Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

L’objectif général de cette procédure est de mesurer l’activité physiologique des neurones olfactifs chez la drosophile et le lobe de l’antenne par imagerie optique des modifications calciques intracellulaires. Pour ce faire, il suffit d’assembler d’abord le bloc de montage, le support de fil et le bouclier d’antenne. Ensuite, une mouche exprimant le capteur de calcium fluorescent GCaMP est montée et fixée au bloc.

Une fois la mouche montée, la cuticule sur le dessus de la tête de mouche est coupée pour exposer les lobes de l’antenne. La dernière étape de la procédure consiste à placer la mouche sous le microscope et à la stimuler avec une odeur. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des modèles d’activité évoqués par les odeurs dans les lobes de l’antenne DLA grâce aux changements enregistrés de la fluorescence relative du capteur de calcium G camp.

Cette méthode peut aider à révéler comment les odeurs sont représentées sous forme de modèles spatiaux et temporels de l’activité neuronale à différents niveaux du circuit olfactif. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes comme l’électrophysiologie est que nous pouvons enregistrer l’activité de neurones génétiquement identifiés qui ne sont pas accessibles aux électrodes d’enregistrement. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le traitement neuronal des odeurs.

Il peut également être appliqué à d’autres régions du cerveau joof, telles que les systèmes auditif et gazeux. Tout d’abord, vissez les vis à l’arrière du bloc de montage en plexiglas, de manière à ce qu’elles ne dépassent pas de l’avant. Utilisez une perceuse de précision pour faire une entaille dans le bord supérieur de la chambre circulaire pour la mouche en creusant sous la surface pour réduire l’épaisseur du bloc.

Sous une lunette de dissection, découpez une grille de cuivre avec un scalpel perpendiculaire et près du bas de la fente pour créer un collier pour tenir la mouche. Assurez-vous que les deux rabats résultants sont de niveau, car cela facilitera l’insertion de la mouche. À l’aide d’un cure-dent, placez une petite goutte de super colle sur le bloc de montage au-dessus de la chambre circulaire.

Pour la mouche, placez la grille en cuivre sur la colle et positionnez-la de manière à ce que la fente soit centrée sur le bloc. Appuyez doucement sur la grille et retirez tout excès de colle à l’aide d’une pince à épiler. Ajoutez de minuscules gouttes de colle sous les rabats de chaque côté et pliez la grille sur l’avant du bloc de sorte que la fente pointe vers le bas.

Assurez-vous que le haut de la grille est au niveau du bloc et laissez-le sécher complètement. Pour fabriquer un support de fil, coupez un couvercle en plastique en deux et retirez une pièce centrale pour former un U. Utilisez de la cire d’abeille pour coller un morceau de fil sur le dessus du U afin que le fil ne soit pas trop t.

Construisez un bouclier d’antenne à l’aide d’une perforatrice en papier pour faire un trou dans une lamelle en plastique. Coupez les bords de la lamelle de recouvrement à 0,5 x 0,7 centimètre. Collez le couvercle en plastique percé sur du ruban adhésif, puis placez une goutte d’éthanol sur le ruban exposé à travers le trou.

Pour enlever l’adhésif anesthésique, refroidissez des mouches âgées d’une à trois semaines du génotype approprié en les refroidissant sur de la glace. Sous la lunette de dissection, attrapez une mouche par l’articulation de l’aile et faites-la glisser sur sa surface dorsale en premier le long de la grille de cuivre de manière à ce qu’elle soit suspendue par le cou. Si nécessaire, tournez la mouche jusqu’à ce qu’elle regarde vers le bas.

Placez une fine épine de cactus devant la tête de la mouche pour l’empêcher de s’échapper et positionnez la colonne vertébrale devant le probos pour l’empêcher de bouger. Fixez la colonne vertébrale du cactus au bloc à l’aide de cire d’abeille, en vous assurant que le haut de la tête est au niveau du haut du bloc. Fixez la tête de la mouche au bloc avec une petite goutte de colophane dissoute dans de l’éthanol.

Placez le bloc dans une boîte humidifiée et laissez la colophane durcir pendant environ une heure. À l’aide d’une pince, tirez la plaque d’antenne vers l’avant et déposez le support de fil dans le pli cuticulaire entre l’antenne et la tête. Fixez le support à l’avant du bloc avec plus de cire d’abeille.

À l’aide des vis intégrées dans le bloc, poussez doucement le support de fil vers l’avant pour créer un espace entre la plaque d’antenne et la tête. Placez le bouclier d’antenne sur le dessus de la tête d’une mouche avec l’ensemble positionné au centre. Fixez le bouclier sur le dessus du bloc de montage avec de la cire d’abeille.

À l’aide d’un séparateur de lames, découpez un petit trou dans le ruban adhésif sur le bouclier, exposant la cuticule de la tête de mouche derrière l’antenne. Le trou ne doit pas dépasser des yeux pour éviter que la préparation ne fuit. Scellez le trou entre le ruban et la cuticule avec du silicone à deux composants.

Retirez tout excès de silicone du haut de la tête de mouche. Placez une goutte de sérum physiologique de drosophile sur la tête de la mouche, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de fuites et que les antennes restent complètement sèches. À l’aide d’une lame en saphir, marquez légèrement le long du pli cuticulaire directement derrière l’antenne.

Coupez ensuite le long des yeux et à travers les selli sur le dos. Enfin, pliez le morceau de cuticule sur le bord entaillé et coupez par le dessous. Pour éviter de sectionner les nerfs de l’antenne, retirez soigneusement les glandes et la trachée à l’aide d’une pince à épiler.

Rincer à plusieurs reprises avec la solution de Drosophila ringer en laissant une grosse goutte sur la tête. Insérez un tampon en cellulose dans une seringue en plastique de deux millilitres avec une pince propre. À l’aide d’une pointe de pipette filtrée, appliquez 20 microlitres d’odorant dilué.

Branchez et bouchez la seringue jusqu’à ce que vous l’utilisiez pour l’imagerie. Placez le support contenant la mouche sous le microscope. Abaissez l’objectif jusqu’à ce qu’il touche la solution de sonnerie sur la tête de la mouche.

En regardant à travers le visualiseur sous un éclairage en fond clair, positionnez la préparation de manière à ce que le trou de la capsule frontale soit centré et que ses bords soient nets. Passez à la lumière fluorescente et ajustez la mise au point jusqu’à ce que vous puissiez voir les neurones marqués, ce qui devrait être apparent à partir de la fluorescence verte basale de GCaMP. Acquérez des images avec une caméra CCD montée sur le microscope à l’aide d’un logiciel d’acquisition approprié et trouvez la mise au point sur les glomérules d’intérêt.

Assurez-vous de fermer le diaphragme dans le trajet de la lumière d’éclairage pour limiter la lumière d’excitation à la zone imagée. Positionnez la sortie de l’olfactomètre à environ 0,5 centimètre devant les antennes des mouches. Ici, les lobes anaux sont représentés chez une mouche exprimant GCaMP 1.6 sous le contrôle d’un promoteur de neurones sensoriels olfactifs qui détermine l’expression dans plusieurs glomérules La stimulation avec 1 % d’acide propionique suscite des augmentations de la fluorescence GAMP indiquant des augmentations du calcium intracellulaire, dans les neurones sensoriels olfactifs, innervant les glomérules, DC quatre et DP un L.La dynamique temporelle des réponses calciques des glomérules DC quatre et DP un L à l’acide propionique est montrée ici.

Les traces noires montrent la médiane du delta moyen F sur F dans la région d’intérêt chez huit animaux, et la surface grise indique la plage entre le premier et le troisième quartiles de la distribution. Les cartes thermiques ci-dessous montrent les réponses de chaque animal. Les encadrés magenta verdis indiquent les images moyennées pour calculer les réponses maximales des glomérules au-dessus des niveaux de fluorescence de base de GCaMP et sont quantifiées ici.

La correction du blanchiment du rapporteur fluorescent peut avoir des effets sur la réponse. Les données de l’échantillon de pic sur le panneau de gauche peuvent être corrigées sans modifications majeures de la forme de la réponse. Échantillon. Les données sur le panneau de droite sont sévèrement affectées par la correction de l’eau de Javel, probablement parce que le signal chute et est maintenu en dessous de la ligne de base après la fin du stimulus olfactif Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes environ.

Si elle est effectuée correctement Lors de cette procédure, il est important de garder l’antenne complètement sèche, sinon elle ne pourra pas détecter les odeurs. Après avoir regardé cette vidéo. Vous devez avoir une bonne compréhension de la préparation de l’image et de l’analyse des odeurs.

Évoque l’activité neuronale chez la mouche des fruits.