Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque

Hall, L., Jude, K. P., Clark, S. L., Wengenack, N. L. Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format. J. Vis. Exp. (52), e3094, doi:10.3791/3094 (2011).

La détection rapide de la résistance antimicrobienne est important dans l'effort pour contrôler l'augmentation de la résistance de Mycobacterium tuberculosis (MTB). Tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) de Vtt a traditionnellement été effectuée par la méthode de la proportion d'agar ou par des essais macrobroth sur un instrument comme le BACTEC (société Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (Diagnostics TREK, Cleveland, OH) ou BacT / ALERTE (bioMérieux, Hazelwood, MO). La méthode des proportions agar-agar, bien que considérées comme "l'or" standard de l'AST, est laborieuse et nécessite le calcul de la résistance en effectuant nombre de colonies sur les médicaments contenant de l'agar par rapport à la drogue sans agar. Si la croissance est ≥ 1% sur le support contenant un médicament par rapport à la drogue sans support, l'organisme est considéré comme résistant à ce médicament. Les méthodes macrobroth besoin d'instrumentation et de test de point de rupture («critique») des concentrations de médicament pour les médicaments de première ligne (isoniazide, éthambutol, la rifampicine, pyrazinamide et l'). La méthode décrite ici est disponible commercialement dans un format 96 plaques de microtitration ainsi [MYCOTB (Diagnostics TREK)] et contient des concentrations croissantes de 12 antimicrobiens utilisés pour le traitement de la tuberculose, y compris à la fois première (isoniazide, rifampicine, éthambutol) et des médicaments de deuxième ligne (amikacine, cyclosérine, éthionamide, kanamycine, la moxifloxacine, ofloxacine, acide para-aminosalicylique, la rifabutine et streptomycine). Pyrazinamide, un médicament de première ligne, n'est pas inclus dans la plaque de microtitration en raison de son besoin de conditions d'essai acide. Avantages du système de microtitration comprennent à la fois facilité d'installation et plus rapidement tourner autour du temps (14 jours) par rapport à la proportion d'agar traditionnelle (21 jours). En outre, la plaque peut être mis en place à partir inoculum préparé en utilisant soit un bouillon ou un milieu solide. Comme le format microplaque est nouveau et depuis Vtt présente des défis uniques de la sécurité dans le laboratoire, ce protocole va décrire de façon sécuritaire l'installation, incuber et de lire la plaque de microtitration.

Chaque laboratoire doit effectuer une évaluation des risques en collaboration avec leur agent de sécurité institutionnel biologique pour déterminer le niveau approprié de biosécurité pour la préparation de l'inoculum et pour le pipetage de l'inoculum dans la plaque. Dans notre laboratoire, nous utilisons de biosécurité de niveau 3 en laboratoire (BSL3) jusqu'à ce que les pratiques des plaques de microtitration sont inoculés, et scellé avec un sceau plastique adhésif. Ces plaques sont ensuite placés dans un sac en plastique, qui est également scellé à la chaleur. La lecture et l'interprétation d'incubation de la microplaque est menée dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2 (BSL2).

1. L'étiquetage des matériaux

1. Etiquette une gélose au sang, trois plaques 7H10, le bouillon Middlebrook 7H9, une solution saline entre billes de verre du tube et une plaque de microtitration AST avec les identifiants appropriés (par exemple, le nom du patient, numéro de dossier médical) dans la BSL2.
2. Étiquette de la gélose sang et 7H10 plaqués comme «vérification de la pureté". Nombre de colonies périodique de l'inoculum est recommandé de s'assurer que la concentration appropriée des organismes est utilisé dans le test. Nombre de colonies lorsqu'elles sont effectuées aurez besoin d'avoir deux des plaques 7H10 étiquetés avec "compter 1 / 1 colonie» et «compter 1 / 50 colonie».

2. Technologue des préparations d'aller dans le BSL3

1. Équipement protecteur personnel approprié est nécessaire pour travailler dans le BSL3 et comprend solide devant robe, se couvrir la tête, des gants, des couvre-chaussures, et un respirateur. Chaque établissement devrait établir son propre plan de protection respiratoire, en collaboration avec l'agent de leur institution d'hygiène industrielle. Dans notre laboratoire, nous avons plusieurs respirateurs disponibles, y compris appareils respiratoires d'épuration d'air (PAPR) et équipé filtre HEPA, N95 demi-masque respiratoire.

3. Préparation de l'enceinte de sécurité biologique

1. Dans le BSL3, préparer l'enceinte de sécurité biologique (BSC) par la désinfection de la surface et placer une serviette en papier imbibée de désinfectant environ 6 pouces à partir du panneau de ventilation d'air.
2. Placer un conteneur à déchets sur la gauche, et nephlometer petites et Vortexer sur la droite.
3. Boucles d'inoculation, pipetors et des conseils sont placés à côté de la serviette en papier.
4. Placer une grille avec l'organisme (en bouillon ou sur milieu solide) et le standard McFarland 0,5 sur la serviette en papier.

4. Calibrage de la néphélomètre

1. Placer un tube de verre entre salins billes dans le néphélomètre et régler l'instrument à zéro en utilisant le blanc salines interpolation.
2. Placez le standard McFarland 0,5 dans le néphélomètre et calibrer selon les instructions du fabricant.

5. Préparation de l'inoculum

1. Travailler dans des colonies de la BSC gratter, de milieu solide à l'aide d'une anse stérile dans le tube entre correctement étiquetés salines de billes de verre jusqu'à ce qu'un ≥ 0,5 McFarland standard est obtenue.
2. Inspecter visuellement l'échantillon, et de comparer à la norme McFarland.
3. Échantillons Vortex pendant 30-60 secondes.
4. Laisser l'inoculum se contenter de 15 minutes (régler une minuterie).

6. L'inoculation de la plaque de microtitration

1. Ajustez l'inoculum avec le bouillon entre saline à l'aide du néphélomètre calibré pour le McFarland 0,5 par pas de 4.1 et 4.2. Ceci doit être complété dans les 30 minutes (les spécifications du fabricant par personne).
2. Utiliser une pipette 200 ul et une pointe d'aérosol LONG pipette résistant à enlever 100 ul d'inoculum de la ^RD TOP 1 / 3 du tube salines perles interpolation. Inoculer le bouillon Middlebrook 7H9. Lentement vortex le bouillon inoculé 7H9 pendant 20 secondes.
3. Retirer la plaque de microtitration AST de l'emballage du fabricant. Ne pas utiliser si le déshydratant est le bleu ou si l'emballage d'aluminium est endommagé.
4. Préparer un tube dilution 1:50 pour une utilisation ultérieure dans la préparation de la dilution 1:50 par pipetage 50 pl d'eau stérile dans un tube stérile.
5. Versez délicatement l'inoculum bouillon 7H9 dans une auge. Éviter de générer des aérosols.
6. Placer la plaque de microtitration AST avec l'étiquette face à vous.
7. Utiliser une pipette à 12 canaux d'ajouter 100 ml de l'inoculum à chaque puits.
8. Préparer des dilutions pour les décomptes de colonies:
   1. La dilution 1 / 1 est préparé à partir du contrôle positif et (H12) en stries une boucle ul sur la plaque de 7H10 étiqueté "1 / 1".
   2. La dilution au 1 / 50 est préparé par inoculation d'une boucle de 1 pl du contrôle positif et (H12) et il tourbillonnant dans le tube avec 50 ul de tubes d'eau préparé ci-dessus. Streak 1 ul de cette dilution à la plaque portant la mention «1 / 50".
9. Inoculer les plaques pureté de l'auge par pipetage 50 ul sur une gélose au sang convenablement étiquetés et la plaque de 7H10 et à balayage pour l'isolement.
10. Placerun joint d'adhésif sur la plaque de microtitration AST. Appuyez fermement sur chaque puits afin d'assurer une étanchéité adéquate en utilisant le dos blanc du phoque. Éviter les plis.
11. Désinfectez la plaque de microtitration en l'essuyant avec une serviette en papier imbibée d'un désinfectant et tuberculocide microplaque placer dans un sac en plastique et fermer avec un sceau de la chaleur ou du ruban adhésif.
    1. Le sac en plastique sert de récipient secondaire pour s'assurer que tous bouillon est contenue devrait y avoir une fuite ou un déversement de la plaque principale.

7. Désinfection des matériaux et des enceintes de sécurité biologique

1. Pour éviter de produire des aérosols, placez un autre bac sur le dessus de la cuvette inoculé avant de le placer délicatement dans le récipient jeter.
2. Désinfecter tout le matériel dont nephlometer, Vortexer, plaques, tubes, etc par les essuyer avec un désinfectant tuberculocide et attendre le moment approprié pour assurer la désinfection conformément aux instructions du fabricant avant de retirer du BSC. Par exemple, Prospray, le désinfectant tuberculocide que nous utilisons, il faut 15 minutes pour tuer les mycobactéries.
3. Placez le récipient jeter dans un sac de Biohazard et sceller avant l'autoclavage.

8. D'incubation

1. Les plaques doivent être incubés avec les médias vers le bas et les soins devraient être prises pour éviter de renverser ou à des éclaboussures de liquide.
2. Incuber la plaque AST plaque de microtitration, 7H10 et une gélose au sang dans un incubateur à 35-37 ° C avec 5-10% de CO ₂ avec 5-10% de CO ₂ dans le laboratoire de BSL2.
   1. Dans notre laboratoire, ce qui est acceptable parce que la plaque est bien fermé et à l'intérieur d'un sac plastique scellé.
3. Pas plus de 2 plaques de microtitration AST doivent être empilés dans l'incubateur selon les instructions du fabricant.

9. Les résultats représentatifs

Scellé AST microplaques peuvent être lus manuellement à l'aide d'un miroir comme une aide ou avec un lecteur de plaque automatisés tels que l'Vizion (Diagnostics TREK). Les plaques peuvent être examinés dès que 7 jours après l'inoculation. Examiner les puits de contrôle de croissance dans des postes H11 et H12 pour déterminer si elles sont positives (ie., ont un dépôt de cellules sur le fond du puits). Si les puits de contrôle de croissance ne sont pas positifs, réincuber la plaque et réexaminer périodiquement (par exemple, le jour 10, jour 14) jusqu'à ce que le puits de contrôle de croissance sont positifs.

1. Miroir lire:
   1. Placez scellés AST plaque de microtitration sur la plateforme;
   2. Lire puits contrôle de la croissance après 7 jours d'incubation; si cela est négatif, réincuber AST plaque de microtitration;
   3. Si les contrôles de croissance sont acceptables, alors lisez les puits contenant un médicament. Pour chaque médicament, d'enregistrer la première dilution qui n'a pas de croissance en comparant les puits de drogue avec le contrôle de la croissance.
   4. La croissance apparaît comme la turbidité ou comme un dépôt de cellules au fond d'un puits.
2. Instrument Lire: suivez les instructions des fabricants; les instructions ci-dessous sont un exemple de comment la lecture serait faite avec la plate-forme Vizion:
   1. Log in
   2. Utilisez "MYCOTB" logiciel plaque AST.
   3. Placer la plaque scellée avec le code-barres face à l'utilisateur. La croissance apparaît comme la turbidité ou comme un dépôt de cellules au fond d'un puits.
   4. Lire contrôle la croissance, si ce n'est négatif, réincuber AST plaque de microtitration; si elle est positive lire la plaque en touchant l'écran avec le premier puits de chaque médicament qui ne montrent pas de croissance.

Lire les plaques pureté. La plaque de gélose au sang devrait montrer une croissance nulle après 48 heures et la plaque de la pureté 7H10 devrait avoir une croissance confluente d'un type d'organisme. S'il est contaminé, le test AST microtitration doit être répété à partir d'une culture pure.

Calculer le nombre de colonies à partir du contrôle positif et en utilisant le tableau ci-dessous:

Principales nombre de colonies

Il peut y avoir de fuite d'acide para-aminosalicylique chez certaines souches de Mycobacterium tuberculoseSIS. Cela peut être interprété en regardant tous les puits qui ont granulés et en utilisant le premier puits qui a la même taille que le pellet dilution suivante comme point de fin. La résistance est rare avec ce médicament.

Figure 1. Les résultats représentatifs en utilisant la plaque MYCOTB.

Un exemple d'une plaque de microtitration AST qui a des contrôles de croissance positif est montré dans la figure 1 et le MIC critère (pg / ml) pour chaque médicament est encerclé. Une étude menée dans notre laboratoire ont indiqué que la méthode AST plaque de microtitration est équivalente à la méthode standard de l'or agar proportion pour les tests de sensibilité de Mycobacterium tuberculosis. Plus rapide présentation des résultats a été obtenue avec microtitration AST plaque de microtitration par rapport à la méthode des proportions agar traditionnelle avec l'interprétation finale pour AST plaque de microtitration et la méthode de la proportion de gélose à 14 et 21 jours, respectivement à AST plaque de microtitration a l'avantage de tester d'abord et médicaments de seconde ligne simultanément ce qui peut aider à prévenir les retards excessifs avec des souches résistantes. La plaque de microtitration AST est aussi beaucoup plus facile à configurer et à lire que l'APM et la fois un miroir manuelle et d'un système semi-automatisé comme la VIZION peut être utilisé pour lire les plaques. La disponibilité d'une valeur de CMI pour les tests résistance aux antituberculeux peuvent fournir de précieuses informations aux médecins de nouvelles par rapport à la valeur critique de concentration traditionnels, en particulier pour ceux des isolats avec «limite» de susceptibilité.

Il n'ya rien à révéler.

Nous tenons à remercier les technologues de laboratoire du Laboratoire de la Clinique Mayo Mycobactériologie pour leur aide pendant l'étude.

1. Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., and Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Sept. 12, 2010. Abstract 2450. Presented at 50^th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA.
2. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition; HHS Publication No. (CDC) 21-112 Revised December 2009. U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. National Institutes of Health.
3. Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing. Int J Tuberc Lung Dis 14, 1169-75 (2010).
4. Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., and Drugeon, H. Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 42, 1030-1034 (2004).
5. SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. Product Insert. TREK Diagnostic Systems. Cleveland OH. MYCOTB-V1.5 November (2010).
6. CLSI. Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. (ISBN 1-56238-500-3). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania, (2003).
7. Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., and Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, Abstract C-151, San Diego, CA.
8. VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT, 7115-60, Product insert; L-TDST014-4, 2008-08 TREK Diagnostic Systems, Cleveland OH.
9. Parrish, N.M., Carroll, K.C. The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings. J Clin Microbiol, Epub ahead of print (2010).
10. Kam, K.M., Sloutsky, A., Yip, C.W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., and Kim, S.J. Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance. Int J Tubercl Lung Dis 14, 282-8 (2010).
11. Woods, G.L., Warren, N.G., and Inderlied, C.B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. In: Manual of Clinical Microbiology, 9th Ed; Eds: PR Murray, EJ Barron, JH Jorgensen, ML Landry, MA Pfaller. ASM Press, Washington DC, 1223-1247 (2007).
12. Bergmann, J.S., and Woods, G.L. Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs. J Clin Microbiol 36, 2940-2943 (1998).

2 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.