Name: Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Apprenez l'imagerie de calcium optique pour mesurer l'activité neuronale olfactive dans le lobe antennaire de Drosophila melanogaster. Cette méthode révèle les patterns spatiaux et temporels de réponses aux odeurs.

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Nous reconnaissons Silke Sachse et Beate Eisermann dans le développement de cette méthodologie, Pablo Traversa pour dessiner les plans de blocs de montage et Daniela Pelz pour l&#39;utilisation du schéma de la figure 1. Nous sommes reconnaissants à Silke Sachse, Pavan Ramdya et Raphaël Rytz pour les commentaires sur le manuscrit. R. Bell est soutenu par une bourse de la Fondation Boehringer Ingelheim doctorat. Recherche dans le laboratoire de R. Benton est financé par un Conseil européen de la recherche Starting Grant chercheur indépendant et le Fonds national suisse.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les méthodes de préparation et d&#39;analyse décrites ici peuvent être utilisées pour analyser les odeurs réponses évoquées dans une population de neurones dans le lobe antennaire (ARS, LN et PNS) pour lequel un transgène pilote correspondant est disponible. Alors que nous décrivons son application en utilisant un microscope à fluorescence, l&#39;imagerie optique de cette préparation peut également être effectuée en utilisant la microscopie confocale à deux photons ou 22,32. En effet, ces derniers instruments d&#39;atténuer le problème de la diffusion de la lumière à large champ microscopique, ce qui peut réduire la résolution des images, notamment lorsqu&#39;un grand nombre de neurones expresse de la journaliste. Cette préparation permet généralement des enregistrements de mauvaises odeurs réponses évoquées pendant au moins une demi-heure, mais ce temps peut être plus ou moins longtemps selon le nombre et la longueur des mesures enregistrées, le temps d&#39;exposition utilisé pour chaque trame et l&#39;intervalle inter-stimulus. En outre, excitation à deux photons permet de réduire photoblanchiment de l&#39;fluorescente représentantorter, ainsi que de phototoxicité cellulaire, pour permettre la mesure au cours des périodes plus longues 22,32. Peu importe le choix d&#39;un microscope, le mouvement du cerveau à la mouche au sein de la capsule céphalique est le problème le plus récurrent lorsque l&#39;imagerie chez les animaux intacts. Alors que la correction du mouvement peut corriger les problèmes mineurs (étape 5.1), il est généralement préférable que d&#39;enregistrer à partir de préparations très stables. Stratégies visant à réduire les artefacts de mouvement comprennent: (i) bien contraignant la trompe de la mouche avec la colonne vertébrale de cactus; (ii) à immobiliser les jambes de la mouche en les fixant à la scène avec eicosane (avant l&#39;étape 2.6) (eicosane peut être fondu à ~ 37 ° C, utiliser un fil d&#39;argent pour étendre et affiner la pointe du fer à souder à cet effet); (iii) d&#39;entailler l&#39;œsophage (visible entre les nerfs antennaires) avec des pincettes fines. En plus du G-CaMP1.6 utilisé ici, un certain nombre de versions optimisées de G-Camp et indicateurs de calcium d&#39;autres sont disponibles,qui diffèrent par leur rapport signal-bruit, la fluorescence de base et la dynamique temporelle 12,28,33. Le choix précis de la sonde devrait prendre en compte l&#39;ensemble de ces propriétés, le type de neurones à être analysées et la question biologique abordée. Les capteurs de courant signaler les changements de calcium qui se corrèlent assez bien avec les potentiels d&#39;action 12,34, et leur amélioration, associée à un nombre croissant de lignes spécifiques du pilote génétiques 35 continuera d&#39;améliorer le potentiel de l&#39;imagerie optique de l&#39;activité neuronale chez la mouche intacte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Fournisseur </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Cactus colonne vertébrale </td><td> Garden centre </td><td></td><td> ~ 7mm long et mince, pas trop souple </td></tr><tr><td> Colophane </td><td> Instrument à cordes boutique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deux silicium composante </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Custom made bloc de plexiglas de montage </td><td> Blueprints disponibles à partir <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Des grilles de cuivre </td><td> Grilles Athene </td><td> G220-5 </td><td> Normalement utilisé pour les échantillons en microscopie électronique. </td></tr><tr><td> Vis </td><td> Quincaillerie </td&gt; <td></td><td> 2 mm de diamètre </td></tr><tr><td> Lamelles en plastique </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Pointes de fer à souder </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentation régulée </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Mince fil de fer </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Zeiss </td><td> D1 Axioexaminer </td><td></td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Visitron </td><td> Coolsnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Logiciel d&#39;acquisition </td></tr><tr><td> Monochromateur </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Lames cassables </td><td> Outils belle science </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Titulaire de la lame </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire lame </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Double tranchant 1mm </td></tr><tr><td> Les pompes à essence à membrane </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Porte-lame en saphir </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Vanne à trois voies </td><td> Société Lee </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configuration E </td></tr><tr><td> Rotamètre 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotamètre 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Cire d&#39;abeille </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulose pad </td><td> Kettenbach médicale </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pince à épiler </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologie n ° 5 </td></tr><tr><td> Seringues </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> Aiguilles </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1.2mm OD </td></tr></tbody></table>

imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le drosophila lobe antennaire

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Le lobe antennaire est le centre olfactif primaire dans le cerveau des insectes et représente l&#39;équivalent anatomique et fonctionnelle de l&#39;ampoule olfactive des vertébrés 1-5. Olfactive informations dans le monde extérieur est transmise à l&#39;lobe antennaire par olfactifs neurones sensoriels (ARS), qui séparent les régions distinctes de neuropile appelés glomérules selon au récepteur spécifique olfactive ils expriment. Ici, OSN axones font synapse avec les deux interneurones locaux (LNS), dont le processus peut innerver de nombreux glomérules différents, et les neurones de projection (SNP), qui véhiculent l&#39;information olfactive à la hausse des régions du cerveau olfactif. L&#39;imagerie optique de l&#39;activité de ARS, LNS et le PNS dans le lobe antennaire - traditionnellement en utilisant des indicateurs synthétiques de calcium (calcium, par exemple vert, FURA-2) ou la tension des colorants sensibles (par exemple RH414) - a longtemps été une technique importante pour comprendre comment olfactive stimuli sont représentés comme des modèles spatiaux et temporelsde l&#39;activité glomérulaire chez de nombreuses espèces d&#39;insectes 6-10. Développement des organismes génétiquement codés journalistes activité neuronale, comme les indicateurs de calcium fluorescents G-CAMP 11,12 et Cameleon 13, l&#39;indicateur de calcium GFP-aequorine bioluminescente 14,15, ou un journaliste de la transmission synaptique, synapto-pHluorin 16 a fait l&#39; système olfactif de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, particulièrement accessibles à l&#39;imagerie neurophysiologique, complétant ses globale-décrites propriétés moléculaires, électrophysiologiques et neuroanatomiques 2,4,17. Ces journalistes peuvent être sélectivement exprimé par l&#39;intermédiaire des systèmes binaires de contrôle transcriptionnel (par exemple GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q le système 21) dans des populations définies de neurones au sein du circuit olfactif à disséquer avec une résolution spatiale et temporelle élevée comment odeur évoquée l&#39;activité neuronale est représenté, modulé et transformé 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Nous décrivons ici les méthodes de préparation et d&#39;analyse pour mesurer les odeurs réponses évoquées dans le lobe antennaire chez la drosophile à l&#39;aide du G-CAMP 25-27. La préparation animal est minimalement invasive et peut être adapté à l&#39;imagerie en utilisant à grand champ microscopes, confocale et à deux photons.

Nous décrivons une technique mis en place pour mesurer et analyser les odeurs évoquées réponses calciques dans le lobe antennaire de la vie<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

Le lobe antennaire est le centre olfactif primaire du cerveau de l'insecte et représente l'équivalent anatomique et fonctionnel du bulbe olfactif des vertébrés...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité physiologique des neurones olfactifs chez la drosophile et dans le lobe antennaire par imagerie optique des variations de calcium intracellulaire. Cela est réalisé en assemblant d'abord le support de fixation en fil métallique et le bouclier d'antenne. Ensuite, une drosophile exprimant le capteur fluorescent de calcium GCaMP est montée et fixée sur le bloc. Une fois la mouche montée, l'excuticule au sommet de la tête de la mouche est découpée pour exposer les lobes antennaires. La dernière étape de la procédure consiste à placer la mouche sous le microscope et à la stimuler avec une odeur. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant des motifs d'activité induits par l'odeur dans les lobes antennaires DLA, grâce aux variations enregistrées de la fluorescence relative du capteur de calcium G camp.Cette méthode peut aider à révéler comment les odeurs sont représentées sous forme de motifs spatiaux et temporels d'activité neuronale à différents niveaux de la circuitrie olfactive. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, comme l'électrophysiologie, est que nous pouvons enregistrer l'activité de neurones génétiquement identifiés qui ne sont pas accessibles aux électrodes d'enregistrement. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le traitement neuronal des odeurs.Il peut également être appliqué à d'autres régions du cerveau de drosophile, comme les systèmes auditif et visuel. Commencez par insérer les vis à travers l'arrière du bloc de fixation en plexiglas, de sorte qu'elles ne dépassent pas de l'avant. Utilisez une perceuse de précision pour faire une petite indentation dans le bord supérieur de la chambre circulaire destinée à la mouche, en creusant sous la surface afin de réduire l'épaisseur du bloc.Sous un microscope stéréo, couper une grille en cuivre avec un scalpel perpendiculairement et près du fond de la fente afin de créer un collier pour maintenir la drosophile. Veiller à ce que les deux volets résultants soient de niveau, car cela facilitera l'insertion de la drosophile. À l’aide d’un bâtonnet, déposer une petite goutte de colle cyanoacrylée sur le bloc de fixation au-dessus de la chambre circulaire.Pour la mouche, placez la grille en cuivre sur la colle et positionnez-la de manière à ce que la fente soit centrée sur le bloc. Appuyez doucement sur la grille et retirez l'excès de colle à l'aide d'une pince. Ajoutez de minuscules gouttes de colle sous les rabats de chaque côté, puis repliez la grille sur l'avant du bloc de sorte que la fente soit orientée verticalement vers le bas.Veillez à ce que le haut de la grille soit au niveau du bloc et laissez-la sécher complètement. Pour fabriquer un support en fil, coupez une lame de plastique en deux et retirez une partie centrale afin d'obtenir une forme en U. Utilisez de la cire d'abeille pour coller un morceau de fil traversant le haut de la forme U de sorte que le fil ne soit pas trop tendu.Construire un bouclier d'antenne en utilisant un perforateur en papier pour faire un trou dans une lame de plastique. Tailler les bords de la lame à 0,5 sur 0,7 centimètre. Coller la lame de plastique percée sur un ruban adhésif, puis déposer une goutte d'éthanol sur le ruban exposé par le trou.Pour retirer l'adhésif, anesthésiez des mouches âgées d'une à trois semaines et de génotype approprié en les refroidissant sur de la glace. Sous le microscope stéréo, saisissez une mouche par l'articulation de l'aile et faites-la glisser, face dorsale en premier, le long de la grille de cuivre afin qu'elle soit suspendue par le cou. Si nécessaire, faites pivoter la mouche jusqu'à ce qu'elle regarde vers le bas.Placez une fine épine de cactus devant la tête de la mouche pour l'empêcher de s'échapper, et positionnez l'épine devant le proboscis afin d'immobiliser celui-ci. Fixez l'épine de cactus sur le bloc à l'aide de cire d'abeille, en veillant à ce que le sommet de la tête soit aligné avec le haut du bloc. Fixez la tête de la mouche au bloc à l'aide d'une petite goutte de colophane dissoute dans l'éthanol.Placez le bloc dans une boîte humidifiée et laissez la résine durcir pendant environ une heure. À l’aide de pinces, tirez délicatement la plaque anténnaire vers l’avant et insérez le support de fil dans le pli cuticulaire situé entre l’antenne et la tête. Fixez le support à l’avant du bloc à l’aide de cire d’abeille supplémentaire.À l’aide des vis intégrées dans le bloc, pousser doucement le support de fil vers l’avant afin de créer un espace entre la plaque d’antenne et la tête. Placer le blindage d’antenne par-dessus la tête d’un insecte, en le positionnant au centre. Fixer le blindage sur le dessus du bloc de montage à l’aide de cire d’abeille.À l’aide d’un séparateur à lame, découpez un petit trou dans le ruban adhésif sur le bouclier, en exposant la cuticule de la tête de la mouche située derrière l’antenne. Le trou ne doit pas s’étendre au-delà des yeux afin d’éviter toute fuite de la préparation. Scellez le trou entre le ruban adhésif et la cuticule avec du silicone bi-composant.Retirez tout excès de silicone situé au-dessus de la tête de la drosophile. Déposez une goutte de solution saline de Ringer pour drosophile sur la tête de l'insecte, en veillant à ce qu'il n'y ait aucune fuite et à ce que les antennes restent parfaitement sèches. À l’aide d’une lame en saphir, effectuez une légère incision le long du pli cuticulaire situé juste derrière l’antenne.Ensuite, coupez le long des yeux et transversalement sur la selle au niveau du dos. Enfin, repliez le morceau de cuticule par-dessus le bord marqué et coupez par en dessous. Pour éviter de sectionner les nerfs des antennes, retirez soigneusement les glandes et la trachée à l’aide de fines pincettes.Rincez répétitivement avec une solution de Ringer pour Drosophila, en laissant une grande goutte sur la tête. Insérez un tampon en cellulose dans une seringue en plastique de deux millilitres à l’aide de pinces propres. À l’aide d’une pipette filtrante, appliquez 20 microlitres d’odorant dilué.Branchez et capuchonnez la seringue jusqu'à ce qu'elle soit nécessaire pour l'imagerie. Placez la préparation contenant la drosophile sous le microscope. Abaissez l'objectif jusqu'à ce qu'il touche la solution de Ringer sur la tête de la drosophile.En observant à travers l'oculaire en illumination en champ clair, positionnez la préparation de manière à centrer le trou dans la capsule céphalique et à mettre ses bords au point. Passez à l'éclairage fluorescent et ajustez la mise au point jusqu'à ce que vous puissiez voir les neurones marqués, qui doivent être visibles grâce à la fluorescence verte basale du GCaMP. Acquérez des images à l'aide d'une caméra CCD montée sur le microscope en utilisant un logiciel d'acquisition approprié, puis mettez au point sur les glomérules d'intérêt.Veillez à fermer le diaphragme du trajet lumineux d'illumination afin de limiter la lumière d'excitation à la zone imagée. Placez la sortie de l'olfactomètre à environ 0,5 centimètre devant les antennes des mouches. Ici, les lobes anaux sont montrés chez une mouche exprimant GCaMP 1.6 sous le contrôle d'un promoteur de neurone sensoriel olfactif, qui induit l'expression dans plusieurs glomérules. Une stimulation avec de l'acide propionique à 1 % provoque une augmentation de la fluorescence de GCaMP, indiquant une hausse du calcium intracellulaire dans les neurones sensoriels olfactifs innervant les glomérules DC4 et DP1L. Les dynamiques temporelles des réponses calciques des glomérules DC4 et DP1L à l'acide propionique sont illustrées ici.Les tracés noirs montrent la médiane du delta F moyen sur F dans la région d'intérêt, calculée sur huit animaux, et la surface grise indique l'intervalle entre le premier et le troisième quartile de la distribution. Les cartes thermiques ci-dessous montrent les réponses des animaux individuels. Les rectangles magenta teintés de vert indiquent les images moyennées pour calculer les réponses maximales des glomérules par rapport aux niveaux de fluorescence de base de GCaMP, et sont présentés ici sous forme quantifiée.La correction du photoblanchissement du marqueur fluorescent peut avoir des effets sur la réponse. Les données du prélèvement représentées sur le panneau de gauche peuvent être corrigées sans modifications majeures de la forme de la réponse. Les données du panneau de droite sont fortement altérées par la correction du photoblanchissement, probablement parce que le signal diminue et reste inférieur au niveau de base après la fin de la stimulation odorante. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 minutes.Si elle est correctement effectuée, il est important, lors de la réalisation de cette procédure, de maintenir l'antenne parfaitement sèche, faute de quoi elle sera incapable de détecter les odeurs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer, imager et analyser une odeur.Évoquer l'activité neuronale chez la drosophile.

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