在气味诱发反应的钙成像果蝇触角叶

该程序的总体目标是通过细胞内钙变化的光学成像来测量果蝇和触角叶中嗅觉神经元的生理活性。这是通过首先组装安装块、导线支架和天线屏蔽层来实现的。接下来，将表达荧光钙传感器 GCaMP 的果蝇安装并固定在块上。

安装苍蝇后，切掉苍蝇头顶部的角质层以露出触角瓣。该程序的最后一步是将苍蝇放在显微镜下并用气味刺激它。最终，可以获得结果，通过钙传感器 G camp 的相对荧光的记录变化，显示 DLA 天线瓣中气味诱发的活动模式。

该方法可以帮助揭示气味如何在嗅觉回路的不同层次上表示为神经活动的时空模式。与电生理学等其他方法相比，该技术的主要优点是我们可以记录记录电极无法获得的基因鉴定神经元的活动。尽管这种方法可以提供对气味的神经处理的见解。

它也可以应用于 joof 大脑的其他区域，例如听觉和气体系统。首先，将螺钉穿过有机玻璃安装块的背面，使其不会超出正面。使用精密钻头在圆室的上边界上挖出一个凹痕，方法是在表面下挖，以减少块的厚度。

在解剖镜下，用手术刀垂直并靠近狭缝底部切割一个铜网格，以创建一个用于固定苍蝇的项圈。确保得到的两个皮瓣是水平的，因为这将有助于插入苍蝇。用牙签将一小滴强力胶滴在圆形腔室上方的安装块上。

对于飞蝇，将铜网格放在胶水上并定位，使狭缝位于块的中心。轻轻按压网格，然后用镊子去除多余的胶水。在每侧的翻盖下加入小滴胶水，然后将网格折叠在块的前部，使狭缝笔直向下。

确保网格的顶部与块齐平，并让它完全干燥。要制作线架，请将塑料盖片切成两半，然后去掉一个中心部分以形成 U 形。用蜂蜡在 U 的顶部粘上一根电线，这样电线就不会太 t。

使用纸孔打孔器在塑料盖玻片上打孔，构建天线屏蔽层。将盖玻片的边缘修剪为 0.5 x 0.7 厘米。将穿孔的塑料盖玻片粘在胶带上，然后在通过孔暴露的胶带上滴一滴乙醇。

为了去除粘合剂，通过在冰上冷却适当基因型的 1 到 3 周龄的果蝇来麻醉它们。在解剖镜下，通过翼节捡起一只苍蝇，先沿着铜网格滑动它的背表面，使其悬挂在脖子上。如有必要，旋转苍蝇直到它向下看。

在苍蝇的头部前面放一根细的仙人掌刺，以防止它逃脱，并将刺放在长鼻的前面，以防止它移动。用蜂蜡将仙人掌刺固定在块上，确保头顶与块顶部齐平。用一小滴溶解在乙醇中的松香将果蝇的头部固定在块上。

将块放入加湿箱中，让松香硬化约一小时。使用镊子向前拉天线板，将导线支架放在天线和头部之间的表皮褶皱中。用更多的蜂蜡将支架固定在块的前面。

使用块中内置的螺钉，轻轻向前推动导线支架，以在天线板和头部之间留出一些空间。将天线屏蔽罩放在苍蝇的头顶上，整个天线罩位于中央。用蜂蜡将防护罩固定在安装块的顶部。

使用刀片分离器，在防护罩上的胶带上切一个小孔，露出天线后面的苍蝇头角质层。孔不应超出眼睛范围，以防止制剂泄漏。用双组分硅密封胶带和角质层之间的孔。

去除飞头顶部多余的硅。将一滴果蝇林格盐水滴在果蝇的头上，确保没有泄漏并且触角保持完全干燥。使用蓝宝石刀片沿着天线正后方的表皮褶皱轻轻划线。

然后沿着眼睛和背部的 selli 剪开。最后，将一块角质层折叠在刻痕边缘并从底部切下。为避免切断触角神经，请用细镊子小心地去除腺体和气管。

用果蝇林格溶液反复冲洗，在头上留下一大滴。用干净的镊子将纤维素垫插入 2 毫升塑料注射器中。使用过滤的移液器吸头，涂抹 20 微升稀释的加臭剂。

塞住并盖上注射器，直到需要成像。将包含果蝇的支架放在显微镜下。降低物镜，直到它接触到苍蝇头上的振铃液。

在明场照明下通过查看器观察，放置准备工作，使头胶囊中的孔居中，并且其边界清晰可见。切换到荧光灯并调整焦距，直到可以看到标记的神经元，这应该可以从 GCaMP 的基础绿色荧光中明显看出。使用适当的采集软件，使用安装在显微镜上的 CCD 相机采集图像，并聚焦在感兴趣的肾小球上。

确保关闭照明光路中的光圈，以限制激发光到成像区域。将嗅觉计的出口放置在苍蝇天线前约 0.5 厘米处。在这里，在嗅觉感觉神经元启动子的控制下，表达 GCaMP 1.6 的果蝇的肛叶显示在嗅觉感觉神经元的控制下，该启动子在用 1% 丙酸刺激几次肾小球刺激中驱动表达，引起 GAMP 荧光增加，表明细胞内钙的增加，在嗅觉感觉神经元中，支配肾小球，DC 4 和 DP 1 L.肾小球 DC 4 和 DP 1 L 对丙酸的钙反应的时间动态如图所示。

黑色轨迹表示 8 只动物感兴趣区域内 F 与 F 的平均 delta F 的中位数，灰色表面表示分布的第一和第三四分位数之间的范围。下面的热图显示了个体动物的反应。绿色洋红色框表示计算肾小球高于 GCaMP 基线荧光水平的峰值响应的平均帧，并在此处显示量化。

校正荧光报告基因的漂白会对响应产生影响。可以校正左侧面板上的峰样品数据，而不会对响应形状进行重大更改。样本。右侧面板上的数据受到漂白剂校正的严重影响，可能是因为信号下降并在气味刺激终止后保持在基线以下一旦掌握，这项技术可以在大约 30 分钟内完成。

如果执行得当 在尝试此过程时，保持天线完全干燥很重要，否则它们将无法检测到气味。看完这个视频后。您应该对如何准备图像和分析气味有很好的了解。

唤起果蝇的神经元活动。