Name: Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Impara a testare la suscettibilità antimicrobica di Mycobacterium tuberculosis usando la diluizione in brodo in micropiastra. Questo metodo determina i valori MIC per 12 farmaci simultaneamente, aiutando a selezionare trattamenti appropriati contro ceppi resistenti.

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Vorremmo ringraziare i tecnici di laboratorio della Clinica Mayo micobatteriologia Laboratorio per il loro aiuto durante lo studio.

Ogni laboratorio deve eseguire una valutazione dei rischi in collaborazione con il loro Comandante istituzionali di sicurezza biologica per determinare il livello appropriato di biosicurezza per la preparazione dell'inoculo e per pipettaggio dell'inoculo nella piastra. Nel nostro laboratorio, utilizziamo livello di biosicurezza 3 laboratorio (BSL3) pratiche fino alla micropiastre vengono inoculati, e sigillato con una guarnizione di plastica adesiva. Queste lastre vengono poi poste all'interno di un sacchetto di plastica, che è caldo anche sigillato. Lettura di incubazione e l'interpretazione dei micropiastra è condotto in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2). 1. Etichettatura delle materie <ol><li> Etichettare una piastra di agar sangue, tre Middlebrook 7H10 piatti, brodo Middlebrook 7H9, una soluzione salina tra tubo di vetro e perle micropiastra AST con gli identificatori appropriati (per esempio, il nome del paziente, il numero di cartella clinica) nel BSL2. </li><li> Etichetta l'agar sangue e 7H10 placcato come il "controllo della purezza". Conta delle colonie periodica degli inoculo sono raccomandati per garantire che un'adeguata concentrazione di organismi viene utilizzato nel test. Conta delle colonie, quando eseguite dovranno avere due dei piatti 7H10 etichettati con "conta 1 / 1 colonia" e "contare 1 / 50 colonia". </li></ol> 2. Tecnologo preparati per andare in BSL3 <ol><li> Appropriati dispositivi di protezione individuale è necessario lavorare in BSL3 e comprende solid-front camice, copricapo, guanti, copriscarpe, e un respiratore. Ciascuna istituzione dovrebbe stabilire il proprio piano di protezione delle vie respiratorie in collaborazione con l'Ufficio Igiene Industriale loro istituzione. Nel nostro laboratorio, abbiamo respiratori diversi disponibili, tra cui respiratori alimentati ad aria purificata (PAPRs) e montato con filtri HEPA, N95 mezza faccia respiratori. </li></ol> 3. Preparazione della cappa di sicurezza biologica <ol><li> Nel BSL3, preparare la cappa di sicurezza biologica (BSC) per la disinfezione della superficie e mettendo un tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante circa 6 centimetri dal pannello di sfiato aria. </li><li> Posizionare un contenitore per rifiuti a sinistra, e nephlometer piccole e vortex sulla destra. </li><li> Loop inoculo, pipetors e suggerimenti sono posti accanto al tovagliolo di carta. </li><li> Mettere un rack con l'organismo (in brodo o su terreno solido) e il 0,5 di serie McFarland sul tovagliolo di carta. </li></ol> 4. Calibrazione del nefelometro <ol><li> Posizionare un tubo di vetro salina perla tra nel nefelometro e impostare lo strumento a zero usando il vuoto salina interpolazione. </li><li> Posizionare il 0,5 standard di McFarland nel nefelometro e calibrare secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5. Preparazione dell'inoculo <ol><li> Lavorare nel colonie raschiare BSC dal terreno solido utilizzando un'ansa sterile nel adeguatamente etichettati salina tubo tra perle di vetro fino a ≥ 0,5 McFarland standard si ottiene. </li><li> Ispezionare visivamente il campione, e confrontare allo standard McFarland. </li><li> Esempio Vortex per 30-60 secondi. </li><li> Lasciare l'inoculo di stabilirsi per 15 minuti (impostare un timer). </li></ol> 6. Inoculazione del micropiastra <ol><li> Regolare l'inoculo con soluzione salina tra brodo usando il nefelometro calibrato al McFarland 0,5 in passi 4.1 e 4.2. Questo deve essere completato entro 30 minuti (secondo le specifiche del produttore). </li><li> Utilizzare un 200 pipetter microlitri e un lungo puntale resistente aerosol per rimuovere 100 l di inoculo dal rd TOP 1 / 3 della soluzione salina tubo tallone interpolazione. Inoculare il brodo Middlebrook 7H9. Lentamente vortice il brodo inoculato 7H9 per 20 secondi. </li><li> Rimuovere la piastra microtiter AST dalla confezione del produttore. NON USARLO se l'essiccante è blu o se la confezione di alluminio è danneggiato. </li><li> Preparare una diluizione 1:50 tubo per l'uso più tardi nella preparazione della diluizione 1:50 pipettando 50 ml di acqua sterile in una provetta sterile. </li><li> Versare cautamente l'inoculo 7H9 brodo in un trogolo. Evitare di generare aerosol. </li><li> Posizionare la micropiastra AST con l'etichetta rivolto verso l'alto. </li><li> Usare un 12-canale pipetter per aggiungere 100 microlitri della inoculo a ciascun pozzetto. </li><li> Preparare le diluizioni per la conta delle colonie: <ol type="a"><li> L'1 / 1 diluizione è preparato dal controllo positivo (H12) con striature 1 loop microlitri sul piatto 7H10 denominata "1 / 1". </li><li> L'1 / 50 di diluizione è preparati inoculando un loop 1 microlitri dal pozzetto del controllo positivo (H12) e vorticoso nel tubo con 50 ml di tubo di acqua preparata in precedenza. Streak 1 ml di questa diluizione alla piastra etichetta "1 / 50". </li></ol></li><li> Inoculare le piastre purezza dal trogolo pipettando 50 microlitri su un agar sangue senza anticoagulante e 7H10 piastra e strisciare per l'isolamento. </li><li> Postoun sigillo adesivo sul micropiastra AST. Premere con decisione su ogni bene per assicurare un'adeguata tenuta utilizzando il retro bianco della tenuta. Evitare pieghe. </li><li> Disinfettare la micropiastra strofinando con un tovagliolo di carta imbevuto di un disinfettante tubercolicida e microstrips posto in un sacchetto di plastica e chiudere con una saldatura a caldo o nastro. <ol type="a"><li> Il sacchetto di plastica funge da contenitore secondario per garantire che tutti brodo è contenuto dovrebbe esserci una perdita o fuoriuscita del piatto principale. </li></ol></li></ol> 7. Disinfezione dei materiali e cabina di sicurezza biologica <ol><li> Per evitare di produrre aerosol, attraverso un altro posto sulla parte superiore della vasca inoculato prima di inserirlo delicatamente nel contenitore degli scarti. </li><li> Disinfettare tutti i materiali tra cui nephlometer, vortex, lastre, tubi, ecc strofinando giù con un disinfettante tubercolicida e aspettare il momento opportuno per assicurare la disinfezione secondo le istruzioni del produttore prima di togliere dal BSC. Per esempio, Prospray, il disinfettante tubercolicida usiamo, richiede 15 minuti per uccidere micobatteri. </li><li> Mettere il recipiente scartare in un sacchetto di rischio biologico e sigillare prima di sterilizzazione in autoclave. </li></ol> 8. Incubazione <ol><li> Piastre devono essere incubate con i media verso il basso e si deve prestare attenzione per evitare fuoriuscite o spruzzi liquidi. </li><li> Incubare la micropiastra AST piatto, 7H10 e piastre di agar sangue in un incubatore 35-37 ° C con il 5-10% di CO 2 con 5-10% di CO 2 nel laboratorio BSL2. <ol class="lalpha"><li> Nel nostro laboratorio, questo è accettabile perché la piastra è ben sigillato e dentro un sacchetto di plastica sigillato. </li></ol></li><li> Non più di 2 piastre di microtitolazione AST dovrebbe essere impilati in incubatrice secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 9. Rappresentante risultati Interpretazione dei risultati: Sigillato AST micropiastre possono essere letti manualmente usando uno specchio come un aiuto o con un lettore di piastre automatizzata, ad esempio il Vizion (Diagnostica TREK). Le lastre possono essere esaminata non appena 7 giorni dopo l'inoculazione. Esaminare i pozzetti di controllo della crescita in posizioni H11 e H12 per determinare se sono positivi (cioè, hanno un deposito di cellule sul fondo del pozzo). Se i pozzi di controllo della crescita non sono positivi, reincubare la piastra e riesaminare periodicamente (es., giorno 10, giorno 14) fino a quando i pozzi di controllo della crescita sono positivi. <ol type="a"><li> Specchio leggere: <ol type="i"><li> Luogo sigillato AST micropiastra sulla piattaforma; </li><li> Leggi pozzetti di controllo della crescita dopo 7 giorni di incubazione, se invece è negativo, reincubare AST micropiastra; </li><li> Se i controlli di crescita sono accettabili, quindi leggere il farmaco contenente pozzi. Per per ogni farmaco, registrare la prima diluizione che non ha una crescita confrontando i pozzi della droga con il controllo della crescita. </li><li> La crescita appare come torbidità o come un deposito di cellule in fondo a un pozzo. </li></ol></li><li> Strumento di lettura: seguire le istruzioni del produttore, le istruzioni che seguono sono un esempio di come la lettura sarebbe stato fatto con la piattaforma Vizion: <ol type="i"><li> Log in </li><li> Utilizzare una piastra "MYCOTB" AST software. </li><li> Luogo piatto sigillato con il codice a barre rivolto verso l'utente. La crescita appare come torbidità o come un deposito di cellule in fondo a un pozzo. </li><li> Leggi controlla la crescita, se questo è negativo, reincubare AST micropiastra, se positiva leggere la piastra toccando lo schermo con il primo pozzo di ogni farmaco che non mostra crescita. </li></ol></li></ol> Leggi le piastre purezza. La piastra di agar sangue dovrebbe mostrare alcuna crescita dopo 48 ore e la piastra di purezza 7H10 dovrebbe avere crescita confluente di un tipo di organismo. Se contaminati, il test AST microtiter deve essere ripetuta da una coltura pura. Calcolare la conta delle colonie dal controllo positivo utilizzando la tabella sottostante: Colony Conte chiave <table border="1"><tbody><tr><td> # Colonie contate sulla piastra denominata "1 / 1" </td><td> # Colonie contate sulla piastra denominata "1 / 50" </td><td> Inoculo conteggio delle colonie (ufc / ml) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 x 10 4 a 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 x 5-5 Ottobre X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> Ci possono essere uscita con l'acido para-aminosalicilico in alcuni ceppi di Mycobacterium tubercolosis. Questo può essere interpretato, cercando in tutti i pozzetti che sono pellet e con il primo pozzo che ha la stessa dimensione del pellet come la diluizione successiva, come il punto finale. La resistenza è rara con questo farmaco. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Risultati rappresentativi utilizzando la piastra MYCOTB. <table border="1"><tbody><tr><td> Droga abbreviazione </td><td> Droga </td><td> MIC μ / ml </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacina </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> moxifloxacina </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampin </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td> amikacina </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> streptomicina </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutina </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> acido p-aminosalicilico </td><td> ≤ 0,5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> etionamide </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> cicloserina </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazide </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> kanamicina </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> etambutolo </td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).</li>
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</ol>

Un esempio della micropiastra AST che controlla la crescita positiva è illustrato nella figura 1 e il punto finale MIC (mg / ml) per ogni farmaco è cerchiato. Uno studio condotto nel nostro laboratorio hanno indicato che il metodo microtiter AST piastra è equivalente al metodo gold standard proporzione agar per testare la sensibilità del Mycobacterium tuberculosis. Più veloce comunicazione dei risultati è stato ottenuto con micropiastra AST microtiter rispetto al metodo tradizionale proporzione agar con l&#39;interpretazione finale per piastra AST microtitolazione e proporzione metodo agar a 14 e 21 giorni, respectively.The AST micropiastra ha il vantaggio di test prima e farmaci di seconda linea contemporaneamente che può aiutare a prevenire ritardi eccessivi con ceppi resistenti. La piastra microtiter AST è anche molto più facile da impostare e leggere che l&#39;APM e sia uno specchio manuale e un sistema semi-automatico come il Vizion può essere utilizzato per leggere le piastre. La disponibilità di un valore di MIC per testare la resistenza ai farmaci TB può fornire preziose informazioni ai medici nuove rispetto al valore tradizionale concentrazione critica, soprattutto per quelli isolati con suscettibilità &quot;borderline&quot;.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> AST micropiastre e sigillo adesivo </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland Ohio </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> McFarland 0,5 di serie </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland, Ohio </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 piastre </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Piastre di agar sangue </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Sterile loop microlitri 1 </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Anse sterili 10 L </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween perline di vetro brodo </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland, Ohio </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC brodo </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland, Ohio </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Puntali lungo </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Trogoli sterile </td><td> Diagnostica TREK, Cleveland, Ohio </td><td></td></tr><tr><td> M. tuberculosis </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20μL </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Consigli 1000, 20, 20 l </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Multicanale Pipetter </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore di CO% 05-10 febbraio </td><td> Pescatore </td><td></td></tr><tr><td> Sacchetti di plastica, piccoli, CO 2 permeabile </td><td> Poly plastica, Delano, PA </td><td></td></tr><tr><td> TB disinfettante (Come ad esempio ProSpray C-60) </td><td> Certol internazionale, Commerce City, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> Specchio Box Reader </td><td> Pescatore </td><td></td></tr></tbody></table>

test di suscettibilità antimicrobica del complesso mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

La rilevazione rapida della resistenza antimicrobica è importante nel tentativo di controllare l&#39;aumento della resistenza Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Test di suscettibilità antimicrobica (AST) di Mtb è stata tradizionalmente eseguita con il metodo di agar proporzione o testando macrobroth su uno strumento come il BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (Diagnostica TREK, Cleveland, OH) o BacT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Il metodo delle proporzioni agar, mentre considerato lo standard &quot;oro&quot; di AST, è laborioso e richiede il calcolo della resistenza effettuando la conta delle colonie su agar contenenti droga rispetto al drug-free agar. Se vi è una crescita ≥ 1% sul farmaco contenente medio rispetto al drug-free medio, l&#39;organismo è considerato resistente a quel farmaco. I metodi macrobroth richiedono strumentazione e rompere punto di prova (&quot;critical&quot;) concentrazioni del farmaco per i farmaci di prima linea (isoniazide, etambutolo, rifampicina e pirazinamide). Il metodo qui descritto è disponibile in commercio in un formato da 96 pozzetti micropiastra [MYCOTB (Diagnostica TREK)] e contiene concentrazioni crescenti di 12 antimicrobici usati per il trattamento della tubercolosi inclusi sia prima (isoniazide, rifampicina, etambutolo) e farmaci di seconda linea (amikacina, cicloserina, etionamide, kanamicina, moxifloxacina, ofloxacina, acido para-aminosalicilico, rifabutina, e streptomicina). Pirazinamide, un farmaco di prima linea, non è incluso nella piastra microtiter a causa della sua necessità di condizioni di prova acida. Vantaggi del sistema micropiastra includono sia la facilità di configurazione e veloce girare intorno a tempo (14 giorni) rispetto al rapporto tradizionale agar (21 giorni). Inoltre, la piastra può essere impostato da inoculo preparato utilizzando brodo o terreno solido. Poiché il formato micropiastra è nuova e da Mtb presenta sfide di sicurezza unici nel laboratorio, questo protocollo si descrive come impostare in modo sicuro, incubare e leggere la micropiastra.

Test di suscettibilità antimicrobica di Mycobacterium tuberculosis è impegnativo, ma fondamentale per la cura del paziente. Questo formato micropiastra offre test di 12 farmaci antimicobatterici e fornisce minima concentrazione inibente (MIC) valori, che sarà di aiuto nel trattamento appropriato.

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

La rapida rilevazione della resistenza antimicrobica è fondamentale nello sforzo di controllare l'aumento di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) resistenti. ...

Esistono relativamente pochi farmaci disponibili per il trattamento di Mycobacterium tuberculosis, pertanto la resistenza a qualsiasi farmaco è una preoccupazione. Questo articolo video descrive una procedura per testare contemporaneamente la resistenza agli antibiotici di M. tuberculosis a 12 diversi farmaci antimicrobici. Pertanto, la capacità di rilevare rapidamente la resistenza antimicrobica di M. tuberculosis è molto importante nell'ambito degli sforzi volti a controllare l'aumento di ceppi resistenti. Ecco come testare la suscettibilità agli antibiotici.Il M. tuberculosis viene prima coltivato su terreni solidi o in brodo, ottenendo una sospensione batterica. Viene preparato l'inoculo e aggiunto a una piastra a microtitolazione contenente diverse concentrazioni di 12 farmaci, inclusi farmaci di prima e seconda linea. Dopo l'incubazione, l'entità della crescita in ciascun pozzetto viene determinata manualmente mediante un box con specchio oppure utilizzando un lettore di piastre semiautomatico.I dati ottenuti indicano la concentrazione minima inibitoria per ciascun farmaco testato e mostrano a quali antibiotici il ceppo di TB testato è resistente. Questi risultati aiutano a scegliere il farmaco appropriato per il trattamento della TB. Ciao, mi chiamo Nancy Ek e sono direttrice del Laboratorio di Micobatteriologia della Mayo Clinic di Rochester, Minnesota.Oggi descriveremo un metodo per eseguire test di suscettibilità agli antibiotici per Mycobacterium tuberculosis. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la diluizione in brodo macro, è che viene determinata una MIC per ciascun farmaco e vengono testati contemporaneamente 12 antibiotici. A dimostrare la procedura sarà Kurt Jude, specialista della qualità nel mio laboratorio, che lavora su un banco da laboratorio.Prepararsi per questa procedura etichettando una piastra di agar sangue, tre piastre Middlebrooks sette H 10, un tubo di perline di vetro con soluzione salina Tween e una piastra a microtitolazione con il nome del paziente e il numero di identificazione del campione. Inoltre, etichettare la piastra di agar sangue e le piastre sette H 10 come purezza. Contrassegnare un’etichetta su una di queste piastre sette H 10 come conteggio di colonie uno a uno e l’altra come conteggio di colonie uno a 50.Quindi posizionare il vassoio nel pass-through. Successivamente, prepararsi a lavorare in un impianto di biosicurezza di livello tre (BSL-3) indossando una tunica con chiusura anteriore, copricapo, guanti, copriscarpe e un respiratore. In questo caso, viene utilizzato un respiratore PAPR.Quindi recuperare il vassoio dal pass-through. Successivamente, nell'ambiente BSL tre, disinfettare la superficie della cappa a sicurezza biologica. Poi posizionare un tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante all'interno della cappa, approssimativamente a sei pollici dal pannello della ventola d'aria, accanto al tovagliolo di carta.Posizionare anelli inoculatori, pipette e punte, un contenitore appropriato per lo smaltimento dei rifiuti, un nephi, TER e un vortex. Una volta preparato l'incubatore, posizionare l'organismo sul tovagliolo di carta insieme a un portaprovette con uno standard McFarland 0,5, un brodo sette H nove con OADC e un tubo con perline saline. Questa preparazione viene effettuata a partire da un mezzo solido.Preparare l'inoculo da una coltura su mezzo solido ottenuta da un campione del paziente. Utilizzare un’ansa sterile per prelevare le colonie e trasferirle nel tubo di vetro contenente soluzione salina con Tween e perle di vetro. Vortexare la sospensione per 30-60 secondi.Ispezionare visivamente il campione, confrontandolo con lo standard McFarland. La quantità trasferita deve essere uguale o maggiore rispetto allo standard. In caso contrario, aggiungere altro campione batterico e vorticare nuovamente.Dopo aver confrontato con lo standard di McFarland, lasciare decantare l'inoculo per 15 minuti, in modo da permettere ai grumi più grandi di batteri di sedimentare. Successivamente, utilizzare un nefi TER per misurare la densità dei batteri in sospensione e portarla a zero. Il nephi ter.Posizionare innanzitutto un tubo vuoto con perle saline Tween nel Nephi ter. Premere il pulsante di calibrazione per azzerare lo strumento, quindi inserire lo standard McFarland 0,5 nel Nephi ter e premere nuovamente il pulsante di calibrazione. Una volta calibrato lo strumento, rimuovere lo standard McFarland e inserire l'inoculo.La lettura dell'inoculo deve essere uguale alla lettura dello standard di McFarland. Se la lettura è troppo bassa, rimuovere il tubo e trasferire altri batteri dalla piastra. Quindi vortexare e leggere nuovamente il campione.Se il valore è troppo elevato, aggiungere al tubo del tween salino e vorticare. Quindi leggere nuovamente il campione. Continuare ad aggiustare l'inoculo secondo necessità fino a quando la concentrazione dei batteri corrisponde allo standard di McFarland.Successivamente, utilizzare una pipetta da 200 microlitri e una punta aerosol-resistente lunga per prelevare 100 microlitri di inocolo dal terzo superiore del tubo. Per evitare grumi che si depositano sul fondo, inoculare il brodo Middlebrook 7H9 e vorticare lentamente il brodo inoculato per 20 secondi per piastrare l'inoculo. Iniziare rimuovendo la piastra a microtitolazione dalla confezione del produttore. Se l'essiccante è blu o se la confezione in foglio di alluminio è danneggiata, non utilizzarla.La piastra contiene già i 12 antimicrobici da testare in ciascun pozzetto, inclusi i farmaci più efficaci o di prima scelta e i farmaci di seconda linea. Versare con attenzione l'inoculo di brodo H nine sette in un trth, avendo cura di non generare aerosol. Successivamente, posizionare la piastra a microtitolazione con l'etichetta rivolta verso l'esterno come mostrato qui, e utilizzare una pipetta a 12 canali per aggiungere 100 microlitri di inoculo in ciascun pozzetto.Successivamente, preparare le piastre per eseguire il conteggio delle colonie. Per prima cosa, preparare una piastra non diluita trasferendo un'ansa da un microlitro di campione dal pozzetto del controllo positivo alla piastra H 10 sette etichettata uno a uno. Quindi utilizzare l'ansa per effettuare lo streaking della piastra come mostrato qui.Successivamente, per preparare una diluizione da uno a 50, trasferire un’ansa da un microlitro dal pozzetto del controllo positivo e agitarla nel tubo contenente 50 microlitri di acqua. Depositare un microlitro di questa diluizione sulla piastra etichettata uno a 50. Inoculare le piastre di purezza pipettando 50 microlitri dell'inoculo dal trth su piastre di agar sangue e piastre 7 H 10 opportunamente etichettate e seminare per isolamento.Quindi impilare un altro trth sopra il trth inoculato e posizionarli delicatamente nel contenitore per rifiuti. Applicare un sigillo adesivo sulla piastra a microtitolazione. Successivamente, utilizzando il supporto bianco, premere con fermezza su ogni pozzetto per garantire un'adeguata chiusura, assicurandosi che non ci siano pieghe.Disinfettare la piastra microtitolatrice passando un tovagliolo di carta imbevuto di un disinfettante battericida tubercolare. Successivamente, inserire la piastra microtitolatrice in un sacchetto di plastica e chiuderlo con una sigillatrice termica. Infine, disinfettare tutti i materiali, inclusi il nefi, il vortice per filtri, le piastre e le provette, passandoli con un disinfettante battericida tubercolare.Qui lo spray pro viene utilizzato dopo che è trascorso un tempo sufficiente per garantire la disinfezione. 15 minuti per lo spray pro. Le piastre vengono sigillate con nastro adesivo trasparente, inserite in sacchetti di plastica e le forniture sigillate vengono rimosse dalla cappa a sicurezza biologica e collocate nel pass-through.Il sacco rosso per gli scarti a questo punto viene chiuso e sigillato con un fermo-cavo, quindi si rimuovono la tunica, le soprascarpe e i guanti. Dopo essersi recati nella stanza di pre-ingresso e aver lavato le mani, si rimuove il respiratore, lo si disinfetta e conserva dopo aver nuovamente lavato le mani, si indossa una tunica pulita e si lascia l'ambiente BSL tre. Successivamente, il contenitore degli scarti viene sterilizzato in autoclave.In seguito, incubare la piastra a microtitolazione e le sette piastre H 10 e piastre per sangue in posizione eretta nell'incubatore a 35-37 gradi Celsius con il 5-10% di CO2 nel laboratorio di livello di sicurezza biologica due. Questo è accettabile perché la piastra è ben sigillata e contenuta in un sacchetto di plastica. Il tempo di generazione di Mycobacterium tuberculosis è di circa 12-24 ore, quindi dovrà trascorrere almeno una settimana prima che la crescita possa essere osservata come formazione di un pellet cellulare sul fondo del pozzetto di controllo. Al giorno 10, effettuare una lettura manuale con lo specchio posizionando la piastra sigillata per test di sensibilità su piattaforma dello specchio.Utilizzare una lampada da tavolo per aiutare a visualizzare la crescita, regolando se necessario per ottenere il miglior contrasto. Controllare le pozzette di controllo della crescita, in questo caso H 11 e H 12, guardando nello specchio. Se è presente crescita, la pozzetta apparirà torbida o sembrerà contenere del sedimento, come mostrato qui.Se non c'è crescita, come mostrato in questo esempio, il pozzetto apparirà chiaro. In questo caso, riposizionare la piastra nell'incubatore e continuare l'incubazione fino a 21 giorni. Per ogni condizione, confrontare la crescita con il controllo.Bene, allora, per ogni farmaco, la prima diluizione in cui non si osserva crescita. Questa è la concentrazione minima inibitoria, o MIC, del farmaco. Per esaminare i risultati utilizzando un lettore automatizzato di piastre come il Vision, iniziare aprendo il software Myco TB a ST plate ed effettuando l'accesso. Posizionare quindi la piastra sigillata con il codice a barre rivolto verso l'esterno. Come mostrato qui, la crescita appare come torbidezza o come deposito di cellule sul fondo di una pozzetta sullo schermo del computer.Prima di tutto, esaminare i controlli di crescita. Come in precedenza. Se la crescita è negativa, rimettere la piastra nell'incubatrice per un massimo di 21 giorni.Se il risultato è positivo, registrare i risultati toccando il primo pozzetto che non mostra crescita sullo schermo per ciascun farmaco. In alcuni casi, i batteri, il sedimento o i farmaci precipitano sul fondo del pozzetto. Questo fenomeno, noto come "trailing", è indicato da diversi pozzetti con pellet di uguale dimensione e non viene considerato effettivamente una crescita positiva.Successivamente, le sette piastre di H 10 e agar sangue vengono esaminate per determinare le concentrazioni batteriche e valutare la purezza. La piastra di agar sangue non dovrebbe mostrare alcuna crescita dopo 48 ore. La crescita sulla piastra di agar sangue indica contaminazioni con batteri a crescita rapida.Se è presente crescita, il test del microtitolatore deve essere ripetuto. La piastra di purezza H 10 sette deve mostrare la crescita di un solo organismo. Il ceppo di tubercolosi EM deve apparire di colore paglierino, rugoso e irregolare. Se contaminato, il test del microtitolatore deve essere ripetuto a partire da una coltura pura.Per valutare la concentrazione batterica, contare le colonie sulla piastra H 10. Quindi, utilizzando la tabella nel documento scritto allegato, calcolare il numero di colonie. Mycobacterium tuberculosis è stato isolato da un campione di paziente e la resistenza agli antibiotici è stata valutata come descritto in questo video; nella piastra mostrata qui, sono presenti 12 diversi farmaci in concentrazioni crescenti, con le concentrazioni più elevate in alto e quelle più basse in basso.La concentrazione minima inibitoria, o MIC del farmaco, è indicata dalla più bassa concentrazione del farmaco che non mostra alcuna crescita ed è cerchiata nell'immagine mostrata qui, utilizzando punti di rottura standardizzati stabiliti dall'Clinical and Laboratory Standards Institute. I dati mostrati qui suggeriscono che questo ceppo di TB sarà resistente all'Isid e alla rifampicina. In vitro, le alte MIC osservate in diversi altri farmaci, tra cui oin, moxifloxacina, streptomicina e rifabutina, suggeriscono la resistenza del ceppo di tubercolosi EM a questi agenti.I risultati del MIC devono essere utilizzati da uno specialista in malattie infettive esperto nel trattamento della tubercolosi per sviluppare un piano di trattamento personalizzato. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica richiede circa 40 minuti per allestire un isolato. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che questo è un agente patogeno respiratorio e che, una volta effettuata la distribuzione, si possono generare aerosol. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il test di suscettibilità antimicrobica su Mycobacterium tuberculosis mediante il metodo di diluizione in microbrodo. Non dimenticare che lavorare con Mycobacterium tuberculosis può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come la protezione respiratoria devono essere sempre adottate laddove richieste.

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Un metodo di microdiluizione in brodo per i test di suscettibilità agli antibiotici dei batteri Gram-positivi

Questo video dimostra un test per valutare l'efficacia dei farmaci contro l'infezione da Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Viene generato un modello di infezione in vitro contenente aggregati di Mtb/macrofagi che imita l'infezione in vivo. Dopo l'introduzione di antibiotici adeguati, la loro efficacia viene testata tramite il dosaggio della resuzarina per monitorare la sopravvivenza dei batteri con l'aumentare delle concentrazioni di farmaci.

Un test per valutare l'efficacia di un farmaco contro un modello di infezione da Mycobacterium tuberculosis

Questo video dimostra un test in brodo per determinare l'efficacia degli antibiotici contro il Mycobacterium tuberculosis. La coltura batterica viene incubata con diverse concentrazioni di un antibiotico battericida. L'efficacia battericida viene misurata valutando la presenza di batteri vitali utilizzando un test della resazurina.

Valutazione dell'efficacia di un composto di prova contro i micobatteri in brodo

Il saggio charcoal agar resazurin a(CARA) è un metodo semi-quantitativo a medio rendimento per valutare l'attività degli agenti di prova contro i micobatteri che si replicano, non si replicano o entrambi.  Il CARA consente una rapida valutazione dell'attività dipendente dal tempo e dalla concentrazione e identifica i parametri da perseguire mediante saggi di unità formanti colonie (CFU).

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nuovi modelli e saggi che migliorerebbero il processo di sviluppo precoce dei farmaci antitubercolari di prossima generazione sono altamente auspicabili. Qui, descriviamo un test rapido, economico e compatibile con BSL-2 per valutare l'efficacia del farmaco contro il Mycobacterium tuberculosis che può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

La quantificazione rapida ed efficiente della crescita intracellulare di M. tuberculosis è fondamentale per perseguire terapie migliori contro la tubercolosi (TB). Questo protocollo descrive un test di rilevamento colorimetrico basato sul brodo utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato per quantificare la crescita di Mtb nei macrofagi trattati con terapie candidate dirette dall'ospite.

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Qui presentiamo un protocollo per identificare potenziali candidati farmaci antitubercolosi tramite screening fenotipico, comprendendo la sintesi chimica di un composto di 4-aminochinolina, la determinazione della sua concentrazione inibitoria minima contro Mycobacterium tuberculosis e la valutazione della sua citotossicità nelle linee cellulari di mammiferi.

Identificazione dei potenziali candidati anti-TB: una guida passo dopo passo alla sintesi, alla determinazione della CIM e alla valutazione della citotossicità nelle cellule di mammiferi

Impara a testare la suscettibilità antimicrobica di Mycobacterium tuberculosis usando la diluizione in brodo in micropiastra. Questo metodo determina i valori MIC per 12 farmaci simultaneamente, aiutando a selezionare trattamenti appropriati contro ceppi resistenti.

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra (Video) | JoVE Journal

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

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