Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders

1. Ovarieel dissectie en weefsel isolatie

1. Bereid een 0,5% (w / v) oplossing van natrium-alginaat, bereiden van een gewijzigde versie van het protocol eerder beschreven ^5, met steriele PBS en warmte tot 37 ° C. Meng door inversie of schommelen, maar niet vortex. Teken het alginaat in een 1 ml spuit met een 25 G naald en te handhaven op 37 ° C.
2. Bereid 10 mM steriele CaCl _2-oplossing voor het verknopen van de alginaat op weefsel inkapseling en warm tot 37 ° C.
3. Voor te bereiden 1 ml kweekmedium (αMEM + 5 eenheden penicilline en 5 ug / ml streptomycine) per putje in een 24 wells plaat voor elk experiment. Onder andere verschillende drugs, peptiden, of virussen in het kweekmedium. Voor de transfectie voor orgel inkapseling, incubeer weefsel met Lipofectamine 2000 en plasmide DNA gedurende vier uur bij 37 ° C.
4. Ontleden van de organen van het dier, verwijder het vet of residuele weefsel voorzichtig trek de slijmbeurs membraan rond de eierstokken, en snijd de eierstokken of eileider in vier stukken door halverend het orgel. Dieren werden gedood door de CO ₂ stikken, gevolgd door cervicale dislocatie. Voor de eileider, voorzichtig Rol het weefsel door te trekken uit elkaar aansluiten van de membranen en de uitbreiding van de uiteinden van de buis in tegengestelde richtingen met behulp van een tang voor het snijden.
5. Plaats een alginaat druppel (~ 1-3 pi) op ​​een gesteriliseerde mesh vezel.
6. Met behulp van steriele pincet, verplaatsen van een stuk van orgel in de alginaat druppel en het centrum van de druppel met behulp van een tang of een steriele naald.
7. Omgekeerde de druppel die de orgelwerk (organoid) door het gaas vast te pakken vezel met een steriele pincet en draaien op zijn kop, zodat de zwaartekracht aan het alginaat dwingen in een opknoping druppel.
8. Tik op de tang op de rand van een 10cm petrischaaltje met 10 mM CaCl _2-oplossing, zodat de daling valt in de oplossing.
9. Incubeer gedurende 2 minuten, te verwijderen met steriele lepel met poriën voor extra 10 mM _CaCl2, en breng introductie in het kweekmedium. Tot vier alginaat gels kunnen worden overgebracht in een putje van een 24 wells plaat met daarin het kweekmedium. Cultuur voor een bepaalde periode.

2. Afbraak van alginaat en het verzamelen van cellen

1. Voor de oplosbaarheid van het alginaat gel, incubeer de culturen in alginaat lyase (3,4 mg / ml) opgelost in L-15 Leibovitz de media bij 37 ° C gedurende 30 minuten of tot de gel volledig is opgelost.
2. Verwijder het weefsel van het alginaat lyase.
3. Voor het verzamelen van de OSE, incubeer de organoid met 500 eenheden van collagenase in Leibovitz's L-15 media voor 1 uur ^8. Vortex in 2 seconden pulsen (2 seconden vortex en 2 seconden rust), op middellange vermogen gedurende 1 minuut, gevolgd door een seconde pulsen (1 seconde vortex en een seconde rust) gedurende 1 minuut. Laat orgel stukken vallen naar onderkant van microcentrifugebuis en pipet supernatant naar vers steriel microcentrifugebuis. Centrifugeer 3 minuten bij 3000 rpm te pellet ovariële oppervlakte-epitheel.
4. Voor het verzamelen van de eileiders epitheel, in de lengte snijden de buis en leg ze op weefselkweek plastic in DMEM met 5 eenheden penicilline en 5 ug / ml streptomycine en 4% (v / v) FBS. Gedurende 3-5 dagen, zal cellen "kruipen" uit de eileiders stroma en groeien op weefselkweek plastic9.

3. Fixatie van alginaat ingekapseld orgaan culturen paraffinecoupes

1. Verzamel de alginaat ingekapseld kraal van het kweekmedium bij geselecteerde tijdstip.
2. Recrosslink de alginaat om de gel te verstijven door het droppen van de cultuur in steriele 10 mM CaCl _2-oplossing voor de twee minuten.
3. Bevestig de alginaat ingekapseld orgel in 2% paraformaldehyde die 50 mM sucrose, 10 mM CaCl ₂ en 50 mM natrium-cacodylate om ervoor te zorgen dat de gel blijft solide en volledig inkapselt weefsel tijdens fixatie.
4. Na verwerking van weefsel, embed het hele alginaat-ingekapselde orgelcultuur stuk in paraffine en sectie met een microtoom tot 5 urn secties te genereren.
5. Het alginaat zal worden ontbonden en uit het dia als het uitvoeren van immunohistochemie te wijten aan op basis van antigen retrieval warmte. Het alginaat zal blijven en vlekken voor eosine onder staande hematoxyline en eosine kleuring.

4. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van een drie-dimensionale orgelcultuur van de eierstokken en de eileider is weergegeven in figuur 1. Eierstokken kunnen worden gesneden in verschillende grootte stukken, en OSE vermenigvuldigen en migreren naar de oppervlakte die werd gewond uit de incisie met de scalpel te repareren. Tijdens dit proces, is de juiste oriëntatie van de OSE ten opzichte van de onderliggende stroma gehandhaafd, met een OSE het inkapselen van de eierstok. Zoals weergegeven in figuur 2, de OSE van de eierstokken gehalveerd kapselen de eierstok meer volledig in vergelijking met de eierstokken snijd ze in kwarten of achtsten. De wond herstel van de ovariëleoppervlak kan worden bestudeerd in de context van de gehele eierstok en licht kunnen werpen op hoe de ovulatie en het oppervlak repareren induceert ovariële oppervlak transformatie.

Het eindpunt van het experiment is afhankelijk van de informatie die nodig is. Tissue architectuur, cellulaire morfologie, en specifieke cellulaire groei tarieven zijn eenvoudig gecontroleerd met behulp van paraffine secties. Bijvoorbeeld, is een enkele laag van de ovariële oppervlakte-epitheel waargenomen na kweken in serum-vrij αMEM voor 7 dagen (Figuur 3A), terwijl de toevoeging van 5 ug / ml insuline voor 7 dagen induceert hyperproliferatie van de ovariële oppervlakte-epitheel en de vorming van meerdere lagen cellen (Figuur 3B). Door het toevoegen van broomdeoxyuridine om de culturen in een uiteindelijke concentratie van 10 uM 24 uur voorafgaand aan de fixatie, kan de proliferatie van cellen worden gemeten (inzet 3A en 3B). Voor de culturen onderhouden in serum-vrij αMEM, ongeveer 3-5% van OSE ondergaan proliferatie tijdens de 24 uur etikettering periode (inzet 3A), terwijl een groter percentage van granulosacellen vermenigvuldigen. Toevoeging van insuline aan de cultuur media verhoogt het percentage van de prolifererende OSE tot ongeveer 30% van het totale OSE (inzet 3B). Immunofluorescentie van groen fluorescerend eiwit (GFP) kan gevisualiseerd door het alginaat gel met standaard microscopie worden na transfectie cDNA (figuur 3C). Terwijl alginaat orgelcultuur zorgt voor de groei en de analyse van ovariële oppervlakte-epitheel en primaire follikels, dient te worden opgemerkt dat de rijpe, secundaire follikels niet om te overleven in deze cultuur systeem (Figuur 3D). Cultuur van de individuele follikels tot de vervaldatum in een alginaat hydrogel matrix is elders ¹⁰ beschreven.

Veranderingen in de eiwit-of RNA kan worden geanalyseerd vanuit het gehele orgaan of van specifieke celtypen met behulp van enzymatische afbraak (figuur 4). Behandeling van gekweekte ovariële organoids met collagenase laat de onderliggende stroma intact (figuur 4C) terwijl voor de verrijking van OSE in de cel pellet verkregen na de behandeling, hoewel sommige stromale cellen zijn ook geïsoleerd (Figuur 4D).

Figuur 1. Mouse eierstok drie-dimensionale cultuur-systeem gebruikt om de OSE uitbreiden na verwonding. A) Onder de microscoop zijn de slijmbeurs en de omliggende vet pad verwijderd. B) Intact ovarium (O) met oviductal buis (T) en vet pad (F). C) ovariumcellen met bursa en vet pad verwijderd (links) en ontrolde eileider (rechts). D) ovarium-of oviductal organoids werden geplaatst in een alginaat druppel. E) Alginaat gevat organoids werden gedropt in een CaCl _2-oplossing verknoping van de alginaat om een gel te vormen. F) Alginaat ingekapseld ovarium organoid. G) Alginaat ingekapseld oviductal organoid. H) Alginaat ingekapseld organoids geïncubeerd in kweekmedium.

Figuur 2. Oppervlakte geregenereerd door de eierstokken het oppervlak gemeten door cytokeratine 8. Inkapseling van ovariële organoids door de OSE nadat ze gesneden in achtsten, kwartalen en helften, gekweekt in BSA medium, en gemeten door immunohistochemische analyse met behulp van cytokeratine 8 (CK8) antilichaam.

Figuur 3. Alginaat cultuur systeem maakt het mogelijk doorgang van groeifactoren en transfectie van cDNA in de OSE, maar biedt geen ondersteuning snelle groei en de rijping van follikels. A) Ovarian organoid gekweekt voor 7 dagen in de basale medium geanalyseerd op CK8 expressie, die de OSE merken. Inzet, seriële sectie gekleurd voor BrdU incorporatie. B) Toevoeging van insuline aan het kweekmedium induceert hyperplasie van de OSE. Inzet, seriële sectie gekleurd voor BrdU incorporatie. C) Ovarian organoid getransfecteerd met cDNA om GFP te drukken. D) Alginaat cultuur systeem ondersteunt de groei van primordiale follikels (rode pijlpunt), maar niet volwassen secundaire follikels (zwarte pijl).

Figuur 4. OSE kan geïsoleerd worden voor analyse na cultuur. A) Organoid gekweekt in medium voor maximaal 2 weken. B) Ingekapselde organoid wordt behandeld met alginaat lyase om te vertrekken organoid intact. Eierstok is gekleurd met CK8 te markeren OSE. C) Organoid wordt behandeld met collagenase te scheiden OSE uit de onderliggende stroma. Restmateriaal stuk werd gekleurd met CK8 om de verwijdering van de ovariële oppervlak te markeren. D) zijn verzameld cellen na een behandeling zijn verrijkt voor OSE-als gekleurd voor CK8 (rood). Cellen worden tegengekleurd met DAPI om kernen te markeren.

De ontwikkeling van een driedimensionaal orgelcultuur systeem gebruik te maken van alginaat hydrogelen is een veelzijdige methode voor het analyseren van verschillende soorten weefsel uit een grote verscheidenheid van organismen. Het gebruik van 3D culturen kan worden uitgebreid tot het gebied van tissue engineering en regeneratieve geneeskunde omdat het een steiger waarop cellen kunnen groeien ^11. Momenteel is ons laboratorium die een initiële onderzoek met humane ovarium en eileiders weefsel, maar de cultuur van de menselijke en niet-menselijke primaat follikels is beschreven ^12,13.

Het gebruik van alginaat hydrogels voor cultuur organoids biedt diverse voordelen ten opzichte van andere vormen van hydrogels, zoals die waarin collageen, fibrine, of hyaluronzuur. Alginaat gels bij kamertemperatuur en neutrale pH, waardoor voor kleine verstoring van het weefsel als de gel kapselt de organoid ^14. Alginaat reageert niet met cellulaire eiwitten, die een chemisch inert ondersteuning voor weefselgroei ^5. De gel kan enzymatisch afgebroken met behulp van alginaat lyase, wat niet ten koste van de ingekapselde weefsel, waardoor voor het terugzoeken van gekweekte cellen ^15. Een nadeel van het gebruik van alginaat hydrogels voor drie-dimensionele tissue cultuur is dat de ionische verknoping bieden mechanische ondersteuning voor de hydrogel stabiliteit verliest na verloop van tijd, cultuur noodzakelijk beperkte periode en opnieuw verknoping van de alginaat voorafgaand aan de fixatie ^5. Kritische aspecten van dit protocol zijn behoud van de steriliteit gedurende de cultuur proces, evenals een zorgvuldige ontleding van de ovariële en oviductal weefsel om verstoringen te voorkomen dat het weefsel morfologie.

De eierstok en eileider zijn bijzonder geschikt voor deze methode omdat de eierstokken oppervlakte-epitheel gekweekt op de traditionele celcultuur plastic snel ondergaat epitheliale naar mesenchymale transitie, morfologische veranderingen, en celdood, tenzij vereeuwigd, bijvoorbeeld door expressie van SV40 T / t-antigeen of hTERT ^{16, 17.} Slechte groei van normale OSE op plastic belemmert analyse van potentieel premaligne veranderingen. De orgelcultuur systeem ondersteunt ook de groei van de ovariële oppervlakte-epitheel of oviductal epitheel in contact met de onderliggende stromale cellen, die een rol kunnen spelen in de normale en maligne fysiologie van het cells18. Cultuur van deze weefseltypen in alginaat hydrogelen biedt mechanische ondersteuning aan de driedimensionale architectuur van het weefsel te behouden, terwijl de gel zelf geen interactie met de cellen ^5.

Met behulp van deze methode voor het kweken van ovariële oppervlakte-epitheel of oviductal epitheel maakt voor de analyse van moleculaire en morfologische veranderingen ten gevolge van geïsoleerde manipulaties van de cultuur. Het alginaat hydrogel-systeem maakt een vrije doorgang van de getransfecteerde cDNA, siRNA, en shRNA, maar ook hormonen, en groeifactoren ^19. Terwijl de transiënte transfectie is niet specifiek voor de OSE, omdat dit type cel is aan de buitenkant van de organoid hogere transfectie-efficiëntie is bereikt in de OSE in vergelijking met andere soorten cellen in het binnenste van de eierstokken, zoals granulosacellen. Integratie van broomdeoxyuridine gedurende de cultuur periode labels delende cellen door het bewaken van veranderingen in de cellulaire groei in reactie op de experimentele omstandigheden. Moleculaire veranderingen bij de RNA of eiwit niveau kan dan worden bepaald om mechanismen die leiden tot neoplastische veranderingen toe te lichten.

Hoewel de precieze oorzaak van eierstokkanker is niet bekend, hebben een toename van het aantal van de levensduur van ovulaties blijkt te correleren met een verhoogd risico op eierstokkanker ^20. In vivo analyse van de hypothesen het koppelen van de ovulatie te eierstokkanker biedt vele uitdagingen in het bepalen van de bijdragen van de gonadotrofinen, proliferatie en ontsteking te carcinogenese ^21-23. Alginaat hydrogel cultuur van eierstokken en eileiders kunnen voor geïsoleerde, directe vergelijking van elk van deze componenten in de ovariële oppervlakte epitheel en oviductal epitheel, wat leidt tot nieuwe informatie over het ontstaan ​​van kanker van de eierstokken en de progressie van normale cellen tot tumoren.