El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad fisiológica de las neuronas olfativas en la drosophila y el lóbulo de la antena mediante imágenes ópticas de los cambios en el calcio intracelular. Esto se logra ensamblando primero el bloque de montaje, el soporte de cable y el blindaje de la antena. A continuación, se monta una mosca que expresa el sensor de calcio fluorescente GCaMP y se fija al bloque.

Una vez que la mosca está montada, la cutícula en la parte superior de la cabeza de la mosca se corta para exponer los lóbulos de la antena. El paso final del procedimiento es colocar la mosca bajo el microscopio y estimularla con un olor. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran patrones de actividad evocados por el olor en los lóbulos de la antena DLA a través de cambios registrados en la fluorescencia relativa del campo G del sensor de calcio.

Este método puede ayudar a revelar cómo se representan los olores como patrones espaciales y temporales de actividad neuronal en diferentes niveles de los circuitos olfativos. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la electrofisiología es que podemos registrar la actividad de neuronas identificadas genéticamente que no son accesibles para los electrodos de registro. Aunque este método puede proporcionar información sobre el procesamiento neuronal de los olores.

También se puede aplicar a otras regiones del cerebro joof, como el sistema auditivo y el gaseoso. Primero, enrosque los tornillos a través de la parte posterior del bloque de montaje de plexiglás, de modo que no se extiendan más allá de la parte delantera. Use un taladro de precisión para hacer una abolladura en el borde superior de la cámara circular para la mosca cavando debajo de la superficie para reducir el grosor del bloque.

Bajo un telescopio de disección, corta una rejilla de cobre con un bisturí perpendicular y cerca de la parte inferior de la hendidura para crear un collar para sujetar la mosca. Asegúrate de que las dos solapas resultantes estén niveladas, ya que esto ayudará a la inserción de la mosca. Con un palillo, coloque una pequeña gota de superpegamento en el bloque de montaje sobre la cámara circular.

Para la mosca, coloque la rejilla de cobre sobre el pegamento y colóquela de manera que la ranura quede centrada en el bloque. Presione suavemente la rejilla y retire el exceso de pegamento con unas pinzas. Añade pequeñas gotas de pegamento debajo de las solapas de cada lado y dobla la rejilla sobre la parte delantera del bloque para que la hendidura apunte hacia abajo.

Asegúrate de que la parte superior de la rejilla esté nivelada con el bloque y deja que se seque por completo. Para hacer un soporte de alambre, corte un cubreobjetos de plástico por la mitad y retire una pieza central para hacer una forma de U. Use cera de abejas para pegar un trozo de alambre en la parte superior de la U para que el cable no quede demasiado T.

Construya un protector de antena usando una perforadora de papel para hacer un agujero en un deslizamiento de cubierta de plástico. Recorta los bordes del cubreobjetos a 0,5 por 0,7 centímetros. Pegue el deslizamiento de la cubierta de plástico perforado sobre cinta adhesiva y luego coloque una gota de etanol sobre la cinta expuesta a través del orificio.

Para eliminar el adhesivo, anestesia a las moscas de una a tres semanas de edad del genotipo apropiado enfriándolas en hielo. Bajo el telescopio de disección, levante una mosca por la articulación del ala y deslícela primero por la superficie dorsal a lo largo de la rejilla de cobre para que quede suspendida por el cuello. Si es necesario, gire la mosca hasta que mire hacia abajo.

Coloque una espina fina de cactus frente a la cabeza de la mosca para evitar que se escape y coloque la espina frente al sofón para evitar que se mueva. Fija la espina del cactus al bloque con cera de abeja, asegurándote de que la parte superior de la cabeza esté nivelada con la parte superior del bloque. Fije la cabeza de la mosca al bloque con una pequeña gota de colofonia disuelta en etanol.

Coloque el bloque en una caja humidificada y deje que la colofonia se endurezca durante aproximadamente una hora. Con pinzas, tire de la placa de la antena hacia adelante y deje caer el soporte del cable en el pliegue cuticular entre la antena y la cabeza. Fije el soporte a la parte delantera del bloque con más cera de abeja.

Con los tornillos incorporados en el bloque, empuje suavemente el soporte del cable hacia adelante para crear algo de espacio entre la placa de la antena y la cabeza. Coloque el protector de la antena sobre la parte superior de la cabeza de una mosca con el conjunto colocado en el centro. Fije el escudo a la parte superior del bloque de montaje con cera de abeja.

Con un divisor de cuchillas, corte un pequeño agujero en la cinta adhesiva del escudo, exponiendo la cutícula de la cabeza de la mosca detrás de la antena. El orificio no debe extenderse más allá de los ojos para evitar que la preparación se derrame. Selle el orificio entre la cinta y la cutícula con silicona de dos componentes.

Retira el exceso de silicona de la parte superior de la cabeza de la mosca. Coloque una gota de solución salina de Drosophila ringer en la cabeza de la mosca, asegurándose de que no haya fugas y que las antenas permanezcan completamente secas. Con una hoja de zafiro, marque ligeramente a lo largo del pliegue cuticular directamente detrás de la antena.

A continuación, corta a lo largo de los ojos y a lo largo del selli en la espalda. Por último, dobla el trozo de cutícula sobre el borde marcado y córtalo desde la parte inferior. Para evitar cortar los nervios de la antena, retire con cuidado las glándulas y la tráquea con pinzas finas.

Enjuague repetidamente con la solución de timbre de Drosophila, dejando una gota grande en la cabeza. Inserte una almohadilla de celulosa en una jeringa de plástico de dos mililitros con pinzas limpias. Con una punta de pipeta filtrada, aplique 20 microlitros de odorante diluido.

Tape y tape la jeringa hasta que sea necesario para la toma de imágenes. Coloque el soporte que contiene la mosca debajo del microscopio. Baje el objetivo hasta que toque la solución de timbre en la cabeza de la mosca.

Mirando a través del visor bajo iluminación de campo claro, coloque la preparación de modo que el orificio de la cápsula de la cabeza esté centrado y sus bordes estén enfocados. Cambie a luz fluorescente y ajuste el enfoque hasta que pueda ver las neuronas marcadas, lo que debería ser evidente a partir de la fluorescencia verde basal de GCaMP. Adquiera imágenes con una cámara CCD montada en el microscopio utilizando el software de adquisición adecuado y encuentre el enfoque en los glomérulos de interés.

Asegúrese de cerrar el diafragma en la trayectoria de la luz de iluminación para limitar la luz de excitación al área de la imagen. Coloque la salida del olfatómetro aproximadamente 0,5 centímetros delante de las antenas de las moscas. Aquí, los lóbulos anales se muestran en una mosca que expresa GCaMP 1.6 bajo el control de un promotor de neuronas sensoriales olfativas que impulsa la expresión en varios glomérulos La estimulación con ácido propiónico al 1% provoca aumentos en la fluorescencia de GAMP que indica aumentos en el calcio intracelular, en las neuronas sensoriales olfativas, glomérulos inervantes, DC cuatro y DP uno L. Aquí se muestra la dinámica temporal de las respuestas de calcio de los glomérulos DC cuatro y DP uno L al ácido propiónico.

Los trazos negros muestran la mediana de la media delta F sobre F dentro de la región de interés en ocho animales, y la superficie gris indica el rango entre el primer y el tercer cuartil de la distribución. Los mapas de calor a continuación muestran las respuestas de los animales individuales. Los cuadros magenta verdes indican los fotogramas promediados para calcular las respuestas máximas de los glomérulos por encima de los niveles de fluorescencia basales de GCaMP y se muestran cuantificados aquí.

La corrección del blanqueamiento del indicador fluorescente puede tener efectos en la respuesta. Los datos de la muestra de picos en el panel izquierdo se pueden corregir sin cambios importantes en la forma de la respuesta. Muestra. Los datos en el panel derecho se ven gravemente afectados por la corrección de lejía, probablemente porque la señal cae y se mantiene por debajo de la línea de base después de la terminación del estímulo de olor Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unos 30 minutos.

Si se realiza correctamente Al intentar este procedimiento, es importante mantener la antena completamente seca o no podrán detectar olores. Después de ver este video. Debe tener una buena comprensión de cómo preparar la imagen y analizar el olor.

Evoca la actividad neuronal en la mosca de la fruta.