JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans

1, 1

1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.83.230.41, User IP: 54.83.230.41, User IP Hex: 911468073

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Vi beskriver en sensibiliserad metod för att identifiera postembryonic regulatorer av protein uttryck och lokalisering i

    Date Published: 2/13/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3442

    Cite this Article

    Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442, doi:10.3791/3442 (2012).

    Abstract

    C. elegans har visat sig vara en värdefull modellsystem för upptäckten och funktionell karakterisering av många gener och vägar gen 1. Mer sofistikerade verktyg och resurser för studier i detta system är att underlätta fortsatt upptäckten av gener med mer subtila fenotyper eller roller.

    Här presenterar vi en generell protokoll vi anpassat för att identifiera C. elegans gener med postembryonic fenotyper av intresse att använda RNAi 2. Detta förfarande är lätt modifieras för att analysera fenotypen val, antingen genom ljus eller fluorescens optik på ett dissekerande eller förening mikroskop. Denna screening protokoll kapitaliserar på de fysiska tillgångar organismen och molekylära verktyg för C. elegans forskarsamhället har producerat. Som ett exempel, visar vi att använda en integrerad transgen som uttrycker en fluorescerande produkt i en RNAi avsökning för att identifiera gener som krävs för den normala lokalisering av dennaprodukt i sent skede larver och vuxna. Först använde vi ett kommersiellt tillgängligt genomiskt RNAi bibliotek med full längd cDNA insatser. Detta bibliotek underlättar snabb identifiering av flera kandidater RNAi reduktion av kandidaten genprodukten. För det andra genererade vi en integrerad transgen som uttrycker vårt fluorecently taggade proteinet av intresse i en RNAi-känslig bakgrund. Tredje genom att exponera skuggade djur RNAi tillåter denna skärm identifiering av genprodukter som har en viktig embryonal roll som annars skulle maskera en post-embryonal roll i regleringen proteinet av intresse. Slutligen använder denna skärm ett mikroskop utrustat för enskild cell upplösning.

    Protocol

    1. Screening stamkonstruktion

    Den noggrann utformning av genomgången stam är kritisk för framgången av skärmen och har beskrivits på annat håll 3. För vissa forskare, är användning av en stam som uttrycker en synlig produkt från en transgen som behövs för experimentet. Många stammar som härbärgerar integrerade transgener är tillgängliga från CGC eller individuella forskare. Om ett transgent stam krävs för skärmen, men inte är tillgänglig, då den kan genereras med användning av en publicerad metod som bombardemang 4, UV / TMP 5, eller MOS transposoninfogning 6. För att visualisera vår protein av intresse, satte vi in det GFP-kodande sekvensen i korrekt läsram med den mogna cDNA-sekvensen (vi använde dbl-1-sekvensen). Eftersom denna GFP fusionsprotein inte syns genom att dissekera omfattning, använde vi en saminjektion markör som var synlig och påverkade inte visning av vår protein av intresse (TTX-3P :: RFP 7). Vi skapade sedan en integrerad transgen från extrakromosomal arrayen. Vi fann att bombardemang av transgen gav en låg antal kopior integrerad linje som varken räddade dissekeringsmikroskop fenotypen eller producerade synliga nivåer av GFP-märkt produkt (Beifuss och Gumienny, opublicerad). UV / TMP integration av en multipel kopia extrakromosomal array ursprungligen genom injektion 8,9 gav synliga, rädda nivåer av transgen produkt (figur 3A). Western blöt med anti-GFP-antikropp bekräftades att transgenen (allel namn texIs100) uttrycks och behandlas på rätt sätt (Beifuss och Gumienny, opublicerad). Integrerade transgener bör utparade fem gånger för att avlägsna främmande bakgrundsnivåer mutationer oavsett källa.

    För vårt skärmen, ville vi det enda protein av intresse att vara den transgena, påhängd form. Därför tog vi bort den funktionella endogena gENE genom att införa en förlust av-funktion mutant dbl-1-allelen.

    Slutligen har vi sensibiliserad stammen mot effekterna av RNAi. Den RNAi från biblioteket kommer till många gener, skapa en mer kraftig minskning i gen produkt, om djuren innehåller en mutation som sensibiliserar djuren att effekterna av RNAi 10,11 Vävnaden (er) av intresse bör beaktas när man väljer en lämplig RNAi sensibiliserande bakgrunden 11. Vi använde den kanoniska RRF-3 (pk1426) allelen för att göra vår screening stam. RRF-3 är en RNA-styrt RNA-polymeras (RdRp)-homolog som normalt inhiberar somatiska RNAi 10. Mutationer i andra RNAi överkänslighet gener som ERI-1 eller ERI-1 lin-15b kan användas i stället för att öka effektiviteten i RNAi 11-13.

    Screeningen stammen vi gjorde har genotypen RRF-3 (pk1426), texIs100, dbl-1 (NK3).

    2. Att välja och förbereda ettRNAi bibliotek

    Kommersiellt tillgänglig C. elegans cDNA-bibliotek utgör cirka 55% eller 87% av de förväntade generna i C. elegans individuellt (Vidal laboratoriet eller Ahringer lab bibliotek, respektive). Individuella kloner finns att köpa (Open Biosystems, Geneservice, Ltd.) Vi valde ORF-RNAi-bibliotek konstruerades av Vidal lab (Open Biosystems) eftersom dess kloner är oftast fulla längd cDNA Gateway klonats och redo för tillämpningar i efterföljande led (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Den ursprungliga Ahringer labbet genomiskt cDNA-bibliotek innehåller cDNA-fragment som inte är så stor nytta för efterföljande karakterisering experiment 14,15. Båda biblioteken använda en vektor som innehåller två T7-promotorer som flankerar insättningen (figur 1). Konstruktionerna odlas i bakteriell stam HT115, som uttrycker T7-polymeras vid induktion av isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG). Bakterier som innehåller biblioteket kloner inducerades med IPTG tillproducerar dsRNA (se steg 3,4).

    Duplicera hela biblioteket vid mottagandet och använda dubbla för alla experiment. De ursprungliga och dubbla biblioteken bör förvaras i olika -80 ° C frys som är anslutna till separata elledningar.

    3. Beredning av bakterier med bibliotek kloner

    1. (Inom två månader efter experimentet) bakterier streak från utvalda kloner utfodring bibliotek, samt positiva och negativa kontroller, på märkta LB-karbenicillin / tetracyklin plattorna vi växer 8 kulturer per 100 mm platta) och inkubera vid 37 ° C över natten ( > 16 timmar) (Figur 1). För varje 24-brunnsplatta, använder vi två kontroller. Den positiva kontrollen, BLI-4 (K04F10.4), producerar en dosberoende efter embryonal pheontype 16,17. Den negativa kontrollen, C06C3.5 är en förutsagd pseudogen ( WormBase.org ) som orsakar inga observerade fenotyper (Beifuss och Gumienny, opublicerad). (Inom två månader efter experimentet lämpligen först) Förbered 24-och nematod tillväxtmedium (NGM) plattor som innehåller 25 - 50 mikrogram / ml karbenicillin och 1 mM IPTG. Lagra vid 4 ° C.
    2. (Dag 1) För varje klon inokulera 2 ml LB-media innehållande 50 | ig / ml karbenicillin med en enda koloni från det strimmiga platta (er) (i Steg 3,1) med användning av standard steril teknik. Inkubera vid 37 ° C över natten (> 16 timmar) i en skakapparat till 220 till 240 varv per minut (fig 1). Lösningen ska vara grumlig efter 16 timmar.
    3. (Dag 2) Nästa morgon inducera dubbelsträngat RNA (dsRNA) produktion genom tillsättning av IPTG till kulturerna till en slutkoncentration av 1 mM. Inkubera kulturer vid 37 ° C, 220 - 240 varv per minut, under ytterligare 4 - 5 timmar. Detta steg ger en mer konsekvent och robust RNAi-inducerad knockdown av genprodukt än att förlita sig enbart på IPTG i agar av NGM plattan (i steg 3,5).
    4. Spot 30 pl vardera inducerade bakteriella culture i separata brunnar i en 24-brunnars NGM RNAi platta innehållande 25 - 50 | ig / ml karbenicillin och 1 mM IPTG (Fig. 1, se figur 4 för mall används för att spåra RNAi experiment). Lägg plattor, avslöjats, i ett sterilt dragskåp i 20 minuter eller tills de bakteriella fläckarna är torra. Låt inte strykfria. Övertorkning gör kanterna av agar att dra bort från plattan och djur kommer att vara oersättlig om de kryper in i de resulterande sprickor.

    4. Framställning av nematoder

    Börja med en stegvis befolkning på nematoder. Iscensätta djur minskar chansen att skillnaderna mellan kontrollen och de experimentella RNAi försöken är helt enkelt beror på skillnader i utvecklingsstadium av djuren (dock om RNAi orsakar en utvecklingsförsening, bör detta noteras av rastret (figur 2)) . Dessutom startar RNAi experiment med L1 larver undanröjer potentiella felkällor effekter av embryonal dödlighet med RNAi för genes som också kan spela postembryonic roller av intresse.

    Stadieindelning åstadkommes genom att först blekning en blandad fas population av screening stam, vilken endast äggskal-skyddade embryon överleva. Detta stadier djur till inom ca 12 timmar vid 20 ° C eller ca 18 timmar vid 16 ° C 18. För att mer tätt skede djur, gripa djur i det första larvstadiet (L1) genom att låta embryon lucka i M9 medium utan mat. Utmärglade L1 som släpps ut på livsmedel CV tillväxten från samma utgångspunkt ålder 19.

    1. (Dag 1) Använd tre 100 mm plattor av fed, rena screening stam djur som innehåller gravida vuxna och embryon. Tvätta djur från plattorna med sterila M9 genom pipettering vätska över plåtytan försiktigt för att lossa djur och embryon. Överföra tvätt i en steril 15 ml rör med skruvlock.
    2. Om tvättningen är större än 3,5 ml, centrifugera ner djuren (~ 3000 rpm under 30 sekunder) och avlägsna vätska till 3,5 ml. Om tvättningen är lESS än 3,5 ml, tillsätt H 2 0 eller M9 till röret till totalt 3,5 ml.
    3. Använd lämplig skyddsutrustning (labbrock, handskar och skyddsglasögon) vid hantering av kemikalier. Blanda 0,5 ml 5 N NaOH med 1 ml färsk blekmedel (5% natriumhypoklorit, mindre än 1 år gamla). Lägg denna blandning till 3,5 ml nematoden tvätt. Starta en timer som räknar upp. Denna process bör inte ta mer än 10 minuter. Om den gör det, då embryon kommer att hotas och avkastning kan minskas, eller blekmedel är gammal och bör bytas ut.
    4. Vortex röret under cirka 10 sekunder. Upprepa virvling varannan minut under 4 till 10 minuter. Efter varje virvling, observera lösningen under ett dissekerande utrymme för djurkadaver.
    5. När embryona frigörs och vuxna fragmenteras (6 - 8 minuter), pelleten embryona genom spinning av röret i en bordscentrifug (~ 3000 rpm, 30 sekunder).
    6. Aspirera så mycket av den supernatant som möjligt utan att störa pelleten. Var försiktig, integirig.
    7. Tillsätt steril M9 till ~ 10 ml. Skaka snabbt eller skaka väl suspendera pelleten.
    8. Snurra och avlägsna supernatanten återigen. Om lukten av blekmedel kan upptäckas i röret, upprepa skölj vid behov.
    9. Återsuspendera embryon i 10 - 15 ml steril M9 och överför till en liten (25 ml) Erlenmeyerkolv (för luftning). Skaka vid den rätta temperaturen för stammen och experimentet (15 - 25 ° C) över natten (> 16 timmar vid 20 ° C). Under denna tid kommer djuren all kläcks och gripande i L1 diapause.
    10. (Dag 2) Blanda ned L1-stegs djur i en 15 ml rör och återsuspendera i 0,5 - 1 ml M9-(~ 3000 rpm, 30 sek.). Placera 5 pl lösning i en separat platta och räkna antalet djur. Göra justeringar volymen om det behövs, för att ge 30 maskar / 3 - 10 pl lösning.
    11. Upptäcka ca 30 hypoklorit synkroniserade djur L1-steget på de bakterier i varje brunn i den preparerade 24-brunnsplatta. Alltför många more än 30 djur per mycket väl kan resultera i att befolkningen svältande innan förfallodagen. Låt plattan torka med locken snett. Sätt tillbaka locket och fäst den med ett gummiband. Vänd plattan och placera den vid lämplig temperatur för den tid som behövs för att göra poäng på önskad skede. Eftersom RRF-3 (pk1426) är en temperaturkänslig allel, våra screening stam djur vuxit från 15 till 17 ° C under tre till fyra dagar för att observera L4 till vuxna steg djur (figur 1).

    5. Observation av nematoder

    (Dag 5) När nematoderna har vuxit till önskad scenen (Figur 2A), bekräftar att de positiva och negativa kontroller de förväntade fenotyper med hjälp av en dissektionsmikroskop. Vi använder BLI-4 som en kontroll för RNAi effekt, eftersom det ger dosberoende efter embryonala defekter som sträcker sig från blåsor vuxna (mild RNAi fenotyp, ej visad) till utvecklingsmässigt greps, liten larver (stark, expected RNAi fenotyp) (figur 2B). Sedan observera djuren i varje experimentell brunn med användning av ett dissekerande mikroskop och noten uppenbara onormala fenotyper som induceras av RNAi (figur 2C). Efter kontrollerna bekräftas och grova fenotyper noteras screena RNAi experiment för fenotyper av intresse. Vi använder en förening mikroskop utrustat med fluorescens och en 63x mål att observera minst fem djur från varje RNAi experiment börjar med kontroller (Figur 3).

    1. Framställa en slid (standard 75 x 25 mm) genom att göra en 4%-ig agar dyna (4% agar i H2O). För att säkerställa en enhetlig tjocklek av agar pad, placera en ren glasskiva mellan två distanser (varje Spacer är tillverkad av ett objektglas med två lager av lab band på det). Pipetten ca 100 | il (två till tre droppar från en glas Pasteurpipett) av smält 4% agar på centrum av den rent objektglas. Bilda ett agar pad genom att täcka den smälta agar med en extra bild placeras snabbt men försiktigt på toppen av distanserna ennd den smälta agar. Exponera agar dynan genom att försiktigt skjuta glasskivor isär lämnar dynan ansluta sig till en bild.
    2. Placera en ~ 5 pl droppe anestesi (levamisol eller natriumazid, till exempel) på agar dynan. Mount 8 - 12 djur i narkos. Täck med en 22 x 22 mm # 1,5 täckglas (eller tjockleken på täckglaset bäst lämpade för mikroskop) och iaktta djuren med hjälp av en förening mikroskop.
    3. Record gen, antal observerade djur och fenotyp resultaten för varje RNAi experiment. För en skärm, framställa och använda en standardmall (se exempel figur 5).
    4. Verifiera RNAi-producerade fenotypen av en annan, sekundär fenotyp, om möjligt, och genom att upprepa experimentet. (Till exempel visas det exempel skärm som används förändring av GFP-märkta DBL-1 lokalisering som en primär skärm och kroppsstorlek som en sekundär skärm 20.) Kan användas från samma strimma (förvaras vid 4 ° C) i upp till bakterier två månader. Äldre strimmor kan Result i dålig tillväxt i flytande natten kulturer och bör utströks först.
    5. Sekvens som är åtminstone en ände av cDNA-insättningen för att bekräfta att insatsen matchar biblioteket märket (Ahringer biblioteket har haft en tillförlitlighet analys, se http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) 21. Rekommenderade primrar (för insert från antingen bibliotek) glödga på ställen i L4440-härledda vektorn och flankerar insertionsstället: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 'och 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (primer M13f20).

    Med denna metod kan en enskild person steg rimligt och observera två till fyra uppsättningar av experiment varje vecka. Till exempel, iscensatt djur på måndag och tisdag kan observeras torsdag och fredag, respektive, och kan återigen arrangeras på fredag ​​och lördag för måndag och tisdag observation. Beroende på fenotypen (er) screenades varje dag, kan en uppsättning innefatta en 24-brunnsplatta av föreningen mikroscopy eller mer om fenotypen snabbt identifieras. Således kan minst 88 olika RNAi experiment observeras i en vecka, med hänsyn till positiva och negativa kontroller och stödnivå screening. En dissektionsmikroskop skärmen kunde utföras mycket snabbare, utan att för montering djur på bilder för visning. Flera personer kan också öka ett Labs genomströmning genom svindlande scheman och / eller använder flera mikroskop. En alternativ metod för odling av djur på en tunn film av agar och överföra en skiva av agar innehållande djur direkt till en slid för visning kan spara tid. Denna variation har framgångsrikt använts för screening manliga svans avvikelser 400 gångers förstoring 22.

    6. Representativa resultat

    Exempel på normala och förändrad lokalisering av GFP-märkta DBL-1 visas i figur 3. Normal uttryckning av GFP-märkta DBL-1 innefattar ventrala nerv organ cord cell och en rad av punctae (figur 3A). DBL-1 is allvarligt försvagat när djur matas RNA som förhindrar dbl-1 mRNA translation (Figur 3B). dbl-1 (RNAi) också producerar små djur, den sekundära skärmen i detta exempel (data visas ej). Gener som påverkar DBL-1 lokalisering identifieras lätt genom RNAi användning av en stam utformad för detta (Figur 3C).

    Figur 1
    Figur 1. Screen system för att identifiera extracellulära regulatorer för DBL-1 signalering. Bakterier från matningen biblioteket odlas över natten, inducerades med IPTG och inkuberades vid 37 ° C under ytterligare 4 timmar för att tillåta bakterierna att producera dubbelsträngat RNA (dsRNA). 30 pl av den inducerade bakteriekultur fläckades per brunn på en 24-brunnars NGM (nematod tillväxtmedium) platta innehållande 25 | ig / ml karbenicillin och 1 mM IPTG och fick torka i ett sterilt dragskåp. Vi steget först larvstadiet (L1) larver genom att låta hypoklorit-behandlad EMBRomslagen kläcks i media utan mat, som inducerar en L1 diapause (arresterades utveckling). Cirka 30 synkroniserade L1 steg djuren stryks på var och innehåller bakterier från RNAi biblioteket, vilket gör iscensatt djuren att återuppta tillväxten och konsumera dsRNA som skapas av bakterierna 23. Efter 72 h vid 15 ° C, de unga vuxna maskar screenas för en synlig fenotyp. I denna ålder, kroppsstorlek defekter är uppenbara och fluorescens är ljus från texIs100 transgenexpression.

    Figur 2
    Figur 2. Exempel på fenotyper för att identifiera innan screening. Alla bilder av djur i en brunn togs vid samma förstoring med användning av ett dissektionsmikroskop. Djuren var alla avbildades ca 72 timmar efter plätering som utsvultna L1 larver. Alla bilder behandlades på samma sätt. A) RNAi av en gen som ger inga grova morfologiska defekter. Djur visas vild typ. B) RNAI BLI-4. Djur visa greps utveckling, och är små i jämförelse med djuren i panelen A. C) RNAi i dpy-13. Djur är i samma utvecklingsstadium som djur i panel A, men visa en "dumpy" kropp morfologi.

    Figur 3
    Figur 3. Exempel på fluorescensmärkta protein och hur RNAi av specifika gener förändrar lokalisering mönster. Alla bilder togs vid 630X förstoring med spinning disk konfokalmikroskopi, 5 sek. exponering. Skalstreck = 10 pm. Alla bilder behandlades på samma sätt. Öppna pilspetsar visar cellkroppar. Pilarna markerar linje av punctae. Fyllda pilhuvuden anger några avvikande lokal GFP-märkta DBL-1. A) RNAi-matade pseudogen C06C3.5 ("wild-type"). B) dbl-1 (RNAi) kontroll. C) RNAi av en gen som krävs för normal lokalisering av GFP-märkta DBL-1.

    "Figur Figur 4. Mall exempel för att spåra RNAi experiment (bibliotek kloner) i 24-brunnar. Denna mall kan användas för att skapa en permanent registrering av experimenten, till skillnad från direkt märkning plattor.

    Figur 5
    Figur 5. Mall exempel för inspelning RNAi fenotyper. Växa efter behov.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den RNAi screening metod som presenteras här ger en känslig och snabb analys av genprodukter som krävs för en normal (eller transgena) postembryonic fenotyp. Det visade exemplet är en skärm för gener som är involverade i den subcellulära lokaliseringen av en fluorescensmärkt märkt protein. Emellertid kan detta protokoll ändras för att identifiera gener som påverkar andra postembryonic fenotyper av intresse.

    Denna metod utnyttjar en kandidat gen strategi med hjälp av en RNAi bibliotek. Framåt genetiska skärmar med mutagenestekniker identifiera slumpmässigt inducerade nya alleler, men dessa alleler kräver mycket tid, ansträngning och / eller pengar för att identifiera 24. Med cDNA-biblioteket, och å andra sidan, sekvensering av cDNA-insättningen som orsakade en RNAi fenotyp av intresse snabbt bekräftar kandidatgen. Även kloning färdiga cDNA inlägg underlätta nedströms analyser av de identifierade kandidater. Vidare gener som är dödliga när muteradekan identifieras och analyseras med RNAi. Genom att placera kläckta djur på de inducerade bakterierna medger denna metod observation av postembryonic fel på gener som också har viktiga embryonala roller.

    Var noga med att bekräfta att observerade djur inte svalt. Svält kan påverka fenotypen hos djuret. Om nya RNAi fenotyper har identifierats i hungriga djur, upprepar att bekräfta att fenotypen är ett resultat av RNAi och inte svält. För att förhindra svält, använda färska bakterier som har växt till stationär fas (tillväxt mediet är väldigt "grumlig"), och använd endast ~ 30 djur per brunn.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Vi har inget att lämna ut.

    Acknowledgements

    Författarna vill tacka Dr Rick Padgett (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) för gåva dbl-1 cDNA och Dr Christopher Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) för en injektion markör. Dr Barth Grant labb utförde bombningarna genkanonen för låg antal kopior integrering av GFP-märkta dbl-1-konstruktionen. Den René Garcia laboratoriet lämnat tekniskt bistånd under skapandet av texIs100. Den René Garcia, Robyn fluffmaterial och Hongmin Qin laboratorier som produktivt råd. Detta arbete har finansierats av nystartade medel från TAMHSC Institutionen för molekylär och cellulär medicin. Föreningen omfattning och spinning disk konfokala köptes med medel från institutionen och TAMHSC College of Medicine kontor dekanus.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NGM Agar Nematode growth medium IPM Scientific, Inc Can be prepared following NGM agar protocol25
    M9 Medium 22mM KH2PO4,
    42mM Na2HPO4,
    86mM NaCl,
    1 mM MgSO4
    Agar-Agar EMD Millipore 1.01614.1000 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter).
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677 0.25%
    IPTG Research Products International Corp. I56000-5.0 1 mM final concentration
    carbenicillin Research Products International Corp. C46000-5.0 50 μg/ml working dilution
    LB Broth Lennox BD Biosciences 240230 20 g/liter
    tetracycline Sigma-Aldrich 268054 12.5 μg/ml working dilution
    sodium hypochlorite Any Supplier 5% household bleach Use fresh bleach.
    sodium hydroxide Any Supplier CAS 1310-73-2 5 N stock
    M9 medium Wormlab Recipe Book http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab 26
    levamisol Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM working dilution
    sodium azide Fisher Scientific S227 10 mM in M9 working dilution
    24-well plate Greiner Bio-One 662160 VWR distributor
    microscope slides Any Supplier 75 x 25 x 1 mm
    microscope cover slips Any Supplier 22 x 22 mm No.1.5 Use the thickness recommended by the microscope manufacturer.
    compound microscope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives and filters to match the needs of the experiment.
    media pump Manostat Varistaltic pump Kate model #72-620-000 Use tubing and settings appropriate for the machine

    References

    1. Giacomotto, J. & Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we? Br. J. Pharmacol. 160, 204-216, doi:10.1111/j.1476-5381.2010.00725.x (2010).
    2. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138, doi:10.1385/1-59745-151-7:127 (2006).
    3. Boutros, M. & Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566, doi:10.1038/nrg2364 (2008).
    4. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., & Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
    5. Yandell, M.D., Edgar, L.G., & Wood, W.B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
    6. Frokjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383, doi:10.1038/ng.248 (2008).
    7. Giordano-Santini, R. & Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci., doi:10.1007/s00018-011-0670-1 (2011).
    8. Berkowitz, L.A., Knight, A.L., Caldwell, G.A., & Caldwell, K.A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, DOI: 10.3791/833 (2008).
    9. Mello, C. & Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
    10. Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
    11. Zhuang, J.J. & Hunter, C.P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. doi:10.1534/genetics.111.127209 (2011).
    12. Samuelson, A.V., Klimczak, R.R., Thompson, D.B., Carr, C.E., & Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
    13. Wang, D., et al.. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597, doi:10.1038/nature04010 (2005).
    14. Fraser, A.G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
    15. Kamath, R.S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
    16. Peters, K., McDowall, J., & Rose, A.M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. 129, 95-102 (1991).
    17. Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., & Rose, A.M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
    18. Byerly, L., Cassada, R.C., & Russell, R.L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33, doi:0012-1606(76)90119-6 [pii] (1976).
    19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook., 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006).
    20. Savage-Dunn, C., et al Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
    21. Qu, W., et al. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 170, doi:1471-2164-12-170 (2011).
    22. Nelson, M.D., et al. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010, doi:10.1371/journal.pgen.1002010 (2011).
    23. Timmons, L. & Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
    24. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M.M., Pe'er, I., & Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867, doi:nmeth.1249 (2008).
    25. Lewis, J.A. & Fleming, J.T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
    26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter