Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

Ci sono relativamente pochi farmaci disponibili per trattare il mycobacterium tuberculosis, quindi la resistenza a qualsiasi farmaco è un problema. Questo articolo video descrive una procedura per testare la resistenza agli antibiotici della tubercolosi M a 12 diversi farmaci microbici contemporaneamente. Pertanto, la capacità di rilevare rapidamente la resistenza antimicrobica di M tuberculosis è molto importante nello sforzo di controllare l'aumento dei ceppi di resistenza per testare la suscettibilità agli antibiotici.

La tubercolosi M viene coltivata per la prima volta su terreni solidi o in brodo, una sospensione batterica. L'inoculo viene preparato e aggiunto a una piastra per microtitolazione contenente diverse concentrazioni di 12 farmaci, inclusi farmaci di prima e seconda linea Dopo l'incubazione. L'entità della crescita in ciascun pozzetto viene determinata manualmente utilizzando una scatola a specchio o utilizzando un lettore di piastre semiautomatico.

I dati risultanti indicano la concentrazione inibitoria minima per ciascun farmaco testato e mostrano a quali antibiotici è resistente il ceppo testato di TBC. Questi risultati aiutano a scegliere il farmaco appropriato per il trattamento della tubercolosi. Ciao, mi chiamo Nancy Ek e sono direttrice del Myco Bacteriology Laboratory presso la Mayo Clinic di Rochester, Minnesota.

Oggi descriveremo un metodo per eseguire test di suscettibilità agli antibiotici per il Mycobacterium tuberculosis. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la diluizione del brodo macro è che viene determinata una MIC per ogni farmaco e vengono testati contemporaneamente 12 antibiotici. A dimostrare la procedura sarà Kurt Jude, uno specialista della qualità nel mio laboratorio, che lavora su un banco da laboratorio.

Prepararsi a questa procedura etichettando una piastra per agar sanguigno, tre piastre Middlebrooks sette H 10, un tubo di perline di vetro con soluzione salina e una piastra per microtitolazione con il nome del paziente e il numero di identificazione del campione. Inoltre, etichettare l'agar sanguigno e sette piastre H 10 come purezza. Controllare l'etichetta di una di queste sette piastre H 10 come conteggio delle colonie uno a uno e l'altra come conteggio delle colonie da uno a 50.

Quindi posizionare il vassoio nel passante. Successivamente, preparati a lavorare nella struttura BSL di biosicurezza di livello tre indossando un camice frontale solido, guanti copricapo, copriscarpe e un respiratore. Qui viene utilizzato un respiratore Pappa.

Quindi recuperare il vassoio dal passante. Successivamente, nella struttura BSL three, disinfettare la superficie della cabina di sicurezza biologica. Quindi posizionare un tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante all'interno del cappuccio, a circa sei pollici dal pannello di sfiato dell'aria accanto al tovagliolo di carta.

Posizionare anse di inoculazione, pipettatori e puntali, un contenitore per lo smaltimento dei rifiuti appropriato, un nephi, TER e un vortice. Una volta preparata la cappa, posizionare l'organismo sul tovagliolo di carta insieme a una griglia con un brodo McFarland 0.5 standard A seven H nine con OADC e un tubo di perline saline. Questa configurazione viene eseguita da solido, medio.

Preparare l'inoculo da una coltura solida dal campione di un paziente. Utilizzare un anello sterile per raschiare le colonie e trasferirle nel tubo di perle di vetro per interpolazione salina. Agitare la sospensione per 30-60 secondi.

Ispezionare visivamente il campione, confrontandolo con lo standard McFarland. L'importo trasferito deve essere uguale o superiore allo standard. In caso contrario, aggiungere altro campione batterico e vortice. Di nuovo.

Una volta raggiunto lo standard McFarland, lasciare che l'inoculo si depositi per 15 minuti per consentire ai grumi di batteri più grandi di depositarsi. Quindi, utilizzare un nefi TER per misurare la densità dei batteri sospesi a zero. Il nefizio.

Per prima cosa posizionare un tubo di interpolazione di perline saline vuote nel nephi ter. Premere il pulsante di calibrazione per azzerare lo strumento, quindi posizionare lo standard McFarland 0.5 nel Nephi ter e premere nuovamente il pulsante di calibrazione. Una volta tarato lo strumento, rimuovere lo standard McFarland e inserire l'inoculo.

La lettura dell'inoculo deve essere uguale alla lettura standard di McFarland. Se la lettura è troppo bassa, rimuovere il tubo e trasferire altri batteri dalla piastra. Quindi vortice e rileggi l'esempio.

Se la lettura è troppo alta, aggiungere un'interpolazione salina al vortice del tubo. Quindi leggi di nuovo l'esempio. Continuare a regolare l'inoculo secondo necessità fino a quando la concentrazione dei batteri non corrisponde allo standard McFarland.

Quindi, utilizzare un pipettatore da 200 microlitri e una punta lunga resistente all'aerosol per rimuovere 100 microlitri di inoculo dal terzo superiore della provetta. Per evitare che i grumi si depositino sul fondo inoculato, il brodo Middlebrook seven H nine agita lentamente il brodo inoculato per 20 secondi per impiattare l'inoculo Inizia rimuovendo la piastra per microtitolazione dalla confezione del produttore. Se l'essiccante è blu o se la confezione di alluminio è danneggiata, non utilizzarla.

La piastra contiene già i 12 antimicrobici da testare in ogni pozzetto, inclusi i farmaci più efficaci o di prima linea e i farmaci di seconda linea. Versare con cura l'inoculo di brodo sette H nove in un trito, facendo attenzione a non generare aerosol. Quindi posizionare la piastra micro titter con l'etichetta rivolta verso l'esterno come mostrato qui e utilizzare un pipettatore a 12 canali per aggiungere 100 microlitri di inoculo a ciascun pozzetto.

Quindi, prepara le piastre per eseguire il conteggio delle colonie. Innanzitutto, preparare una piastra non diluita trasferendo un anello di un microlitro di campione dal pozzetto di controllo positivo alle sette piastre H 10 etichettate uno a uno. Quindi utilizzare l'anello per striare la piastra come mostrato qui.

Successivamente, per preparare una diluizione da uno a 50, trasferire un anello da un microlitro dal pozzetto di controllo positivo e farlo roteare nel tubo con 50 microlitri di striscia d'acqua. Un microlitro di questa diluizione sulla piastra etichettata da uno a 50. Inoculare le piastre di purezza pipettando 50 microlitri di inoculo dal trth su agar sanguigno opportunamente etichettato e sette piastre H 10 e striare per l'isolamento.

Quindi impilare un altro trth sopra il trth inoculato e metterli delicatamente nel contenitore di scarto. Applicare un sigillo adesivo sulla piastra per microtitolazione. Quindi, utilizzando il supporto bianco, premere con decisione su ciascun pozzetto per garantire un soffitto adeguato, assicurandosi che non vi siano pieghe.

Disinfettare la piastra micro titter strofinandola con un tovagliolo di carta imbevuto di un disinfettante cida tubercolare. Quindi posizionare la piastra per microtitolazione in un sacchetto di plastica e chiuderla con una termosaldatura. Infine disinfettare tutti i materiali, compresi i nephi, il vortice ltro, le piastre e i tubi strofinandoli con un disinfettante cida tubercolare.

In questo caso lo spray professionale viene utilizzato dopo che è trascorso un tempo sufficiente per garantire la disinfezione. 15 minuti per lo spray professionale. Le piastre vengono fissate con nastro adesivo posto in sacchetti di plastica e le forniture sigillate vengono rimosse dalla cabina di biosicurezza e posizionate nel passante.

Il sacchetto rosso scartato viene chiuso e sigillato con una fascetta a questo punto, tolto l'abito, gli stivaletti e i guanti. Dopo aver recato nell'anticamera e aver lavato le mani, rimuovere il respiratore e disinfettarlo e riporlo dopo essersi lavati nuovamente le mani, indossare un camice fresco e lasciare la suite BSL three. Successivamente, il contenitore di scarto viene sterilizzato in autoclave.

Successivamente, incubare la piastra per microtitolazione e le sette piastre H 10 e la coclea del sangue con il lato destro rivolto verso l'alto nell'incubatore da 35 a 37 gradi Celsius con il 5-10% di CO2 nel laboratorio BSL due. Questo è accettabile perché la piastra è ben sigillata e in un sacchetto di plastica, il tempo di generazione del mycobacterium tuberculosis è di circa 12-24 ore, quindi ci vorrà almeno una settimana prima che la crescita possa essere vista come la formazione di un pellet cellulare nella parte inferiore del controllo. Bene, il giorno 10, esegui una lettura manuale dello specchio posizionando la lama sigillata di un micro titter ST sulla piattaforma della scatola dello specchio.

Usa una lampada da scrivania per visualizzare la regolazione della crescita secondo necessità per ottenere il miglior contrasto. Controllare i pozzetti di controllo della crescita in questo caso, H 11 e H 12 guardando lo specchio. Se c'è crescita, il pozzo apparirà torbido o sembrerà avere sedimenti come mostrato qui.

Se non c'è crescita come mostrato in questo esempio, il pozzo apparirà chiaro. In questo caso, riposizionare la piastra nell'incubatrice e continuare l'incubazione per un massimo di 21 giorni. Per ogni condizione, confrontare la crescita con il controllo.

Ebbene, per ogni farmaco record, la prima diluizione che non ha crescita. Questa è la concentrazione inibitoria minima o MIC per il farmaco per esaminare i risultati utilizzando un lettore di piastre automatizzato come la visione inizia aprendo il software per piastre Myco TB a ST e registrando in posizione la piastra sigillata con il codice a barre rivolto verso l'esterno. Come mostrato qui, la crescita appare come torbidità o come un deposito di cellule sul fondo di un pozzo sullo schermo del computer.

Innanzitutto, esamina i controlli della crescita. Come prima. Se questo è negativo per la crescita, rimetti la piastra nell'incubatrice per un massimo di 21 giorni.

Se questo è positivo, registrare i risultati toccando il primo pozzetto, che non mostra crescita sullo schermo per ogni farmaco. In alcuni casi, batteri, sedimenti o farmaci precipitano sul fondo del pozzo. Questo fenomeno, noto come trailing, è indicato da diversi pozzetti con pellet della stessa dimensione e non è in realtà considerato crescita positiva.

Successivamente, vengono esaminate le sette piastre H 10 e di agar sanguigno per determinare le concentrazioni batteriche e valutare la purezza. La placca di agar sanguigno non dovrebbe mostrare alcuna crescita dopo 48 ore. La crescita sulla piastra di agar sanguigno indica contaminazioni con batteri in rapida crescita.

In caso di crescita, il test del microtitolazione deve essere ripetuto. La piastra di purezza H 10 dovrebbe avere la crescita di un organismo. La tubercolosi di tipo EM dovrebbe apparire lucida, colorata, rugosa e ruvida Se contaminata, il test del microtitolazione deve essere ripetuto da una coltura pura.

Per valutare la concentrazione batterica, contare le colonie sulla piastra a sette H 10. Quindi, utilizzando la tabella nel documento scritto di accompagnamento, calcolare il conteggio delle colonie. Il Mycobacterium tuberculosis è stato coltivato da un campione di paziente ed è stata valutata la resistenza agli antibiotici come descritto in questo video nella piastra mostrata qui, 12 diversi farmaci sono presenti in concentrazioni crescenti con le concentrazioni più alte nella parte superiore e le concentrazioni più basse nella parte inferiore.

La concentrazione inibitoria minima, o MIC, del farmaco è stata indicata dalla concentrazione più bassa del farmaco che non ha mostrato alcuna crescita ed è cerchiata nell'immagine mostrata qui utilizzando i breakpoint standardizzati stabiliti dal Clinical and Laboratory Standards Institute. I dati qui riportati suggeriscono che questo ceppo di TB sarà resistente all'Isid e alla Rifampicina. In vitro, gli alti microfoni osservati in diversi altri farmaci, tra cui oina, moxifloxacina, streptomicina e rifabutina, suggeriscono la resistenza del ceppo di tubercolosi EM a questi agenti.

I risultati della MIC devono essere utilizzati da uno specialista in malattie infettive esperto nel trattamento della tubercolosi per sviluppare un piano di trattamento personalizzato. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede circa 40 minuti per impostare un isolato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che si tratta di un agente patogeno respiratorio e una volta che si generano aerosol, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare il mycobacterium tuberculosis, il test di suscettibilità antimicrobica utilizzando il metodo di diluizione del micro brodo. Non dimenticare che lavorare con il mycobacterium tuberculosis può essere estremamente pericoloso e precauzioni come la protezione delle vie respiratorie dovrebbero sempre essere prese dove è necessario.