Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans

Le but de cette procédure est d’identifier les régulateurs post-embryonnaires de l’expression et de la localisation des protéines dans l’élégance C à l’aide d’un criblage génomique basé sur l’ARNi et de protéines marquées par fluorescence. Une fois la souche de criblage appropriée construite, une banque d’ARNi est choisie. La première étape de la procédure consiste à regrouper les clones de la banque dans des bactéries.

Les bactéries sont ensuite sélectionnées, cultivées et nourries avec des nématodes de l’élégance échelonnés. Après avoir laissé les nématodes se développer pendant 72 heures, ils sont observés pour des altérations du phénotype d’intérêt. En fin de compte, les changements dans l’expression ou la localisation subcellulaire de la protéine attaquée sont visualisés par microscopie à fluorescence.

Cette méthode permet d’identifier les gènes nécessaires à la bonne localisation subcellulaire d’une protéine marquée par fluorescence. Cependant, ce protocole peut être modifié pour identifier des gènes affectant d’autres phénotypes post-embryonnaires d’intérêt. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants publiés est que nous avons optimisé la cohérence et le niveau de la réponse ARNi chez les animaux en induisant la production de l’ARN double brin chez les bactéries avant l’ensemencement.

Dans les deux mois suivant le début de l’expérience, préparez la première bactérie de la bibliothèque de clones à partir de clones sélectionnés de la bibliothèque d’alimentation, ainsi que des contrôles positifs et négatifs sur des plaques de tétracycline carbonique LB. Pour un contrôle positif, utilisez un clone contenant un gène qui produit un phénotype post-embryonnaire dépendant de la dose, tel que BLE quatre. Pour un contrôle négatif, utilisez un vecteur vide ou un clone contenant un pseudogène prédit sans phénotypes observés.

Incuber les plaques pendant la nuit pour chaque clone inoculer deux millilitres de milieu LB contenant 50 microgrammes par millilitre. L’acide carbonique avec une seule colonie à partir des plaques striées, incube les cultures pendant la nuit avec agitation le lendemain matin. Les solutions devraient être la production induite par le trouble d’ARN double brin en ajoutant de l’IPTG aux cultures et en les incubant pendant quatre à cinq heures supplémentaires dans les mêmes conditions.

L’ajout d’IPTG garantit une neutralisation du produit génique induite par l’ARNi plus cohérente et plus robuste que de compter uniquement sur l’IPTG et la vis sans fin de la plaque NGM Après l’incubation de l’IPTG, localisez 30 microlitres de culture de chaque clone dans chaque puits des plaques d’ARN NGM préparées à 24 puits. Un clone par puits. Chaque plaque doit avoir deux puits dédiés aux commandes.

Déterminez soigneusement l’emplacement de chaque bibliothèque. Clonez dans les plaques à 24 puits, placez maintenant les plaques découvertes dans une hotte à flux stérile pour qu’elles sèchent pendant environ 20 minutes. Ne laissez pas les bords de la gélose se détacher de la plaque.

Une fois les nématodes étagés séchés dans les plaques, des instructions sur la préparation des nématodes sont données. Dans la section suivante, commencez par une population statuée de nématodes au premier stade larvaire ou L un. À partir de L, les larves contournent les phénotypes létaux embryonnaires potentiels.

Le fait d’avoir une population d’animaux à dépister augmente également la confiance dans le fait que les variations observées sont dues à l’ARNi et ne sont pas simplement des variations normales qui se produisent à différents stades. Cependant, si l’ARNi provoque un retard de développement, cela doit être noté par le cribleur Bleach. Une population à un stade mixte de la souche de dépistage.

Seuls les embryons protégés par la coquille d’œuf survivront à cette étape jusqu’à 12 heures si elle est menée à 20 degrés Celsius ou jusqu’à 18 heures. S’il est effectué à 16 degrés Celsius le jour où les cultures bactériennes sont inoculées. Sélectionnez trois plaques de 100 millimètres de souches d’animaux de criblage qui sont en bonne santé et qui contiennent à la fois de la gravité, des adultes et des embryons.

Lavez tous les animaux dans un milieu stérile M neuf et transférez le lavage dans un tube stérile de 15 millilitres avec un bouchon à vis. Si la quantité de lavage est supérieure à 3,5 millilitres, essorez sur les animaux et retirez tout le liquide sauf 3,5 millilitres. Si moins de 3,5 millilitres.

Augmentez le volume à 3,5 millilitres avec de l’eau ou M neuf pour libérer les embryons des adultes à 1,5 millilitres d’un mélange d’hydroxyde de sodium et d’eau de Javel à chaque lavage. Laissez les animaux incuber pendant 10 minutes maximum dans cette solution. Après avoir démarré une minuterie, vortex chaque tube pendant 10 secondes et répétez le vortex toutes les deux minutes.

Après chaque vortex, observez la solution sous une lunette de dissection pour les carcasses d’animaux. En six à huit minutes, les adultes seront fragmentés et les embryons devraient être libérés. Retirez les embryons de la solution d’eau de Javel en les granulant et en enlevant autant de surnageant que possible sans déranger la pastille.

Ensuite, remettez en suspension le granulé dans un volume de 10 millilitres en ajoutant du M neuf stérile et en utilisant l’agitation. Répétez ce processus de lavage au moins une fois de plus jusqu’à ce que l’odeur de l’eau de Javel soit complètement indétectable. Pour un stade plus serré, les animaux les arrêtent dans leur stade L un en faisant éclore des embryons dans M neuf milieu sans nourriture.

Pour ce faire, les embryons de M neuf sont transférés dans un petit erlenmeyer. Agitez le flacon pendant la nuit à la bonne température pour la souche et expérimentez. Pendant ce temps, les animaux éclosent tous et s’arrêtent dans la diapause L one le lendemain.

Reprenez la croissance des larves à partir d’un point temporel défini en les transférant dans les bactéries préparées exprimant le RN double brin. C’est le même jour que les plaques de 24 puits ont été repérées avec des bactéries. Commencez par transférer les animaux L one dans un tube de 15 millilitres et faites-les tourner. Ensuite, concentrez les animaux dans un demi-millilitre à un millilitre de M neuf et placez cinq microlitres de nématodes concentrés sur une plaque.

Comptez le nombre d’animaux sur la plaque et ajustez la solution concentrée de nématodes. TE 30 vers pour trois à 10 microlitres. Enfin, repérez environ 30 L d’animaux à un stade sur les bactéries dans chaque puits de la préparation.

24 plaque de puits plus de 30 animaux par puits peut entraîner la famine Une fois que les taches ont séché, ce qui prendra quelques minutes, fixez le couvercle avec l’élastique incubez les animaux à l’envers à la température et à la durée requises pour marquer les animaux au stade souhaité. Une fois que les nématodes sont prêts à être dépistés, confirmez que les témoins positifs et négatifs produisent les phénotypes attendus. Observez ensuite les animaux de laboratoire à la recherche d’anomalies du développement.

Ensuite, à l’aide d’un microscope de dissection, montez huit à 12 animaux de chaque puits sur des lames de PET Agri à 4 % avec une goutte de cinq microlitres d’anesthésique. Après avoir appliqué le lamelle appropriée, observez au moins cinq animaux à l’aide de la microscopie composée. Tenez une base de données organisée du gène, du nombre d’animaux observés et des résultats phénotypiques.

Pour chaque expérience d’ARN, vérifiez tout phénotype produit par l’ARNi R par un autre phénotype secondaire si possible, et en répétant l’expérience, les expériences répétées peuvent utiliser des bactéries de la même strie. Les stries plus anciennes peuvent entraîner une faible croissance dans les cultures liquides de nuit, et doivent être retracées en premier. Certaines cultures bactériennes ne se développent pas bien à cause du produit génique exprimé dans leur plasmide.

Dans ce cas, il suffit de concentrer les bactéries avant de plaquer. Pour un dépistage continu, il est important de garder suffisamment d’embryons toujours prêts pour la stadification. La souche de dépistage doit toujours être nourrie, non affamée et exempte de contaminants susceptibles d’affecter le phénotype d’intérêt.

Nous avons établi un calendrier d’entretien pour l’alimentation des animaux. Les gènes qui affectent la localisation de DBL one ont été identifiés par ARNi à l’aide d’un plan de souche pour ce dépistage. L’expression normale de l’étiquette GFP dbl one comprend les corps cellulaires du cordon nerveux ventral et une rangée d’animaux puncti nourris avec de l’AR antisens à DBL.

Un ARNm a montré une expression sévèrement atténuée de DBL one. Ces animaux étaient également petits, comme les animaux dépourvus de DBL L un, fonctionnel. Le criblage de l’ARN I a permis d’identifier avec succès de nombreux autres gènes dont les produits affectent la localisation de DBL one, élargissant ainsi notre compréhension de la façon dont le TGF bêta est trafiqué subcellulaire et fournissant un point de départ pour de nombreuses autres recherches.

En utilisant cette méthode, une seule personne peut raisonnablement mettre en scène et observer deux à quatre séries d’expériences chaque semaine. Par exemple, les animaux mis en scène le lundi et le mardi peuvent être observés respectivement le jeudi et le vendredi, et les animaux peuvent à nouveau être mis en scène le vendredi et le samedi pour le lundi et le mardi. Observation Tout en suivant cette procédure sur l’ensemble de votre écran.

Il est important de garder beaucoup d’embryons prêts pour la stadification, alors maintenez régulièrement la souche de dépistage. De plus, il est important de prendre des notes détaillées sur toutes les observations.