लघु मात्रा जैव कल्पना नैनो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारण

Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).

न्यूक्लिक एसिड quantitation प्रक्रियाओं पिछले तीन दशकों में काफी उन्नत है. अधिक से अधिक, आणविक जीव उनके प्रयोगों के लिए न्यूक्लिक एसिड के नमूने विश्लेषण के अनुरूप छोटे मात्रा की आवश्यकता होती है. BioSpec नैनो गलत, गैर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम, विशेष प्रकाशिकी और एक संवेदनशील पीडीए डिटेक्टर के माध्यम से वर्तमान डीएनए quantitation तरीकों में निहित है, की समस्याओं के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करता है. BioSpec नैनो भी स्वचालित कार्यक्षमता ऐसी है कि बढ़ते हैं, माप, और सफाई के साधन के द्वारा किया जाता है, जिससे फाइबर ऑप्टिक तत्व और मैनुअल सफाई के थकाऊ, दोहराव, और असंगत स्थान को नष्ट करने.

इस अध्ययन में, डेटा डीएनए और प्रोटीन है, माप reproducibility और सटीकता पर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से की मात्रा का ठहराव पर प्रस्तुत किया है. स्वचालित नमूना संपर्क करें और तेजी से स्कैनिंग तीन सेकंड में माप की अनुमति देता है, उत्कृष्ट throughput में जिसके परिणामस्वरूप. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के अंतर्निहित सुविधाओं का उपयोग किया जाता है. डीएनए एकाग्रता की गणना के लिए इस्तेमाल किया फार्मूला है:

नमूना एकाग्रता = लोमो · (OD260 - OD320) · NACF (1)

= नमूना कमजोर पड़ने कारक और NACF = न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता कारक कहाँ लोमो.

न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता कारक ¹ चयनित analyte के अनुसार सेट कर दिया जाता है.

प्रोटीन एकाग्रता परिणामों μg / एमएल के रूप में या moles e280 और आणविक भार मान क्रमशः दर्ज करके / एल के रूप में व्यक्त किया जा सकता है. जब Tyr, टीआरपी और Cysteine ​​(एसएस बंधन) के लिए मूल्यों अवशेषों e280Calc टैब में प्रवेश कर रहे हैं, विलुप्त होने के गुणांक मूल्यों e280 के रूप में की गणना कर रहे हैं = x 5500 (टीआरपी अवशेषों) + x 1490 (Tyr अवशेषों) + x 125 (सिस्टीन एसएस बंधन) . e280 मूल्य एकाग्रता की गणना के लिए सॉफ्टवेयर के द्वारा प्रयोग किया जाता है.

Nucleic एसिड और प्रोटीन की एकाग्रता दृढ़ संकल्प के अलावा, BioSpec नैनो कई अन्य analytes के लिए एक अति सूक्ष्म मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रूप में या एक मानक 5 मिमी pathlength कोशिकाओं का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

1. डीएनए quantitation के लिए प्रक्रिया

1. साधन पर मुड़ें.
2. डेस्कटॉप पीसी से सॉफ्टवेयर BioSpec नैनो खोलें.
3. सरल न्यूक्लिक एसिड dsDNA टैब (चित्रा 1) पर क्लिक करें.
4. सॉफ्टवेयर उपकरण के साथ संचार स्थापित करने और एक initialization अनुक्रम चलेंगे. यह पुष्टि है कि साधन के विनिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन कर रहा है.
5. Pathlength स्लाइडर पर 0.7 या 0.2 मिमी का चयन करें. यह pathlength का चयन और सभी गणना चयनित pathlength पर आधारित हैं.
6. अगले में BioSpec नैनो सॉफ्टवेयर क्लिक करें सेटअप सेटअप - Autowiping. 1 या 2 का चयन करें.
7. पिपेट 2 (0.7 मिमी के लिए) μL ₂ एच ओ या आसन पर बफर.
8. या रिक्त माप के लिए रिक्त F6 क्लिक करें. हर बार एक नया pathlength यह आवश्यक है एक रिक्त रिकॉर्ड करने के लिए चुना है.
9. पिपेट आसन पर 2 नमूने की μL.
10. सॉफ्टवेयर में प्रारंभ करें या लिखत पर शुरू पुश बटन क्लिक करें. अपर खिड़की नमूना छोटी बूंद के साथ संपर्क बनाने की चाल है. क्सीनन चमक मनाया जा सकता है.
11. एक ही नमूना 3 बार दोहराएँ reproducibility निर्धारित.
12. सभी रिकॉर्ड डेटा फ़ाइल के रूप में कली. में सहेजा जाता है.
13. एक pdf या csv फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए pdf / csv या F9 बचाने क्लिक करें. परिणाम यह भी एक. Csv फ़ाइल के रूप में बचाने के टैब में उपयुक्त चयन का उपयोग करके बचाया जा सकता है.

2. प्रोटीन quantitation के लिए प्रोटोकॉल

1. प्रोटीन quantitation टैब का चयन करें (चित्रा 2).
2. विलुप्त होने के गुणांक e280 दर्ज करें, अगर जाना जाता है.
3. यदि e280 ज्ञात नहीं है यह e280Calc का उपयोग कर की गणना.
4. Pathlength स्लाइडर पर 0.7 या 0.2 मिमी का चयन करें.
5. सेटअप - Autowiping सेटअप क्लिक करें. 2 का चयन करें या इसके बाद के संस्करण.
6. पिपेट 3 (0.2 मिमी के लिए) _μL 2 एच ओ या आसन पर बफर .
7. या रिक्त माप के लिए रिक्त F6 क्लिक करें.
8. पिपेट 3 प्रोटीन के नमूने के आसन पर μL.
9. सॉफ्टवेयर में प्रारंभ करें या लिखत पर शुरू पुश बटन क्लिक करें.
10. एक ही नमूना 3 बार दोहराएँ reproducibility निर्धारित.
11. सभी डेटा दर्ज कली. फाइल के रूप में सहेजा जाता है
12. एक pdf या csv फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए pdf / csv या F9 बचाने क्लिक करें.

3. प्रतिनिधि परिणाम:

1. डीएनए quantitation के लिए परिणाम

चित्रा 3 एक विशिष्ट डबल असहाय डीएनए नमूने पर माप से डेटा से पता चलता है. एकाग्रता और आयुध डिपो 260/280 गणना अनुपात भी दिखाए जाते हैं. चित्रा 4 reproducibility के डीएनए quantitation के लिए परीक्षण के परिणाम शामिल हैं. 3 आंकड़े और 4 से पता चलता है परिणाम में डेटा अत्यधिक कम 0.26% के सापेक्ष मानक विचलन से स्पष्ट के रूप में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं.

नोट 1:

डीएनए quantitation में अशुद्धि बफर घटक जो यूवी क्षेत्र में अवशोषित कर सकते हैं की उपस्थिति से पैदा कर सकते हैं. यह भी एक समरूप नमूना समाधान का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. के रूप में किया जा रहा pipetted नमूना की राशि केवल 1-2 μL, किसी भी बुलबुले की शुरूआत के बिना सही मात्रा के सावधान pipetting आवश्यक है.

2. प्रोटीन quantitation के लिए परिणाम

चित्रा 5 प्रोटीन BSA के लिए एकाग्रता विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है. प्रोटीन μg / एमएल एकाग्रता e280 मूल्य पर आधारित है. चित्रा 6 reproducibility के विश्लेषण से पता चलता है. यह 0.51% के सापेक्ष मानक विचलन से स्पष्ट है कि BioSpec नैनो एकाग्रता ठीक उपाय - डीएनए के लिए न केवल, लेकिन यह भी प्रोटीन के लिए.

नोट 2: प्रोटीन एकाग्रता को प्रभावित कारक

प्रोटीन का सटीक एकाग्रता दृढ़ संकल्प संभव है जब वहाँ पीएच, buffers, तापमान, या additives के कारण अस्थिरता से न्यूनतम प्रभाव हैं. हाल शुद्ध प्रोटीन प्रसंस्करण के विभिन्न चरणों के माध्यम से चला जाता है, इसलिए यह संभव है कि प्रोटीन surfactants या अन्य additives है कि छोटी बूंद गठन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं शामिल कर सकते हैं. ऐसे नमूने के लिए, 5 मिमी pathlength क्वार्ट्ज सेल का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है.

चित्रा 1. डबल असहाय डीएनए quantitation के लिए analyte चयन विंडो

चित्रा गैर लेबल प्रोटीन quantitation के लिए analyte 2. चयन विंडो

चित्रा 3 डीएनए quantitation के लिए प्रतिनिधि डेटा

चित्रा 4 डीएनए quantitation के लिए reproducibility डेटा

चित्रा 5 प्रोटीन quantitation के लिए प्रतिनिधि डेटा .

चित्रा 6 प्रोटीन quantitation के लिए reproducibility डेटा .

BioSpec नैनो के लिए वर्तमान डीएनए quantitation तरीकों में निहित असंगत परिणाम और थकाऊ शारीरिक श्रम जैसे मुद्दों को हल किया गया इंजीनियर है. प्रत्येक माप सिर्फ 3 सेकंड लेता है, एक अनुभवी आण्विक जीवविज्ञानी एक मिनट में 3-6 के बारे में कई नमूने का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है. अद्वितीय वाइपर सुविधा न केवल माप के throughput में सुधार, यह भी pedestals के मैनुअल सफाई के लिए जरूरत eliminates, माप के बीच नगण्य carryover में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अलावा, 1000 एनजी / μL युक्त डीएनए नमूने के लिए सिर्फ 2 पोंछे का उपयोग कर परीक्षण carryover संकेत कम से कम 2 एनजी / μL.

5 मिमी pathlength सेल की उपलब्धता पतला nucleic एसिड और प्रोटीन के नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक विकल्प प्रदान करता है और अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस उपकरण का उपयोग फैली.

Suja सुकुमारन, पीएचडी Shimadzu के एक कर्मचारी है जो इस लेख में विशेष रुप से प्रदर्शित साधन बनाता है.

1. Aisubel, F., et al., Short Protocols in Molecular Biology. 4^th edition WILEY (1999).
2. Pace, C. N., et al., How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science, Vol 4, p 2411-2423.

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