Koncentration af metabolitter fra low-density Plankton Fællesskaber for miljøet Metabolomics med kernemagnetisk resonans-spektroskopi

1. Filter Forberedelse til Fjern ekstraherbare

1. Anvende 25 mm diameter 0,22 um porestørrelse Durapore PVDF hydrofile filtre (Millipore). Placer filtre i et rent 500 ml Pyrex bægerglas med en pincet. Forskylning tre gange med destilleret vand. Hvirvel og man skylle at forhindre filtrene i at klæbe til hinanden. Tilsæt 300 ml Milli-Q (Millipore) eller tilsvarende vand af høj kvalitet. Autoklaveres for at lette fuldstændig fjernelse af ekstraherbare fra filtrene.
2. Hæld Milli-Q og igen tre gange skylles filtrene, denne gang med Milli-Q. Med en pincet sted individuelle filtre på en ren tør overflade (såsom aluminiumsfolie) og enten tør til en rimelig temperatur (fx 37 ° C) eller lufttørre. Filtrene er nu klar til brug.

2. Filtrering af prøvemateriale

1. For at demonstrere denne protokol, en Millipore rustfrit stål 3-sted filter manifold med 25-mm mikroanalyse filtrere kolonner med glas understøtterog en mekanisk pumpe anvendes. Anvendelse af aseptisk teknik, en enkelt 25 mm filter placeres på filteret søjlen base, anvendes søjlen og klemme sammen.
2. Load 15 ml af prøven til kolonnen, åbne stop-ventil på filteret manifolden, og tænd for pumpen. Filtreres under let tryk for at minimere cellebrud (<5 kPa). Andre pumper, såsom hånden eller en peristaltisk pumpe kan tilpasses til denne protokol. Ved lavere densitet prøver, kan successive tilsætninger af vand være nødvendigt, lad ikke filteret gå tørre i en længere periode mellem tilsætninger vand.
3. For marine prøver, efter at du har filtreret din prøve, kan du udføre en valgfri ferskvand skyl at reducere tilbageværende paramagnetiske ioner i prøven og på filteret. Dette kan hjælpe med mere præcis justering af spektrometeret magnet. Du skal blot forsigtigt tilføje en lille mængde vand og filtreres gennem din opsamlet prøve i slutningen.
4. Når filtrering er færdig, skal du slukke pumpen, og lad ventilen open så der stadig er et negativt tryk under filteret. Fjerne klemmen og filtreres kolonne.
5. Med den ene hånd, skal du bruge rene pincet til at tage fat i filteret. Fold filteret over sig selv, men gør ikke krøller. Med den anden hånd bruger læbe af en steril 2-ml mikrocentrifugerør at holde filteret. Slip pincetten derefter bruge dem til at re-greb begge kanter af filteret. Regrip i en 45 ° vinkel i folden.
6. Placere filteret i 2 ml rør og frigivelse så den åbnes med prøven vendende indad. Man kan placere op til to filtre ind i sterile 2 ml mikrocentrifugerør på denne måde. Hvis du bruger to filtre, sikre, at de overlapper så lidt som muligt. Umiddelbart fryser (mindst -30 ° C).

3. Ekstraktion af vandopløselige Metabolitter

1. Lyofilisere dine prøver natten over eller i mindst 10 timer.
2. Efter lyofilisering tilsættes en rustfri knuser til hvert rør (Tokken). Tilsæt 750 ul standardiseret kaliumphosphat NMR buffer i deuteriumoxid ^(2H> 90%) med 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonat (DSS) standard (KPi, 38,3 mM KH _{2PO 4,} 61,7 mM K ₂ HPO _4, DSS 0,1 mM, pH 7,0, 90% _D2O) ^2.
3. Sonikeres prøverne i 5 minutter ved 4 ° C i et vand sonikator (Bioruptor, Diagenode) for at fjerne cellemateriale fra filteret. Fjern filtrene med rene pincet.
4. Sprænge cellerne under anvendelse af en mølle knuser (1600 rpm) i 5 minutter.
5. Inkuber ved 65 ° C med rystning (1400 rpm) på en bench-top rysteapparat (Eppendorf) i 15 minutter.
6. Fjerne metallet svin med rene pincet og centrifugeres prøven ved 13.000 g i 5 minutter.
7. Aftappes supernatanten direkte til et NMR-rør for NMR-spektroskopi.

4. NMR-spektroskopi og dataanalyse

1. Læg din prøve i et NMR-spektrometer (her, en Bruker DRX-500 spektrometer udstyret medTXI probe med tredobbelte akse gradient styres af en computer XWIN-NMR).
2. Opnåelse 1D ^{1H-NMR-spektre} under anvendelse af passende tidligere publicerede fremgangsmåder ^2,15 fra XWIN-NMR grænseflade. I den foreliggende undersøgelse ^1H NMR-spektre blev registreret på et DRX-500 spektrometer, der arbejder ved 500,03 MHz ved 298 K. Resterende vand signaler blev undertrykt ved Watergate pulssekvens med en gentagelse tid på 1,2 sek. 128 transienter blev indsamlet for at få 32.000 datapunkter pr spektrum.
3. Overfør NMR data mapper til en PC installeret NMRPipe software ^16. Behandl de rå data og sæt DSS som 0 ppm henvisning derefter manuelt fase spektre. Digitalisere de spektrale data til et sæt af diskrete værdier ved at integrere eller 'Binning "dem med software som rNMR, Automics, eller anvende den offentligt tilgængelige FT2B pakke fra ECOMICS hjemmeside ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) ^3,17. I ther eksempel blev spektre integreret mellem 0,5 og 10,5 ppm over 0,032 ppm integrale regioner under anvendelse ECOMICS og normaliseret til enten DSS eller total signalintensitet. Udlæsningsdataene kan nu anvendes til nedstrøms statistisk analyse som hovedkomponentanalyse (PCA) under anvendelse af fri softwarepakker som ^R18.

5. Repræsentative resultater

Et eksempel på ^en H-NMR-spektre opnået ved anvendelse af de ovennævnte metoder er vist i figur 1. Disse prøver fra to tidspunkter i et mikrokosmos eksperiment viser klare forskelle på grund af alger metaboliske aktiviteter. Dagen 4-spektret viser en betydelig mængde af toppe, især i de 3-4 ppm-området sammenlignet med dag 1 prøve. Disse toppe kan tilskrives sukkeret fra blomstring diatomer i mikrokosmos. I et lignende eksperiment sammenligne væksten af ​​naturlige planktonsamfundene i kunstige eller naturlige havvand, s statistiske metodern sådan som hovedbestanddel analyse (PCA) score afbildning afledt fra sammenflettede NMR-spektre kan anvendes til at vise klare metaboliske forskelle mellem de to behandlinger (fig. 2), mens lastning plots kan identificere toppe i spektret, at formen fordelingen af ​​data . Sådanne resultater kan sammenlignes med data fra andre omik niveauer, såsom fra genomiske fingeraftryk metoder (Fig. 3). Disse NMR-toppe kan forespørges individuelt (fx ved BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) ^19, eller hele spektre kan analyseres statistisk (fx med SpinAssign på http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) ^2. I dette eksempel, var forskelle mellem behandlinger på grund af en overflod af toppe i sukker-regionen (3,39 ppm til 4,04 ppm) af spektre fra naturlige planktonsamfundet metabolitter, og adskillige toppe karakteristiske for kunstigt havvand samfund blev forsigtigt identified som lactat og formiat med SpinAssign.

Figur 1 Repræsentative ^1H NMR-spektre opnået fra behandlede prøver ved hjælp af denne fremgangsmåde. Mikrokosmos blev udtaget før (dag 1) og under (dag 4) en intens diatoméer blomstre. NMR-forsøg blev udført på et Bruker DRX-500 med signaler normaliseret til den interne standard tophøjden (DSS, 0 ppm).

Figur 2. Principal komponent analyse (PCA) score plot for sammenflettede NMR-spektre fra metabolomes af naturligt afledte mikrobielle planktoniske samfund dyrket i mikrokosmos med naturlig (åbne diamanter) eller kunstige (sorte cirkler) havvand. Klare metaboliske forskelle kan observeres i scatterplot. Lastnings-plot af en sådan analyse kan derefter anvendes til at identificere distinkte toppe af betydningsystemet, og disse toppe kan yderligere analyseres efter behov.

Figur 3. Et eksempel på multi-omik analyse kombineres NMR med genomiske data. Fællesskab sammensætning baseret på denaturerende gradient-gelelektroforese af 18S (til venstre) og 16S (højre) rRNA-generne fra de samme prøver som blev analyseret i figur 2 viser også forskellige mikrobielt samfund mønstre mellem naturlige (åbne romber) og kunstige (sorte cirkler) havvand mikrokosmer. En sådan korrespondance mellem metabolome og genom fra naturlige systemer, viser nytten af ​​denne fremgangsmåde.

Den filtrering og metabolit ekstraktion metode demonstreret her giver mulighed for mikrobiel planktoniske biomasse, der skal indsamles i tilstrækkelig mængde til NMR metabolomics. Mens kun ekstraktion af vandopløselige metabolitter med KPi og 1D ^1H-NMR er vist, kan andre ekstraktionsmidler og spektroskopiske fremgangsmåder anvendes. Et godt eksempel er anvendelsen af deutereret methanol som en semi-polært opløsningsmiddel, som har vist sig at frembringe overlegen NMR-spektre fra heterogene prøver og er mindre følsom over for forurening med paramagnetiske ioner, som findes i marine prøver ^15. I sådanne tilfælde bør pellet fra udvinding ovenstående skal opbevares i på hinanden følgende ekstraktioner. Vores tidligere arbejde har vist stabilitet spektre under sådanne inkubationstider og temperaturer og egnethed direkte vandig ekstraktion for NMR-spektroskopi ^15,20. Imidlertid forskere kan også foretrække at modificere ekstraktionstrin, for eksempel ved hjælp af en denarering trin at inaktivere enzymer forud for ekstraktion, eller ved hjælp af hurtig-quenching metoder, der afviger fra simpelthen at fryse cellerne som vist her. Derudover, medens de metoder her fremlagte er bedst egnede til at observere proportionale ændringer i metabolitter tværs behandlinger, hvis det ønskes, kan filtre på forhånd vejet og derefter vejet igen efter prøven filtrering og frysetørring til opnåelse af tør vægt, eller volumenet af prøven filtreret kan bruges til at få mere kvantitative metabolit kildedata.

Sidste ende er anvendeligheden af ​​NMR for planktoniske prøver begrænset af mængden af ​​masse, som med held kan opsamles, selv med høj densitet kulturer kan kræve store mængder (> 100 ml) for at opnå tilstrækkelig tør biomasse. Men inden for en eksperimenterende ramme, stabile isotop mærkning i mikro-eller mesokosmos eksperimenter, er 2D ^{1 H-13} C heteronukleær enkelt kvantekohærens (HSQC) tilgange muligt. Yderligere har vi yderligere anvendes 47 -mm filtre og 5-ml polypropylenrør at øge mængden af ​​biomasse, som kan indsamles for udvinding, som selv store mængder kan være nødvendig (dvs.> 2 L) for naturlige samfund fra, f.eks næringsfattige farvande, hvor celletætheder er lave.

Filtrering er fordelagtigt i forhold til centrifugering som det er vores observation, at nogle mindre mikrobiel taxa (især små heterotrofe bakterier) ofte ikke pellet godt. Filtrering kan udføres manuelt i marken, og de filtrerede mængde er kun begrænset af antallet af filtre til rådighed. Desuden kan overskydende medie eller vand kan fjernes på denne måde, og prøverne kan skylles efter behov. Naturligvis selv med filtrering bliver opsamlet samfund være begrænset til en størrelsesfraktion ned til filteret afskæring, som i dette eksempel er 0,22 um.