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 JoVE Biology

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

1, 1

1Thermo Scientific NanoDrop Products, Wilmington, Delaware

Article
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    Summary

    O uso de sistemas NanoDrop microvolume como alternativas práticas e eficientes para a metodologia de quantificação de ácidos nucleicos tradicional é descrito através da demonstração de dois protocolos microvolume quantificação de ácidos nucleicos.

    Date Published: 11/22/2010, Issue 45; doi: 10.3791/2565

    Cite this Article

    Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565, doi:10.3791/2565 (2010).

    Abstract

    Ensaios de biomolecular estão continuamente a ser desenvolvido, que utiliza quantidades progressivamente menores de material, muitas vezes impossibilitando o uso de cubeta convencional baseada em instrumentos para quantificação de ácidos nucleicos para aqueles que podem realizar quantificação microvolume.

    O NanoDrop microvolume sistema de retenção de amostra (Produtos NanoDrop Thermo Scientific) funções através da combinação de tecnologia de fibra óptica e propriedades tensão natural da superfície para captar e reter pequenas quantidades de amostra independente de aparelhos de contenção tradicionais, como tinas ou capilares. Além disso, o sistema utiliza comprimentos de caminho mais curto, que resultam em uma ampla gama de medições da concentração do ácido nucléico, essencialmente, eliminando a necessidade de realizar diluições. Reduzindo o volume de amostra necessário para análise espectroscópica também facilita a inclusão de etapas adicionais de controle de qualidade em todo muitos fluxos de trabalho molecular, aumentando a eficiência e, finalmente, levando a uma maior confiança nos resultados a jusante.

    A necessidade de análise de alta sensibilidade fluorescentes de massa limitada também surgiu com os recentes avanços experimentais. Usando a mesma tecnologia de retenção de amostra microvolume, medições fluorescentes pode ser realizada com 2 mL de material, permitindo fluorescentes requisitos ensaios volume a ser reduzido significativamente. Microreactions tais de 10 mL ou menos são agora possíveis através de um fluorospectrometer microvolume dedicados.

    Dois protocolos microvolume quantificação de ácidos nucleicos será demonstrado que o uso de sistemas integrados de retenção de amostra como alternativas práticas para cuvete tradicionais baseados em protocolos. Primeiro, um método de absorção direta A260 usando um espectrofotômetro microvolume é descrito. Isto é seguido por uma demonstração de um método baseado em fluorescência que permite redução de volume reações de fluorescência com uma fluorospectrometer microvolume. Estas novas técnicas permitem a avaliação das concentrações de ácido nucléico que variam de 1 pg / mL a 15.000 ng / mL com o consumo mínimo de amostra.

    Protocol

    1. Microvolume Quantificação de Ácido Nucleico Usando um NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

    1. Para começar, limpar as superfícies superior e inferior óptica do sistema de retenção microvolume espectrofotômetro amostra pipetando 2-3 mL de água deionizada para limpar a superfície inferior óptica.
    2. Fechar o braço de alavanca, garantindo que o pedestal superior entra em contato com a água deionizada. Levante o braço de alavanca e limpe ambas as superfícies ópticas com um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório.
    3. Abra o software NanoDrop e selecione o aplicativo de ácido nucléico. Use um volume pequeno, pipetador calibrado para realizar uma medição em branco, dispensa 1 mL de tampão para a superfície inferior óptica. Abaixe o braço de alavanca e selecione "branco" na aplicação de ácido nucléico.
    4. Uma vez que a medição em branco é completa, limpa ambas as superfícies ópticas com um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório.
    5. Escolha a constante apropriada para o exemplo que está a ser medido.
      Tipo de amostra Selecione Opção Constante Utilizado para Calcular Concentração
      dsDNA DNA-50 50
      ssDNA DNA-33 33
      RNA RNA-40 40
      Oligo Personalizado 15-150
      Tabela 1. Típicos varia de ácido nucléico de concentração para as medidas de absorbância direta A280 usando um NanoDrop microvolume espectrofotômetro, um espectrofotômetro cuvete tradicional baseado usado com uma microcélula TrayCell cuvete, e um fluorospectrometer NanoDrop microvolume em conjunto com o ensaio PicoGreen.
    6. Dispense 1 mL de amostra de ácido nucléico para o pedestal inferior ópticas e fechar o braço de alavanca. Porque a medida é de volume independente, a amostra só precisa preencher a lacuna entre as duas superfícies ópticas para uma medição a ser feita.
    7. Selecione "Measure" no software de aplicação. O software irá calcular automaticamente as taxas de ácido nucléico concentração e pureza. Após medição da amostra, analisar a saída espectral.
    8. O software irá calcular automaticamente as taxas de ácido nucléico concentração e pureza. Após medição da amostra, rever a imagem espectral para avaliar a qualidade da amostra.
    9. Uma amostra de ácido nucleico típico terá um perfil muito característico.
      Figura 1
      Figura 1. Uma amostra de ácido nucleico típico terá um perfil muito característico.
    10. As fontes comuns de contaminantes específicos associados com técnicas de isolamento de ácido nucléico incluem a extração de fenol / Trizol e coluna. No caso da extração de fenol / Trizol, a contaminação do reagente residual pode ser indicado por espectros anormal entre 220-240 nm, bem como por mudanças na região 260-280 nm. Por outro lado, guanidina residual da extração de coluna podem contribuir para um pico próximo 230 nm e uma mudança no cocho de 230 nm a cerca de 240 nm.
      Figura 2
      Figura 2. As mudanças nos picos e depressões das amostras B e C, em comparação com amostra A ilustrar como contaminantes podem afetar os espectros de amostras de ácidos nucléicos.
    11. Para avaliar com precisão a qualidade da amostra, 260/280 ou 260/230 índices deveriam ser analisados ​​em combinação com qualidade espectral global. Pure ácidos nucléicos normalmente produzem uma relação de 260 / 280 ~ 1,8 e uma relação de 260/280 de ~ 2.0 para DNA e RNA, respectivamente. Esta relação é dependente do pH e força iônica do buffer usado para fazer o branco e as medições da amostra. Soluções ácidas será sub-representação da relação por 0,2-0,3, enquanto uma solução básica sobre-representam a razão por 0,2-0,3. Relações pureza significativamente diferentes podem indicar a presença de proteínas, fenol ou outros contaminantes que absorvem fortemente em ou perto de 280 nm. O grau de pureza de 260/230 é uma segunda medida de pureza do DNA com os valores de um ácido nucléico "puro" em geral na faixa de 1,8-2,2. Relações pureza que são significativamente inferiores aos valores esperados podem indicar a técnica de isolamento utilizado pode exigir maior otimização.
    12. Espectrofotômetros NanoDrop também podem ser usados ​​para quantificar proteínas usando absorbância direta ou por ensaios de proteína colorimétrico. Para garantir a formação adequada coluna e reprodutibilidade, 2 mL amostras são aconselhados para as amostras de proteína. Consulte o vídeo JOVE seguinte: Microvolume determinação da concentração de proteínas usando o espectrofotômetro NanoDrop http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

    1. Para demonstrar a alta sensibilidade microvolume quantificação de ácidos nucléicos usando o 3300 NanoDrop, um kit PicoGreen fluorescência é usada. Para começar, equilibrar os padrões do kit e todas as amostras de ácido nucléico à temperatura ambiente. Amostras fluorescentes são sensíveis à luz e deve ser mantido em âmbar ou envolto tubos de alumínio.
    2. Prepare o suficiente 1x tampão TE para todos os padrões e amostras a serem medidos, bem como para a solução PicoGreen de trabalho que serão necessários. Prepare tampão 1xTE diluindo fornecidas 20x tampão TE com água livre de nuclease por protocolo do fabricante. Volumes de reação pode variar de 200 mL para menos de 10 ul. Neste exemplo, 10 volumes de reação mL será preparado.
    3. Prepare série padrão diluídas dsDNA em 2X a concentração final desejada em nuclease livre de frascos ou tubos. Transferir 5 mL de cada um dos padrões dsDNA diluído em um indivíduo rotulado nuclease livre de âmbar ou cobertos de folha de tubo.
    4. ML alíquota 5 de cada amostra de interesse em dsDNA devidamente rotulados âmbar nuclease-free ou folhas cobertas de tubos.
    5. Prepare PicoGreen solução de trabalho de acordo com o protocolo do fabricante. Transferência de um volume igual de solução PicoGreen trabalhando a cada tubo contendo um padrão ou amostra de interesse (5 mL, neste exemplo).
    6. Combine volumes iguais de 1x tampão TE e solução PicoGreen de trabalho para preparar o controle negativo, que serve como uma solução de referência.
    7. Misture o conteúdo de cada tubo de reacção completamente pipetando suave e incubar as reações à temperatura ambiente por 5 minutos. Todos os padrões e as amostras devem ser equilibrados à mesma temperatura antes da medição como sinal de fluorescência é afetado pela temperatura.
    8. Para preparar o instrumento e efectuar medições, primeiro limpe as superfícies inferior e superior do sistema de retenção de amostra. Pipete 2-3 de água deionizada para a menor superfície óptica, feche em seguida, abra o braço de alavanca, e secar os pedestais superior e inferior com um pano limpo, sem fiapos, limpe laboratório. Assegurar as superfícies são livres de fiapos antes de prosseguir como fiapos podem apresentar fluorescência na presença de uma fonte de excitação e pode interferir com a medição.
    9. Abra o software do aparelho, selecione a opção "ácidos nucléicos", aplicação e selecione a opção "PicoGreen-dsDNA" opção.
    10. Para o instrumento em branco, adicionar 2 mL de TE 1x ao menor pedestal, perto do braço, e selecione "Blank" no campo de software instrumento. Uma vez em branco é completa, limpe a solução em branco de ambas as superfícies do sistema de retenção de amostra.
    11. Misturar a solução de referência por pipetagem suave. Usando dicas de retenção baixa, pipeta mL 2 sobre o pedestal inferior e fechar o braço.
    12. Selecione "referência" no tipo de medição, e selecione as unidades desejadas. Clique em "Measure" para iniciar o ciclo de medição.
    13. Quando o ciclo de medição estiver completo, abra o braço e completamente fora da amostra blot superfícies do sistema de retenção. Medir até cinco repetições de referência, utilizando uma nova porção para cada repetição.
    14. Repita o processo para as normas complementares para construir uma curva padrão. Até sete padrões podem ser usados. O software é projetado para armazenar até cinco repetições para cada padrão. Replica das normas são em média para gerar uma curva padrão a partir do qual as concentrações da amostra são determinados automaticamente.
    15. Uma vez que a curva padrão é completo, selecione a opção "Samples" guia, insira as informações ID respectivos amostra e medir cada amostra desconhecida.

    Discussion

    Os protocolos de quantificação aqui apresentados são baseados no mais aceita microvolume sistemas. Tais sistemas fornecem alternativas práticas para a metodologia de quantificação de ácidos nucleicos tradicionais, que contam com maiores volumes de amostra e do uso de aparelhos de contenção.

    NanoDrop microvolume tecnologia emprega um sistema de retenção de amostra que se baseia nas propriedades de tensão de superfície da amostra que está sendo medido para formar uma coluna de líquido. É essencial que a amostra entra em contato com a superfície superior e inferior de medição óptica para a formação de coluna adequada. Se em algum momento os resultados da medição não parece ser preciso ou não reprodutíveis, o mais provável é o resultado da heterogeneidade da amostra ou quebra de coluna líquida.

    Detergentes e álcool isopropílico não são recomendados agentes de limpeza, pois podem descondicionar as superfícies de medição pedestal. Um pedestal incondicionada ocorre quando as propriedades de superfície hidrofóbica do pedestal ter sido comprometida, resultando em um achatamento da gota de amostra. Pedestais incondicionado pode levar à quebra da coluna de líquido durante a medição.

    Figura 3
    Figura 3. Incondicionado superfície é caracterizada por um achatamento de uma gota de água.

    Superfícies pedestal Uncondtioned podem ser recondicionados usando compostos Pedestal NanoDrop Recondicionamento (PR-1, os produtos Thermo Scientific NanoDrop). Uma fina camada de composto de recondicionamento é aplicada às superfícies pedestal superior e inferior, deixa-se secar para ~ 30 segundos, em seguida, esfregou fora de usar um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório. Um estado com sucesso recondicionados é caracterizada por uma gota de água beading acima quando aplicados à superfície pedestal inferior.

    Figura 4
    Figura 4. Recondicionados Uma superfície é caracterizada por uma beading de uma gota de água.

    Sistemas de quantificação Microvolume reduzir significativamente o consumo de amostra e aumentar drasticamente a faixa de concentração, quando comparado aos sistemas de quantificação mais tradicionais. Embora a quantificação microvolume tem freqüentemente se tornado uma tecnologia que permite em circunstâncias envolvendo massa celular limitados, tais como biópsias de agulhas e laser de captura de microdissecção, a eficiência ea facilidade de utilização desta metodologia tornou um alternativas amplamente aceitas para os métodos tradicionais de quantificação de ácidos nucleicos mesmo quando a amostra é abundante.

    Disclosures

    Philippe Desjardins e Debra Conklin são empregados por produtos Thermo Scientific NanoDrop, Inc, que produz os instrumentos utilizados neste artigo.

    Acknowledgements

    Richard W. Beringer e David L. Ash, Aplicações Os cientistas, os produtos NanoDrop Thermo Scientific, de assistência técnica e filmagens.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-2000C
    NanoDrop 3300 Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-3300

    References

    1. Wilfinger, W.W., Mackey, K., & Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474 - 481 (1997).
    2. Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., & Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note, Munich, Germany. (2006).
    3. Ingle Jr, J.D., & Crouch, S.R. Spectrochemical analysis. XV + 590 pp. Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ. (1988).
    4. Van Lancker, M. and Gheyssens, L.C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).

    Comments

    4 Comments

    Por favor, estoy muy interesada en el nanodrop, necesitaria que me enviaran esta pagina traducida al espa&#²41;ol. MUCHAS GRACIAS
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 15, 2011, 3:56 AM

    Hola Conchi,

    Lo sentimos pero no ofrecemos traducciones al texto de nuestros articulos en este momento. Podemos darte un link con una traduccion hecha por Google, http://translate.googleusercontent.com/translate_c?act=url&hl=en&ie=UTF8&prev=_t&rurl=translate.google.com&sl=en&tl=es&twu=1&u=http://www.jove.com/details.php%3Fid%3D²565&usg=ALkJrhg4rISg8npshQi-1l4URzWgN1xnAg y afortunadamente para este video ofrecemos varios idiomas incluyendo español http://www.jove.com/details.php?ID=²894
    -Chris
    Reply

    Posted by: Chris M.April 15, 2011, 8:43 AM

    Which buffer is recommended to be used in this system?
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 8, 2011, 4:58 AM

    hello, i am using nanodrop for measure seweeds DNA, in all samples 260/230 ratio is lower than 1! this means my sample are very dirty? should i need an extra purification of my samples? thanks
    Reply

    Posted by: clementina p.September 4, 2013, 12:48 PM

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