medien Herstellung und Verwendung innerhalb von 2 Tagen der Vorbereitung.

    1. Entfernen Kollagenlösung von Transwell Platten stehen lassen unter der Motorhaube für 5 min, und waschen mit PBS 2 mal.
    2. Nach der Zentrifugation Zellpellet in einem geeigneten Volumen der Proliferation Medien (500 mL), um plating von 7,5 x 10 4 -1,0 x10 5 Zellen pro Vertiefung zu erleichtern. Pipette 500 ul Zellsuspension auf der apikalen Oberfläche der Transwell Polycarbonatmembran einzufügen. Fügen Sie 1,5 ml der Proliferation Medien, um die basale Kompartiment des Transwell.
    3. Inkubieren Sie die versunkenen MTEC Kulturen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 95% Luft, 5% CO 2 für 7-10 Tage.
    4. Warten Sie drei Tage vor wechselnden Medien die erste Zeit. Ändern Medien jeden zweiten Tag. Monitor-Kulturen durch visuelle Inspektion und Messung der transepithelialen Zellwiderstand mit einer Elektrode (EVOM Ohmvoltometer, World Precision Instruments, Sarasota, FL).
    5. Wenn die Zellen konfluent erscheinen und epithelialen Widerstandes erreichte heute 1000 Ω / cm 2, sind die Zellen bereit, bei ALI unterscheiden.
    6. Bereiten MTEC Basalmedien mit 2% NuSerum. Add NuSerum zu MTEC Basismedium zu einer Endkonzentration von 2% V / V. Add Retinsäure Lager B bis zu einer Endkonzentration von 1 x 10 -7 M vor der Verwendung. Bereiten Sie frische und innerhalb von 2 Tagen.
    7. Lassen Sie Zelle für 10-14 Tage zu differenzieren, indem apikalen Medien und Austausch der Basalmedien mit 750 ul MTEC Basalmedien mit 2% Nuserum und Retinsäure. Ändern Sie den Basalmedien und waschen der apikalen Seite mit MTEC mit 2% NuSerum jeden zweiten Tag.

    3. Anwendung von Zigarettenrauch zu Cultured Epithelzellen

    1. Expose der apikalen Seite der Transwell Kulturen Mainstream Zigarettenrauch mit einem CS Zellexposition System (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Siehe Abbildung 1 für Photographie des Apparates. Siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte für technische Spezifikationen. Kurz gesagt, besteht die Vorrichtung aus einer Schlauchpumpe, die jede Zigarette raucht in ~ 7-8 Züge, Zeichnung in den Mainstream Rauch in einem Polypropylen-Linie, die einen belüfteten Exposition Kammer verbunden ist. Die Exposition Kammer bei 37 ° C durch zirkulierendes Wasser, und bei einer Atmosphäre von 5% CO 2 auf eine Gasleitung. Die Zellen können, um den Rauch mit Kentucky 3R4F Forschung Verweis Filterzigaretten (The Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY) ausgesetzt werden. Typischerweise Zellen sind, um den Rauch von 1 bis 2 Zigaretten ausgesetzt, wodurch 100-200 mg / m 3 von insgesamt Feinstaub (TPM). Control-Kulturen werden Raumluft und für ein gleichwertiges Expositionszeit ausgesetzt.
    2. Das TPM ist nach dem Protokoll des Herstellers mit dem TE geliefert gemessen-10c Rauchmaschine (Teague Enterprises). Kurz gesagt, ist ein Filter (Pallflex) in ein Inline-Edelstahl-Halter auf einem Entnahmerohr, der von der Probenahme-Anschluss auf der Räucherkammer, um eine konstante Strömungspumpe (Abtasteinheit) platziert. Ein Abfluss Schlauch verbindet die Abtasteinheit eine Gasuhr (Dry Gas Meter, ONM61, 67, AEM). Der Filter wird vor und nach der Gasentnahme gewogen. Das gesamte Material abgelagert auf dem Filter in mg ist für das Gesamtvolumen der Luftproben normalisiert.
    3. Die Zellen können dann zu jedem Zeitpunkt (dh, 0-24 Uhr) nach der Exposition für Standard-Zell-analytische Verfahren (dh, Western Immunoblot-Analyse, mRNA-Analyse, etc.) oder Mikroskopie (dh, konfokale oder Elektronenmikroskopie) geerntet werden. Die Kulturmedien kann auch für Cytokine oder LDH-Freisetzung für Zytotoxizitätsassays analysiert werden.

    4. Repräsentative Ergebnisse

    Erfolgreiche epithelialen Isolation, Proliferation und Differenzierung bei ALI sollte eine intakte Monolayer mit einem Pflasterstein-Morphologie zu erhalten. Transepithelilal Zellwiderstand von gesunden Kulturen sollten ca. 1000-2000 Ω / cm 2 sein. Abbildung 2 zeigt eine Monoschicht von Maus respiratorischen Epithelzellen für Epithelzellen und Cilien Marker unter Kontrollbedingungen und nach Zigarettenrauch Exposition gefärbt. Abbildung 3 zeigt repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen von gesunden MTEC Kulturen darstellt Ultrastruktur und Zilien Morphologie.

    Abbildung 1
    Abbildung 1. Vorbereitung von Epithelzellen durchläuft drei Phasen, eine Isolierung Schritt, eine Ausbreitung der Bühne, und eine Differenzierung der Bühne an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (Schema). Epithelzellen sind von der Maus Luftröhre, auf Transwells, wo sie sich vermehren in Submerskultur ausgesät isoliert und dann in die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, wo sie in vollem Umfang zu differenzieren umgewandelt. Experimente sind in der Regel am 24. Tag der kontinuierlichen Kultur durchgeführt. Das Bild zeigt ein Modell-System für die Belichtung von kultivierten Zellen zu Mainstream-Zigarette zu rauchen. Ein Transwell ALI Kultur ist innerhalb einer benutzerdefinierten modular Zigarettenrauch Lieferung System, das für Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO 2 gesteuert wird gestellt.

    Abbildung 2
    Abbildung 2 Epitheliale Zellkulturen wurden fixiert und Zellkerne (Hoechst 33258), F-Aktin (grün; Alexa-Fluor-488-konjugierten Phalloidin). Und die Zilien Marker acetyliertes α-Tubulin (rot, Cy3-konjugierten sekundären Antikörper). Die unteren Bilder zeigen gleichwertige Bilder von Epithelzellen 4 Stunden nach der Exposition gegenüber Tabakrauch (2 Zigaretten, 150 mg / m 3). (B) Lactatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung wurde im Basalmedium 24 Stunden nach der Exposition gegenüber unterschiedlichen Dosen von Zigarettenrauch wie angegeben gemessen.

    Abbildung 3
    Abbildung 3. Air-Liquid-Interface Kulturen von Epithelzellen aus der Maus trachealen Epithel isoliert in mehrere Subtypen unterschieden, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) haben die Eigenschaften von Flimmerepithel, basal, und nicht Flimmerzellen 1. Diese Zellen sind typisch pseudostratified respiratorischen Epithels. Abbildung Etiketten entsprechen: bb: Basaltemperatur, a: Axonem, m: Mitochondrien, n: Kern, s: Substrat (Polycarbonat-Membran), mv: microvili

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    Discussion

    Das Protokoll beschreibt Isolierung von Maus tracheale Epithelzellen aus den Protokollen der Sie et al angepasst., 1, und andere 2-3 mit Modifikationen. Wie bei jedem Protokoll beschreibt Zelle Isolationen, ist der wichtigste Aspekt, um eine Verunreinigung durch bakterielle oder pilzliche Erreger durch strikte aseptische Techniken zu vermeiden. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, Fibroblasten-Kontamination der Kulturen, die durch sorgfältige Präparation der Luftröhre vermieden werden können, und negative Selektion, wie in Schritt 1.19 beschrieben zu vermeiden. Vorausgesetzt, dass die Kulturen überwacht werden, gewaschen und das Kulturmedium aufgefüllt jeden zweiten Tag nach der ersten 72 Stunden Inkubationszeit sollten die Kulturen vollständig in etwa zwei Wochen zu unterscheiden von der Einleitung des ALI.

    Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), die weitgehend durch chronische Exposition Zigarettenrauch verursacht wird, weiterhin sind ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem 4-7. COPD ist durch eine progressive Luftstrom Einschränkung zerstörerische alveolären Verlust (Emphysem) und übertriebene entzündliche Reaktionen der Lunge mit Zigarettenrauch 4-7 aus. Eine große Anzahl von Studien haben alveoläre, Bronchien und Atemwege Epithelzelle Systeme verwendet werden, um zu modellieren Lungen-Zell-Reaktionen zu CS versucht. Viele dieser Studien in Epithelzellen oder transformierte Linien (dh Beas-2b) wurden durchgeführt, siehe Lit. 8-11 für Beispiele. Die ALI Transwell Kultur-System ermöglicht die Kultur der pulmonalen Epithelzellen in der Mode, die näher an ihre physiologischen Orientierung in den Atemwegen, als das, was mit herkömmlichen flüssigen (unter Wasser) Kultur 1-3 zur Verfügung gestellt werden kann. Obwohl die vorgestellten Protokoll beschreibt die Anwendung dieses Systems auf Maus tracheale primären Kulturen 1, im Prinzip andere primäre Epithelzellen angewendet werden können (dh, Maus Typ II Epithelzellen, Human bronchialen Epithelzellen, etc.) sein. Die Anwendung von Live-Mainstream-CS auf Zellkulturen stellt ein Modell, das vielleicht mehr sehr nahe Exposition des Menschen gegenüber CS als Anwendung von wässrigen Zigarettenrauch Extrakt (CSE), die üblicherweise in zellulären Studien CS Exposition 12-15 verwendet wird. CSE ist eine lösliche Anteil der Hauptstromrauch, dass viele chemische Bestandteile des gesamten Rauch fehlt. Während die beiden CS Exposition Systeme nur begrenzt aussagefähig sind, hat CSE den Vorteil, leichter kalibriert, da eine einzige Vorbereitung für eine Vielzahl von Experimenten verwendet werden können, und Dosierung ist durch Verdünnung 15-16 erreicht. Auf der anderen Seite, sind wir hier ein Verfahren zur Quantifizierung Hauptstromrauch Übermittlung basierend auf TPM-Messungen. Die Aufklärung der molekularen und zellulären Reaktionen auf Toxinen ausgesetzt, insbesondere CS wie in diesem Artikel veranschaulicht, wird weiter das Verständnis der Auswirkungen der Luftverschmutzung auf die menschliche Gesundheit, insbesondere der Entstehung von chronischen Erkrankungen der Lunge.

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    Disclosures

    Keine Interessenskonflikte erklärt.

    Acknowledgements

    Wir danken Emeka Ifedigbo für technische Unterstützung und Dr. Shivraj Tyagi für wertvolles Know-how. Wir danken auch der Harvard NeuroDiscovery Zentrum für Unterstützung bei der Mikroskopie. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine American Heart Association Predoctoral gewähren 09PRE2250120 zu Hilaire Lam, und NIH Zuschüsse, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, verliehen an AMK Choi unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ham’s F12 Medium 1X Cellgro MT-10-080-CM With L-glutamine
    Pen/strep Lonza Inc. 17-602E
    Pronase Roche Group 10165921001 Streptomyces griseus
    Collagen I BD Biosciences 354236 From rat tail
    Acetic Acid Sigma-Aldrich 338826-25
    DNaseI Sigma-Aldrich DN25-100MG From Bovine Pancreas
    Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605-100 Fraction V
    Retinoic Acid Retinoic Acid R265-50MG
    Hank’s Balanced Salt Solution GIBCO, by Life Technologies 14175 Without Ca++ or Mg++
    DMEM-F12 Cellgro MT-15-090-CM Without L-Glutamine or HEPES
    HEPES, 1M in H2O Sigma-Aldrich 83264-100ML
    L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513-100ML 200 mM
    Amphotericin B (Fungizone) Fisher Scientific 1672346
    Insulin Sigma-Aldrich 16634-50MG Bovine Pancreas
    Apo-transferrin (human) Sigma-Aldrich T1147-100MG
    Cholera toxin Sigma-Aldrich C8052 Vibrio Cholerae
    Epidermal growth factor BD Biosciences 354001 Mouse
    Bovine pituitary Extract BD Biosciences 354123
    NuSerum BD Biosciences 355100
    Transwell Corning 3401 12 mm, 0.4 mm Pore
    Polycarbonate
    Primaria 100 mm culture dish Falcon BD 353803
    Pallflex membrane Pall Corporation EMFAB TX40H120-WW
    Smoking Machine EMI Services ATCSALI-1 see Footnote*

    *The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14"x14"x20" Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2" thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2" size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2’ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.

    This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).

    References

    1. You, Y., Richer, E.J., Huang, T., & Brody, S.L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
    2. Davidson, D.J. et al. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 3 Suppl 2, 59-62 (2004).
    3. Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S.H., Sheppard, D.N., & Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
    4. Rabe, K. F., et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
    5. Macnee W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
    6. Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., & Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
    7. Yao H, Rahman I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
    8. van der Toorn, M., et al. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
    9. Slebos, D.J. et al. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
    10. Kim, H.P., et al. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy 4:7, 887-895 (2008).
    11. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE 3, e3316. (2008).
    12. Okuwa, K., et al., In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. 2009 [Epub ahead of print].
    13. St-Laurent, J., Proulx, L.I., Boulet, L.P., & Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
    14. Watson AM, Benton AS, Rose MC, & Freishtat RJ. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
    15. Rennard, S.I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
    16. Shapiro, S.D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).

    Comments

    2 Comments

    Do MTEC cells also attach on collagen POLYESTER covered inserts ?
    Reply

    Posted by: gianluca t.June 1, 2012, 4:41 PM

    Yes, you can collagen I coat the polyester transwells as described and the cells will attach and grow. There are a few differences between the polycarbonate and polyester membranes. Cells growing on the polyester wells had a higher TER. Upon smoke exposure the cells on the polyester seemed more susceptible to smoking induced cytotoxicity and detached more easily. Finally, there are some protein expression differences I noted early on when I was using both transwells. I do not know how to fully account for these differences, but I think it may have something to do with the way the collagen adheres to the polycarbonate versus polyester. I hope this helps. Good luck!
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    Posted by: Hilaire L.June 2, 2012, 8:20 AM

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