Name: El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende a medir la actividad neuronal olfativa en Drosophila mediante imagen óptica de calcio en el lóbulo antenal. Este método revela patrones espaciotemporales de respuesta a olores.

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Reconocemos Silke Sachse y Beate Eisermann en el desarrollo de esta metodología, Pablo Traversa para la elaboración de los planos de montaje del bloque y Pelz Daniela para el uso del esquema de la Figura 1. Estamos muy agradecidos a Silke Sachse, Ramdya Pavan y Rafael Rytz de comentarios sobre el manuscrito. R. Bell con el apoyo de una Fundación Boehringer Ingelheim doctorado de Becas. La investigación en el laboratorio de R. Benton es financiado por un Consejo Europeo de Investigación Starting Grant Investigador Independiente y el Swiss National Science Foundation.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de preparación y análisis descritos aquí se pueden utilizar para analizar los olores de respuestas evocadas en una población de neuronas en el lóbulo antenal (OSN, LN y PN) para los que un transgén de conducir correspondiente está disponible. Mientras que se describe su aplicación mediante un microscopio de fluorescencia, imágenes ópticas de esta preparación igualmente se puede realizar utilizando microscopía confocal o dos fotones 22,32. De hecho, estos últimos instrumentos aliviar el problema de dispersión de luz de amplio campo de la microscopía, que puede reducir la resolución de las imágenes, especialmente cuando un gran número de neuronas expresa del reportero. Esta preparación por lo general permite grabaciones de olor de respuestas evocadas por lo menos durante media hora, pero esta vez puede ser significativamente más larga o más corta dependiendo de la cantidad y la duración de las mediciones registradas, el tiempo de exposición para cada cuadro y el intervalo entre estímulos. Por otra parte, la excitación de dos fotones puede reducir photobleaching de la representante de fluorescentesorter, así como fototoxicidad celular, para permitir la medición durante períodos de tiempo más largos 22,32. Independientemente de la elección del microscopio, el movimiento del cerebro de la mosca dentro de la cápsula de la cabeza es el problema más recurrente cuando la imagen en animales intactos. Mientras que la corrección de movimiento puede corregir problemas menores (paso 5.1), por lo general es mejor sólo para grabar a partir de preparaciones de gran estabilidad. Las estrategias para reducir los artefactos de movimiento incluyen: (i) debidamente limitar la probóscide de la mosca con la espina de cactus, (ii) la inmovilización de las piernas de la mosca por su fijación en el escenario con eicosano (antes de la etapa 2.6) (eicosano pueden ser disueltos a ~ 37 ° C, use un alambre de plata para ampliar y afinar la punta del soldador para este propósito), (iii) hacer muescas en el esófago (visible entre los nervios de las antenas) con unas pinzas finas. Además de G-CaMP1.6 utiliza aquí, una serie de versiones optimizadas de G-CAMP y otros indicadores de calcio están disponibles,que difieren en su relación señal-ruido, la fluorescencia basal y dinámica temporal 12,28,33. La elección precisa de los sensores deben tener en cuenta todas estas propiedades, el tipo de neuronas a analizar y la cuestión biológica que se aborde. Sensores de corriente de calcio informar de los cambios que se correlacionan bastante bien con los potenciales de acción 12,34, y su mejora, junto con el creciente número de líneas específicas de impulso genético 35 seguirá mejorando el potencial de la imagen óptica de la actividad neuronal en la mosca intacto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cactus columna </td><td> Garden Center </td><td></td><td> ~ 7 mm de largo y delgado, no demasiado flexible </td></tr><tr><td> Colofonia </td><td> Cadena de tienda de instrumentos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dos componentes de silicio </td><td> IPM </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Una medida que se bloque de plexiglás de montaje </td><td> Planos disponibles en <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Redes de cobre </td><td> Atenea Rejillas </td><td> G220-5 </td><td> Normalmente se utiliza para muestras de microscopía electrónica. </td></tr><tr><td> Tornillos </td><td> Ferretería </td&gt; <td></td><td> 2 mm de diámetro </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de plástico </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> Puntas de soldadura de hierro </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Suministro de energía regulada </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Alambre delgado </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eicosano </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Adquisición de software </td></tr><tr><td> Monocromador </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Hojas Rompibles </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Titular de la hoja </td><td> IPM </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire hoja de </td><td> IPM </td><td> 500314 </td><td> Hoja de 1 mm de doble filo </td></tr><tr><td> Las bombas de membrana de gas </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire soporte de la cuchilla </td><td> IPM </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Válvula de tres posiciones </td><td> Lee Company </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configuración de correo </td></tr><tr><td> Rotámetro 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotámetro 5 l / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Cera de abejas </td><td> SILADENT Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Celulosa pad </td><td> Kettenbach Médico </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biología # 5 </td></tr><tr><td> Jeringas </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> Agujas </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 mm de diámetro exterior </td></tr></tbody></table>

el calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el drosophila lóbulo antenal

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

El lóbulo antenal es el principal centro olfativo en el cerebro del insecto, y representa el equivalente anatómico y funcional del bulbo olfatorio de vertebrados 1-5. Información olfativa en el mundo exterior se transmite hasta el lóbulo antenal por las neuronas sensoriales olfativas (OSN), que segregan a regiones distintas de neuropilo llamados glomérulos de acuerdo con el receptor específico olfativa que expresan. En este caso, OSN axones hacen sinapsis con dos interneuronas locales (LN), cuyos procesos pueden inervar muchos glomérulos diferentes, y las neuronas de proyección (SNP), que transmiten la información olfativa a las regiones superiores del cerebro olfativo. Imágenes ópticas de la actividad de la OSN, LNS y RdP en el lóbulo antenal - Tradicionalmente, la utilización de indicadores sintéticos de calcio (por ejemplo, calcio verde, FURA-2) o sensibles al voltaje colorantes (por ejemplo, RH414) - ha sido durante mucho tiempo una técnica importante para entender cómo olfativa estímulos se representan como patrones espaciales y temporalesde la actividad glomerular en muchas especies de insectos 6-10. Desarrollo de organismos genéticamente codificados en la prensa de la actividad neural, tales como los indicadores de calcio fluorescentes G-CAMP 11,12 y 13 Cameleon, el indicador de calcio bioluminiscente GFP-aequorin 14,15, o un reportero de la transmisión sináptica, synapto pHluorin-16 ha hecho que el sistema olfatorio de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular acceso a las imágenes neurofisiológico, como complemento de sus ampliamente descritas las propiedades moleculares, electrofisiológicas y neuroanatómicas 2,4,17. Estos reporteros se expresa selectivamente a través de sistemas binarios de control de transcripción (por ejemplo, GAL4/UAS 18, la serie LEXA / LexAop 19,20, sistema de Q 21) en poblaciones definidas de neuronas dentro del circuito olfatorio para diseccionar con alta resolución espacial y temporal de la forma de olor evoca la actividad neuronal está representado, modularse y transformarse 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Aquí se describen los métodos de preparación y análisis para medir el olor de respuestas evocadas en el lóbulo antenal Drosophila usando G-CAMP 25-27. La preparación de los animales es mínimamente invasivo y se puede adaptar a las imágenes de campo amplio uso de microscopios de fluorescencia, confocal y dos fotones.

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de vida<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

El lóbulo antenal es el centro olfativo primario en el cerebro del insecto y representa el equivalente anatómico y funcional del bulbo olfatorio de los vertebrados...

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad fisiológica de las neuronas olfativas en el lóbulo antenal de Drosophila mediante imágenes ópticas de los cambios intracelulares de calcio. Esto se logra primero ensamblando el soporte del bloque de montaje, el portador de alambre y el escudo de la antena. A continuación, se monta y fija al bloque una mosca que expresa el sensor fluorescente de calcio GCaMP.Una vez que la mosca está montada, se elimina la cutícula de la parte superior de la cabeza de la mosca para exponer los lóbulos antenales. El paso final del procedimiento consiste en colocar la mosca bajo el microscopio y estimularla con un olor. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran patrones de actividad inducidos por olores en los lóbulos antenales DLA mediante los cambios registrados en la fluorescencia relativa del sensor de calcio G camp.Este método puede ayudar a revelar cómo los olores se representan como patrones espaciales y temporales de actividad neuronal en diferentes niveles de la circuitría olfativa. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la electrofisiología es que podemos registrar la actividad de neuronas genéticamente identificadas que no son accesibles a los electrodos de registro. Aunque este método puede proporcionar información sobre el procesamiento neuronal de los olores.También puede aplicarse a otras regiones del cerebro de la mosca, como los sistemas auditivo y gustativo. Primero, pase los tornillos a través de la parte trasera del bloque de sujeción de plexiglás, de modo que no sobresalgan por el frente. Utilice un taladro de precisión para hacer una muesca en el borde superior de la cámara circular para la mosca, cavando bajo la superficie para reducir el grosor del bloque.Bajo un microscopio estereoscópico, corte una rejilla de cobre con un escalpelo perpendicularmente y cerca de la base de la hendidura para crear un collar que sostenga la mosca. Asegúrese de que las dos lengüetas resultantes estén niveladas, ya que esto facilitará la inserción de la mosca. Con un palillo, coloque una pequeña gota de pegamento rápido sobre el bloque de montaje por encima de la cámara circular.Para la mosca, coloque la rejilla de cobre sobre el adhesivo y colóquela de manera que la ranura quede centrada en el bloque. Presione suavemente sobre la rejilla y retire el exceso de adhesivo con un par de pinzas. Añada pequeñas gotas de adhesivo debajo de las solapas en cada lado y doble la rejilla sobre la parte frontal del bloque, de modo que la ranura quede orientada directamente hacia abajo.Asegúrese de que la parte superior de la rejilla esté al mismo nivel que el bloque y deje que se seque completamente. Para fabricar un soporte de alambre, corte un cubreobjetos de plástico por la mitad y retire una pieza central para formar una forma de U. Utilice cera de abejas para pegar un trozo de alambre a través de la parte superior de la U de modo que el alambre no quede demasiado tenso.Construya un escudo de antena utilizando una perforadora de papel para hacer un agujero en una cubierta de plástico. Recorte los bordes de la cubierta hasta 0,5 por 0,7 centímetros. Pegue la cubierta de plástico perforada sobre una cinta adhesiva y luego coloque una gota de etanol sobre la cinta expuesta a través del agujero.Para eliminar el adhesivo, anestesie moscas de uno a tres semanas de edad del genotipo adecuado enfriándolas sobre hielo. Bajo el microscopio estereoscópico, tome una mosca por la articulación del ala y deslícela con la superficie dorsal hacia adelante a lo largo de la rejilla de cobre para que quede suspendida por el cuello. Si es necesario, gire la mosca hasta que mire hacia abajo.Coloque una fina espina de cactus delante de la cabeza de la mosca para evitar que escape y posicione la espina delante del probóscide para impedir que se mueva. Fije la espina de cactus al bloque utilizando cera de abeja, asegurándose de que la parte superior de la cabeza quede al mismo nivel que la parte superior del bloque. Fije la cabeza de la mosca al bloque con una pequeña gota de colofonia disuelta en etanol.Coloque el bloque en una caja humedecida y deje que la resina se endurezca durante aproximadamente una hora. Con pinzas, jale hacia adelante la placa antenal y suelte el soporte de alambre en el pliegue cuticular entre la antena y la cabeza. Fije el soporte al frente del bloque con más cera de abeja.Usando los tornillos incorporados en el bloque, empuje suavemente el soporte del alambre hacia adelante para crear un espacio entre la placa de la antena y la cabeza. Coloque el escudo de la antena sobre la parte superior de la cabeza de la mosca, con el conjunto colocado centralmente. Fije el escudo a la parte superior del bloque de montaje con cera de abejas.Utilizando un divisor de cuchilla, corte un pequeño orificio en la cinta sobre el escudo, exponiendo la cutícula de la cabeza de la mosca detrás de la antena. El orificio no debe extenderse más allá de los ojos para evitar que la preparación se filtre. Selle el orificio entre la cinta y la cutícula con silicona de dos componentes.Elimine cualquier exceso de silicona de la parte superior de la cabeza de la mosca. Coloque una gota de solución salina ringer para Drosophila sobre la cabeza de la mosca, asegurándose de que no haya fugas y de que las antenas permanezcan completamente secas. Utilizando una cuchilla de zafiro, marque ligeramente a lo largo del pliegue cuticular directamente detrás de la antena.Luego, corte a lo largo de los ojos y a través de la silla en la espalda. Finalmente, doble la pieza de cutícula sobre el borde marcado y corte desde el lado inferior. Para evitar seccionar los nervios antenales, retire cuidadosamente las glándulas y la tráquea con pinzas finas.Lave repetidamente con solución de Ringer para Drosophila, dejando una gota grande sobre la cabeza. Inserte una almohadilla de celulosa en una jeringa de plástico de dos mililitros con pinzas limpias. Utilizando una punta de pipeta filtrada, aplique 20 microlitros de odorante diluido.Conecte y tape la jeringa hasta que sea necesaria para la imagen. Coloque el montaje que contiene la mosca bajo el microscopio. Baje el objetivo hasta que toque la solución de Ringer en la cabeza de la mosca.Observando a través del visor con iluminación de campo brillante, coloque la preparación de modo que el orificio en la cápsula cefálica quede centrado y sus bordes estén enfocados. Cambie a luz fluorescente y ajuste el enfoque hasta que pueda ver las neuronas marcadas, que deberían ser evidentes por la fluorescencia verde basal de GCaMP. Adquiera imágenes con una cámara CCD montada en el microscopio utilizando el software de adquisición adecuado y enfoque sobre los glomérulos de interés.Asegúrese de cerrar el diafragma en el trayecto óptico de iluminación para limitar la luz de excitación al área de imagen. Coloque la salida del olfactómetro aproximadamente a 0,5 centímetros frente a las antenas de las moscas. Aquí, los lóbulos anales se muestran en una mosca que expresa GCaMP 1.6 bajo el control de un promotor de neuronas sensoriales olfativas que dirige la expresión en varios glomérulos; la estimulación con ácido propiónico al 1 % provoca aumentos en la fluorescencia de GCaMP, indicando incrementos en el calcio intracelular, en neuronas sensoriales olfativas que inervan los glomérulos DC4 y DP1L. Aquí se muestran las dinámicas temporales de las respuestas de calcio en los glomérulos DC4 y DP1L frente al ácido propiónico.Los trazos negros muestran la mediana de la delta F media sobre F dentro de la región de interés a través de ocho animales, y la superficie gris indica el rango entre el primer y tercer cuartil de la distribución. Los mapas de calor inferiores muestran las respuestas de los animales individuales. Los cuadros magenta con tonalidad verde indican los fotogramas promediados para calcular las respuestas máximas de los glomérulos por encima de los niveles de fluorescencia basal de GCaMP y se muestran cuantificados aquí.La corrección del blanqueo del marcador fluorescente puede tener efectos sobre la respuesta. Los datos del pico de la muestra en el panel izquierdo pueden corregirse sin cambios importantes en la forma de la respuesta. Los datos en el panel derecho se ven gravemente afectados por la corrección del blanqueo, probablemente porque la señal disminuye y se mantiene por debajo de la línea base tras la finalización del estímulo olfativo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente 30 minutos.Si se realiza correctamente, al intentar este procedimiento, es importante mantener la antena completamente seca, ya que de lo contrario no podrá detectar olores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar, imaginar y analizar el olor.Provocar la actividad neuronal en la mosca de la fruta.

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Neurociencia

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