JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

1, 1, 2, 1

1Center for Integrative Genomics, University of Lausanne, 2Department of Biology, University of Konstanz

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği tarif

    Date Published: 3/14/2012, Issue 61; doi: 10.3791/2976

    Cite this Article

    Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (61), e2976, doi:10.3791/2976 (2012).

    Abstract

    Antennal lob böcek beyindeki birincil koku alma merkezi ve omurgalı koku ampul 1-5 anatomik ve fonksiyonel eşdeğerini temsil eder. Dış dünyada koku bilgileri de ifade belirli bir koku reseptör bağlı olarak adlandırılan neuropil glomeruli ile farklı bölgelere ayırmak koku sensor nöronları (OSNs) tarafından antennal lob iletilir. Burada olan süreçler hem yerel internöronlardan ile OSN aksonları sinaps (LN), yüksek koku beyin bölgelerine koku bilgi aktarmak çok farklı glomerüller, ve projeksiyon nöronlar (PNS), innerve olabilir.

    Antennal lobda OSNs, LN ve PNS faaliyet Optik görüntüleme - geleneksel sentetik kalsiyum göstergeleri (örneğin kalsiyum yeşil, Fura-2) veya voltaj duyarlı boyalar (örneğin RH414) kullanarak - uzun anlamak için önemli bir teknik olmuştur nasıl koku uyaranlara zamansal ve mekansal desen olarak temsil edilirböcekler 6-10 birçok türde glomerüler faaliyet. Gibi floresan kalsiyum göstergeleri G-Camp 11,12 ve Cameleon 13, biyolüminesens kalsiyum göstergesi GFP-aequorin 14,15 veya sinaptik iletim muhabir olarak genetik olarak kodlanmış nöral aktivitenin gazetecilere, geliştirilmesi, synapto-pHluorin 16 yaptı meyve sineği olfaktör sistemi, nörofizyolojik görüntüleme özellikle erişilebilir Drosophila melanogaster, onun kapsamlı tarif, moleküler elektrofizyolojik ve nöroanatomik özellikleri 2,4,17 tamamlayıcı. Bu gazetecilere seçici koku uyarılmış nasıl yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip incelemek koku devresi içindeki nöronların tanımlanan toplumlarda ikili transkripsiyonel kontrol sistemleri (örneğin GAL4/UAS 18, lexA / LexAop 19,20, Q sistemi 21) ile ifade edilebilir nöral aktivitenin, temsil modüle ve 22-24 dönüşür </> Sup.

    Burada G-KAMPI 25-27 kullanarak Drosophila antennal lobda koku uyarılmış yanıtları ölçmek için hazırlık ve analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Hayvan hazırlık minimal invaziv ve geniş alan, floresan konfokal ve iki foton mikroskoplar kullanılarak görüntüleme adapte edilebilir.

    Protocol

    1. Montaj Blok Meclisi

    1. Pleksiglas montaj bloğu (Şekil 1A) (edinilebilir planı verilen kesin özelliklere göre yapılmalıdır
      http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ) Sineğin Kolay montaj ve diseksiyon izin vermek. Arkasından vidalar vasıtasıyla iplik ancak bloğun ön ötesine uzanmaz; konumlarını (2,7 bakınız) hayvanın hazırlanması sırasında ayarlanacaktır.
    2. Hassas bir matkap kullanarak, bu noktada blok kalınlığının azaltılması, sinek vücudunun yer açmak için yüzeyin altında kazma, sinek için dairesel odasının üst sınır burnunu sürtmek.
    3. Bir neşter dik bir bakır ızgara kesin ve bir "yaka" oluşturmak için yarık altına kapatın. Bu sineğin ekleme yardımcı olacak şekilde iki sonuç kapakları, seviye olduğundan emin olun.
    4. Bir kürdan ile sinek için dairesel odasının üstünde montaj blok üzerine superglue küçük bir damla koyun. Yarık blok (Şekil 1A) üzerine odaklanmaktadır, böylece tutkal ve konumu üzerine bakır ızgara yerleştirin. Hafifçe bastırarak Taşan tutkalı kaldırın. Cımbız ile, her iki tarafta flep altında tutkal küçük damla ve yarık düz aşağıya baktığından böylece bloğun ön üzerinde ızgara katlayın. Izgara üst bloğu ile seviye olduğundan emin olun. Tamamen kurumasını bekleyin.
    5. Bir tel tutucu monte: yarısında plastik bir coverslip kesilmiş ve bir "U" şeklinde yapmak için merkezi bir parça kaldırın. "U" üstünde tutkal tel parçası için balmumu kullanın; kablosu çok gergin yapmazlar.
    6. Antennal kalkanı kurmak: Bir kağıt delik açma ile bir plastik coverslip bir delik olun. 0.5 x 0.7 cm lameller kenarları kesin. Tutkal sonra delip plastik yapışkan bant coverslip ve delikten maruz banda etanol bir damla koyunyapıştırıcı çıkarın.

    2. Hayvan Hazırlık

    1. Uygun genotip Sinekler - yani "sürücü" ve aktivite-muhabiri transgenlerin istenilen kombinasyonu taşıyan - 1-3 haftalık olmalıdır; genç sineklerin tırnak etlerinin çok yumuşak ve zordur. Deneyler ve transgen ekspresyonu düzeylerinin maç için farklı genotipleri doğrudan karşılaştırmalı gerektirdiğinde, sinekler yaşa bağlı fizyolojik farklılıkları önlemek için yaştaki olmalıdır. Cinsiyet önemli değil, biz daha büyük başları vardır ve işlemek için daha kolay olduğundan erkek sineklerin kullanmayı tercih eder.
    2. Buz üzerinde soğutularak sinekler uyutmak.
    3. Montaj blok içine bir sinek tanıtın. Kanat eklemi tarafından sinek tutun ve kaydırın, bakır ızgara yarık boyunca birinci dorsal yüzey, onun boynu (Şekil 1B-C) tarafından askıya böylece. Gerekirse onu aşağı bakıyor kadar döndürün.
    4. F önünde güzel bir kaktüs omurga yerleştirin(Şekil 1B-C) kaçmasını önlemek için ly kafasını. Hareket etmesini önlemek için hortum önüne kaktüsü omurga yerleştirin. Balmumu kullanarak blok kaktüs omurga Fix. Başın üst bloğunun üst seviyede olduğundan emin olun.
    5. Rosin küçük bir damla (etanol içinde çözülmüş) ile blok sineği kafası sabitlemek. Nemlendirilmiş bir kutuya blok yerleştirin ve yaklaşık bir saat sertleşmeye rosin sağlar.
    6. Anten ve kafa arasındaki cuticular kat olarak; forseps kullanarak tutucu (1.5 bakınız balmumu tarafı dışarı) tel ileri antennal plaka çekin ve bırakın. Balmumu ile bloğun ön tutucu sabitleyin.
    7. Blok yerleşik vidaları kullanarak, yavaşça antennal plakası ve kafa arasında biraz boşluk yaratmak için ileri tel tutucu itin.
    8. Merkezi olarak konumlandırılmış deliği ile sinek başının üstünden antennal kalkan (1.6 bakınız) yerleştirin. Montaj bloğun üst balmumu ile tespit edin.
    9. Bir bıçak-splitter, cu kullanmakalkanı bant ta küçük bir delik anten arkasındaki sineğin başının kütikül açığa. Deliği sızmasını önlemek için hazırlanması gözler ötesine olmamalıdır.
    10. Iki bileşenli silikon bant ve üst deri arasındaki deliği kapatın. Sineğin başın üst emdiği silikon çıkarın.
    11. Bir damla yerleştirin Drosophila Ringer kafasına (130 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 36 mM sakaroz, 5 mM HEPES, pH 7.3), tuzlu su. Antenler tamamen kuru kalmalıdır: sızıntı olmadığından emin olun. Bir safir bıçak kullanarak, manikür bir delik kesti. İlk olarak, hafifçe doğrudan anten arkasında cuticular kat boyunca skor, sonra arka gözler boyunca ve ocelli olandı. Son olarak, gol kenar üzerinde kütikula parçasını katlayıp antennal sinirleri Severing önlemek için alt kesti.
    12. Dikkatlice ince cımbızla bezleri ve trakea çıkarın. Drosophila ile tekrar tekrar durulayın

    3. Koku Stimulus Teslimat

    1. Koku şırınga: kovan içine derin pedi itmek için pipet ucu kullanarak, uygun bir çözücü içinde istenildiği gibi seyreltilmiş üstüne temiz forseps ve pipetle (filtresi kullanılarak uçları) koku 20 ul, 2 ml olan bir plastik şırıngaya bir selüloz pedi eklemek . Tak ve kap şırınga istenene kadar. En az 3 ayda bir (veya daha sık yüksek uçucu ve / veya sık kullanılan kokuları için) Taze koku dilüsyonları hazırlanmalı ve yeni pedleri sadece her kayıt oturumu öncesinde koku şırıngalar için hazırlanmalıdır. Koku konsantrasyonu çürümeye olması nedeniyle, üçten fazla uyarımlar için koku pedleri kullanmayın.
    2. Ismarlama olfactometer (Şekil 2): ​​bir birincil hava akımı (1 L / dak) Teflon boru (0,4 mm, iç çap) ile yönlendirilir; yukan Bu tüp çıkış, bir ikincil hava akımı (1 L / dak 27 cm ) ilave edilir. Her iki hava akımları membran pompaları tarafından oluşturulan ve edilmektedirakış hızı, iki bağımsız akış ölçerler tarafından kontrol edilmektedir. Bakım (yani ~% 60 daha fazla) aşırı nemlendirme önlemek için alınması gereken ancak hava akımları, gaz yıkama şişe su geçerek nemlendirilmelidir olabilir. Ikincil hava akışı bir koku şırınga veya boş bir şırınga yoluyla yöneliktir: şırınga piston delip bir şırınga iğne (1,2 mm dış çapı) vasıtasıyla hava akımına bağlanır. Bir valf kontrol ünitesi (örneğin Harvard Apparatus VC6) üzerinden kumanda üç-yollu manyetik vana temiz hava ve koku uyaran arasında geçiş yapmak için kullanılır.

    4. In vivo Imaging'de

    1. Biz 20x su nesnel (örneğin Zeiss W "Planla-Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (Şekil 2) ile donatılmış dik bir floresan mikroskop (örneğin dik duran Sahne Zeiss Axio Examiner D1) kullanılarak burada görüntüleme açıklar. G-Camp (eksitasyon / emisyonu: 488/509 nm) görüntüleme için: 450-490 nm eksitasyon filtresi, aşağıdaki özelliklere sahip bir filtre blok kullanmak, Dikroik ayna (T495LP) ve 500-550 nm emisyon filtresi (Chroma ET). Mikroskop altında sineği içeren yerleştirme bloğu yerleştirin. Sineğin antenlerin önünde olfactometer yaklaşık 0.5 cm çıkış yerleştirin.
    2. Bu sinek kafasına Ringer çözeltisi dokunana kadar objektif indirin. Baş kapsülü deliğe merkezli ve sınırlarını odak vardır; böylece parlak alan aydınlatma altında, pozisyon hazırlama izleyici ile bakıyorum. Eğer etiketli nöronlar (G-Camp bazal yeşil floresan belirginlik) görünceye kadar floresan ışığı geçin ve odağı ayarlayın.
    3. Bir Charge-coupled cihazı ile görüntü alarak ilgi glomerül ince odak (CCD) kamera (örneğin CoolSNAP-HQ2 Dijital Kamera Sistemi) uygun toplama yazılımı (örneğin Metafluor) (Şekil 3A) kullanılarak mikroskop üzerine monte edilmiş. Görüntülü alana ikaz ışığı sınırlamak için aydınlatma ışık yolu diyafram kapatın.
    4. Koku uyarılmış kaydedilmesini içinaktivite, 4 Hz satın hızını ayarlamak ve CCD kamera dinamik aralığında floresans değerlerini elde etmek için pozlama süresini ayarlamak, ancak en az 12-bit dinamik çözünürlüklü, 1000 (keyfi adet), daha düşük değil. Pozlama süresi G-Camp photobleaching azaltmak için, mümkünse, 100 ms geçmemelidir. Kamera uzaysal çözünürlüğü izin veriyorsa, pozlama süresini azaltmak için (bir dijital piksel içine sağlıklı bir yer olacak çip kuyuların sayısı) binning artırabilir. Biz hazırlık 210x135 mikron karşılık 350x225 piksel (2x2 bir binning ile), görüntülerini elde. Bu ayarlar beyazlatma muhabiri sınırlandırarak iyi uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip G-CAMP'ın glomerüler koku kaynaklı yanıtları yakalamak için optimal.
    5. Ölçüm parametreleri ayarlayın. Biz genellikle koku stimulasyonu genellikle satın alma döneminin başlangıcından sonra 4 saniye başlayan (çerçeve 15) ve kalıcı bir saniye (u, 10 saniye (yani 40 kare) için kayıtntil çerçeve 19). Bir sinek hazırlanması normalde sık photobleaching nedeniyle muhabiri floresan sinyali geri dönüşü olmayan bir düşüş sınırlı 25-30 farklı koku uyarılara ile test edilebilir. Inter-uyaran aralığı gözlenen tepki gücü ve photobleaching oranı bağlıdır. Duyusal uyum önlemek için inter-uyarıcı aralığının uygun uzunlukta deneme deneylerde pozitif kontrol koku (biliniyorsa) tekrarlanan sunumu ile yaklaşık belirlenebilir. Bu koku İçerme verilen bir dizi her ~ 10 uyaranlar sürekli canlılık ve hazırlık tutarlı bir yanıt doğrulama izin verebilirsiniz.

    5.. Veri İşleme ve Analizi

    Veri ImageJ (Mac biophotonics plug-in ile kullanılarak işlenir www.macbiophotonics.ca ) ve aşağıdaki gibi Matlab ve Ar özel yazılmış programlar:

    1. Örnek hareket eserler için düzeltin:StackReg / TurboReg en "katı cisim" modunda (kullanarak bir hayvan hazırlama (örneğin 40 karelik her 30 ölçüm) karşılık gelen tüm görüntüleri hizalamak bigwww.epfl.ch / Thevenaz / stackreg ImageJ olarak). Bu adımda ölçümleri arasındaki içinde ve toplama çerçeve ile ilgili olarak etiketlenmiş nöronların pozisyonda kaymalar kaldırmak için gereklidir. Ancak, xy düzleminde vardiya kaldırmak mümkündür. Odak güçlü değişiklik olduğunda Veri atılmalıdır.
    2. Bireysel (40 kare) 10-ikinci ölçümler içine segment yığını.
    3. Eserler beyazlatma için Doğru: floresan ışığına maruz kalma, tek bir ölçüm sırasında 10 çürümeye floresan neden olur. Bazı durumlarda, bu veriler analiz önce bu bozunma düzeltmek için önemlidir. Her ölçüm için bir arka plan çerçevesi hesaplayabilirsiniz. Bu uyaranın başlangıcından (örneğin kare 6-14) önce birkaç kare ortalama olmalıdır. Bu backg tarafından her kare bölüngöreceli floresans değişiklikleri elde etmek çerçeve yuvarlak. G-CAMP etiketli alanı içindeki tüm piksellerin ortalama her kare için ortalama göreceli floresan değerini hesaplayın. Koku yanıt (20 kare bizim durumumuzda uyaranın başlangıcından sonra) zaman uyarıcı ve sıfır ağırlık önce kareye kadar güçlü ağırlık vererek, ortalama floresan eğriye çift üstel sığdır. Her pikselin göreceli floresans eğrisinden takılan eğri çıkarın. Ham verilerin yeniden elde etmek için arka plan çerçevesi tarafından düzeltilmiş çerçeveleri çarpın. Sinyali ölçüm ucunu (inhibitör ya da çok güçlü bir uyarıcı yanıtları uyarılmış durumunda örn) (Şekil 4) ile taban geri değilse düzeltme Bu tür bir yanıt dinamiği bir modifikasyonu yol açabilir. Ağartma eser düzeltme birçok durumda yararlı olmakla beraber, bir ağartıcı düzeltme uygulanması halinde, geçici parametreleri yorumlanması dikkatle yapılmalıdır.
    4. Floresans göreceli değişiklik (& De HesaplaLTA; F / F) (her ölçüm, her kare için F i-F 0) / F F 0 i th çerçevesi için i floresans değeri siluetlerindeki (5.3), ve F 0 * 100, ölçümü.
    5. Aktivite izleri (Şekil 5A) elde etmek için 10 piksel bir çapa sahip bir glomerulus (Şekil 3B) ilgi dairesel bir bölge içinde ortalama mesafe kadar taşınmış / F hesaplamak. Eğer istenirse, ImageJ (Şekil 5A) kullanılarak heatmaps içine bu izleri dönüşümü.
    6. Yanıt zirve sırasında ortalama mesafe kadar taşınmış / dört kare F stimülasyon öncesi ortalama mesafe kadar taşınmış / dört kare F çıkarılarak yanıt tepe genliği hesaplayın. Aynı prosedür mekansal tepkisi kalıpları (bakınız Şekil 3B) ve göstermek için (Şekil 5B bakınız) sinekler boyunca ilgi belirli bölgelerde tepkisi amplitüd ölçmek için hem kullanılır. Pik yanıt da uyaranın saat veya averagin sırasında eğrisinin altındaki alanda entegre ile belirlenebiliryanıtı, maksimum yaklaşık g çerçeveleri.

    6. Temsilcisi Sonuçlar

    Biz OSNs 29,30 birkaç farklı popülasyonlar (aktif koku co-reseptör IR8a için organizatörü kontrolü altında G-28 CaMP1.6 ifade sineklerin propiyonik asit-uyarılmış yanıtları kaydetmek ve analiz etmek için yukarıdaki protokoller Şekil 3-5). % 1 propiyonik asit ile stimülasyonu G-Camp floresans artışlar ortaya çıkarır - hücre içi kalsiyum artışı gösteren - iki glomerüller, DC4 ve DP1l (Şekil 3B) innerve OSNs içinde. Line etkinliği izleri, heatmaps ve tepe yanıtları bir çubuk: Biz Şekil 5'te birden çok sinek veri temsil eden farklı yollar göstermek. Propiyonik asit-uyarılmış yanıtlar DC4 ve DP1l belirgin tepe genlikleri ve zamansal dinamiği var. Yanıtlar genellikle sağlam olmasına rağmen Ayrıca, bireysel hayvanlar arasındaki değişkenlik (o görmek glomerüller hem de görülebiliyorŞekil 5A in atmaps). Tepe yanıtları (Şekil 5B) Kantitasyonu hayvanlar üzerindeki farklı glomerüller ve farklı kokular arasında basit bir istatistik karşılaştırma sağlar. Ancak, koku ile uyarılan kalsiyum yanıtları düzgün olmayan zamansal dinamiği olabilir, ve tek bir değer ile büyüklüğü miktarının bu karmaşıklığı göz ardı edecektir.

    Şekil 1
    Şekil 1. Montaj bloğu şematik sinek tanıtılması ve yakın çekim (C) bir üst bakış (31 uyarlanmıştır) (A) önce ve sonra (B).

    Şekil 2
    Şekil 2. Deneysel set-up şematik.

    Şekil 3
    Şekil 3. Adım 2.8 (sol panel) ve ante ham floresan görüntü sonra sinek hazırlık (A) Üstten görünümnnal loblar G-CaMP1.6 (;: G-CaMP1.6: IR8a organizatörü UAS gal4 Genotip) ile etiketlenmiş. DC4 ve DP1l glomerül sırasıyla bunların morfoloji, boyutu ve konumu ile ayırt edilebilir ve kırmızı ve mavi ile işaretlenmiştir.
    Propionik asit (% 1 v / v) ile cevap (B) Renk kodlu görüntüsü. Görüntünün (aynı zamanda Şekil 5A bakınız) adım 5,6 açıklandığı gibi hesaplanır tepkisinin tepe mesafe kadar taşınmış / F karşılık gelir. Soldaki colorscale% mesafe kadar taşınmış / F değeri belirtir. Siyah daireler (bkz. Şekil 5) yanıtları ölçmek için kullanılan faiz bölgenin konumunu ve boyutunu gösterir.

    Şekil 4
    Şekil 4. Floresan muhabiri sinyal beyazlatma gideriliyor. Adım 5.3 'te tarif edildiği gibi ağartıcı düzeltme etkisi örnekleri. Sol panelde örnek veri tepkisinin şeklinde önemli bir değişiklik olmadan düzeltilebilir. Sağ panelde Örnek verileri ciddi etkiler edilirolasılıkla ağartıcı düzeltme tarafından ed sinyal düşüyor ve koku uyaran sona ermesinden sonra bazal korunduğundan.

    Şekil 4
    Şekil 5 (a) En:. Glomeruli DC4 (sol) ve DP1l (sağ) propionik asit (% 1 v / v) ile kalsiyum tepkilerin zamansal dinamiği. Siyah izleri sekiz hayvanlar arasında ilgi bölgesi (Şekil 3B bakınız) içinde ortalama mesafe kadar taşınmış / F medyan göstermektedir. Gri yüzey dağılımının birinci ve üçüncü kartiller arasındaki aralık gösterir. Ortanca ve çeyrek değerler Sunum ortalama ve standart hata daha değişkenliği ve gözlenen yanıtların dağılımı hakkında daha fazla bilgi sağlar. Yeşil ve kırmızı kutuları kare Şekil 3B gösterilir ve Şekil 5B sayısal tepe yanıtları hesaplamak için ortalama göstermektedir. Alt: heatmaps mesafe kadar taşınmış / F değerleri repr ile, ayrı satırlara tek tek tüm hayvanlar için yanıt verileri göstermekcolorscale (en sağda) tarafından esented. Yatay siyah çubuklar uyaranın zaman ve süresini belirtiniz. (B) DC4 ve DP1l glomerül için sekiz hayvanlar üzerinde propiyonik asit medyan tepe yanıtları. Hata çubukları dağılımının birinci ve üçüncü kartiller arasındaki aralık göstermektedir.

    Discussion

    Burada açıklanan hazırlama ve analiz yöntemleri buna karşılık gelen bir sürücü transgen kullanılabilir olduğu antennal lob (OSNs, LN ve PNS) nöronların herhangi bir popülasyonda koku-uyarılmış yanıtları analiz etmek için kullanılabilir. Bir floresans mikroskobu kullanılarak uygulaması tarif iken, bu hazırlama optik görüntüleme eşit konfokal ya da iki-fotonlu mikroskopi 22,32 kullanılarak gerçekleştirilebilir. Nitekim, bu son araçların nöronların ekspres özellikle çok sayıda gazeteci, görüntülerin çözünürlüğünü azaltabilir geniş alan mikroskobu saçılım problemi hafifletmek. Bu hazırlık, genellikle en az yarım saat koku-uyarılmış cevapların kayıtları izin verir, ama bu kez kaydedilen ölçüm sayısı ve uzunluğuna bağlı olarak önemli ölçüde daha uzun veya daha kısa olabilir, maruz kalma süresi her kare ve inter-stimulus aralığı için kullanılır. Ayrıca, iki-foton uyarması floresan rep photobleaching azaltabilirÖrter yanı sıra, hücresel fototoksisite, uzun zaman periyotları boyunca 22,32 ölçümü izin vermek üzere.

    Ne olursa olsun mikroskop tercih, baş kapsülü içindeki uçucu beyin hareketi birçok problemi de olduğu zaman olduğu gibi hayvanlarda görüntüleme. Düzeltme hareketi küçük sorunları (adım 5.1) düzeltmek mümkün olmakla birlikte, genellikle daha iyi sadece son derece kararlı hazırlıkları kaydetmektir. Hareket artefaktları azaltmak için stratejiler şunlardır: (i) düzgün kaktüs dikeni sineğin probosis kısıtlayıcı, (ii) eicosane (önceki 2.6 adıma) (eicosane de eritilebilir ile sahnede onları sabitleme ile sineğin bacakları immobilizing ~ 37 ° C, bu amaçla havya) ucu genişletmek ve geliştirmek için bir gümüş tel kullanmak, (iii) ince cımbız ile özefagus (antennal sinirler arasındaki görünür) nicklemek.

    Burada kullanılan G-CaMP1.6 ek olarak, G-cAMP ve diğer kalsiyum göstergelerinin optimize versiyonlarını, mevcutonların sinyal-gürültü oranı, bazal floresans ve temporal dinamikleri 12,28,33 hangi farklıdır. Sensörün hassas bir seçim dikkate tüm bu özellikleri, nöron tipi analiz edilecek ve biyolojik söz adreslenen almalıdır. Şu sensörler sağlam sinek nöral aktivitenin optik görüntüleme potansiyelini geliştirmeye devam edecektir belirli genetik sürücü hatları 35 sayısındaki artış ile birleştiğinde aksiyon potansiyelleri 12,34, ve daha da geliştirilmesi ile oldukça iyi bir korelasyon kalsiyum değişiklikleri rapor.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

    Acknowledgements

    Bu yöntem, Şekil 1 'de şematik olarak kullanımı için yerleştirme bloğu tasarımları ve Daniela Pelz çizilmesi için Pablo Traversa geliştirilmesinde Silke Sachse ve Beate Eisermann kabul eder. Biz Silke Sachse'dir Pavan Ramdya ve yazının yorumları için Raphael Rytz minnettarız. R. Bell Boehringer Ingelheim Vakfı Doktora Bursu tarafından desteklenmektedir. R. Benton laboratuvarında Araştırma Bağımsız Araştırmacı Desteği ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı başlayarak bir Avrupa Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmektedir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Cactus spine Garden center ~7mm long thin, not too flexible
    Rosin String instrument shop
    Two component silicon World Precision Instruments, Inc. KWIK-SIL
    Custom made plexiglass mounting block Blueprints available
    Copper grids Athene Grids G220-5 Normally used for electron microscopy samples.
    Screws Hardware store 2 mm diameter
    Plastic coverslips Plano GmbH L4193 22 X 22 mm
    Soldering iron tips Conrad Electronics 830283-62
    Regulated power supply Conrad Electronics 511407-62
    Thin wire Isabellenhütte Isa-ohm 0.013 mm
    Eicosane Sigma-Aldrich 21,927-4
    Microscope Carl Zeiss, Inc. Axioexaminer D1
    CCD camera Visitron Systems CoolSnap HQ
    Metafluor Visitron Systems Acquisition software
    Monochromator Visitron Systems Visichrome
    Breakable blades Fine Science Tools 10050-00
    Holder for blade World Precision Instruments, Inc. 14134
    Sapphire blade World Precision Instruments, Inc. 500314 Double edged blade 1mm
    Membrane gas pumps KNF Neuberger NMP 830 KVE
    Sapphire blade holder World Precision Instruments, Inc. 500317
    Three way valve Lee Company LFAA1200118H Configuration E
    Rotameter 500 ml/min Analyt-MTC 112-08SA
    Rotameter 5 L/min Analyt-MTC 102-08SA
    Beeswax Siladent Technik 209212
    Cellulose pad Kettenbach 31003
    Tweezers Plano GmbH T5130 Dumont biology #5
    Syringes BD Biosciences 300928 2ml, Discardit II, 2pieces
    Needles Braun Sterican 4665120 1.2mm OD

    References

    1. Galizia, C.G. & Rossler, W. Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function. Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).
    2. Vosshall, L.B. & Stocker, R.F. Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila. Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).
    3. Wilson, R.I. & Mainen, Z.F. Early events in olfactory processing. Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).
    4. Masse, N.Y., Turner, G.C., & Jefferis, G.S. Olfactory information processing in Drosophila. Curr. Biol. 19, R700-713 (2009).
    5. Hansson, B.S. & Anton, S. Function and morphology of the antennal lobe: new developments. Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).
    6. Galizia, C.G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., & Menzel, R. A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain. J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).
    7. Galizia, C.G., Menzel, R., & Holldobler, B. Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes. Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).
    8. Okada, K., Kanzaki, R., & Kawachi, K. High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain. Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).
    9. Carlsson, M.A., Knusel, P., Verschure, P.F., & Hansson, B.S. Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones. The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).
    10. Galizia, C.G. & Vetter, R.S. In: Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience). Christensen, T.A., ed., Ch. 13, 349-392, CRC Press, (2005).
    11. Nakai, J., Ohkura, M., & Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
    12. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
    13. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., & Tsien, R.Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).
    14. Martin, J.R., Rogers, K.L., Chagneau, C., & Brulet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2, e275 (2007).
    15. Murmu, M.S., Stinnakre, J., & Martin, J.R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).
    16. Yuste, R., Miller, R.B., Holthoff, K., Zhang, S., & Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release. Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).
    17. Benton, R. Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception. Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).
    18. Elliott, D.A. & Brand, A.H. The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes. Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).
    19. Lai, S.L. & Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
    20. Yagi, R., Mayer, F., & Basler, K. Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).
    21. Potter, C.J., Tasic, B., Russler, E.V., Liang, L., & Luo, L. The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
    22. Wang, J.W., Wong, A.M., Flores, J., Vosshall, L.B., & Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
    23. Fiala, A., et al. Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons. Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).
    24. Ng, M., et al. Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly. Neuron. 36, 463-474 (2002).
    25. Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56, 838-850 (2007).
    26. Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., & Galizia, C.G. The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a). J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).
    27. Silbering, A.F. & Galizia, C.G. Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions. J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).
    28. Reiff, D.F., et al. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
    29. Abuin, L., et al. Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors. Neuron. 69, 44-60 (2011).
    30. Benton, R., Vannice, K.S., Gomez-Diaz, C., & Vosshall, L.B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136, 149-162 (2009).
    31. Pelz, D. Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. PhD thesis, Freien Universitat Berlin, (2005).
    32. Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
    33. Martin, J.R. In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose? Journal of Neurogenetics., 1-23 (2008).
    34. Jayaraman, V. & Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front. Neural Circuits. 1, 3 (2007).
    35. Pfeiffer, B.D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter