RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, postembryonale Regulatoren der Proteinexpression und -lokalisation in C elegance mit Hilfe eines RNAi-basierten genomischen Screenings und fluoreszenzmarkierter Proteine zu identifizieren. Sobald der geeignete Screening-Stamm konstruiert ist, wird eine RNAi-Bibliothek ausgewählt. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Klone der Bibliothek in Bakterien zu verpacken.

Die Bakterien werden dann selektiert, gezüchtet und an abgestufte c elegance Nematoden verfüttert. Nachdem die Nematoden 72 Stunden lang gewachsen sind, werden sie auf Veränderungen des interessierenden Phänotyps beobachtet. Letztendlich werden Veränderungen in der Expression oder subzellulären Lokalisation des angegriffenen Proteins mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.

Mit dieser Methode können Gene identifiziert werden, die für die korrekte subzelluläre Lokalisierung eines fluoreszenzmarkierten Proteins erforderlich sind. Dieses Protokoll kann jedoch modifiziert werden, um Gene zu identifizieren, die andere postembryonale Phänotypen von Interesse beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden veröffentlichten Protokollen besteht darin, dass wir die Konsistenz und das Niveau der RNAi-Antwort bei Tieren optimiert haben, indem wir die Produktion der doppelsträngigen RNA in Bakterien vor dem Plattieren induziert haben.

Demonstration des Verfahrens wird Kathy Fuss, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Innerhalb von zwei Monaten nach Beginn des Experiments wird die Klonbibliothek die ersten Streifenbakterien aus ausgewählten Klonen der Fütterungsbibliothek sowie Positiv- und Negativkontrollen auf LB-Kohlensäuretetracyclinplatten vorbereiten. Verwenden Sie für eine Positivkontrolle einen Klon, der ein Gen enthält, das einen dosisabhängigen postembryonalen Phänotyp erzeugt, wie z. B. BLE vier. Verwenden Sie für eine Negativkontrolle einen leeren Vektor oder einen Klon, der ein vorhergesagtes Pseudogen ohne beobachtete Phänotypen enthält.

Inkubieren Sie die Platten über Nacht, impfen Sie für jeden Klon zwei Milliliter LB-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter. Kohlensäure mit einer einzigen Kolonie aus den Streifenplatten inkubieren, die Kulturen über Nacht unter Rühren am nächsten Morgen inkubieren. Die Lösungen sollten eine trübungsinduzierte Produktion von doppelsträngiger RNA durch Zugabe von IPTG zu den Kulturen sein und sie weitere vier bis fünf Stunden unter den gleichen Bedingungen inkubieren.

Die Zugabe von IPTG gewährleistet einen konsistenteren und robusteren RNAI-induzierten Knockdown des Genprodukts, als wenn man sich ausschließlich auf das IPTG und die Schnecke der NGM-Platte verlässt. Nach der IPTG-Inkubation werden 30 Mikroliter Kultur von jedem Klon in jede Vertiefung der vorbereiteten 24-Well-NGM-RNAi-Platten gegeben. Ein Klon pro Well. Jede Platte sollte über zwei Vertiefungen verfügen, die den Kontrollen gewidmet sind.

Prüfen Sie sorgfältig den Standort jeder Bibliothek. Klonen Sie in die 24-Well-Platten, legen Sie nun die unbedeckten Platten in eine sterile Durchflusshaube, um sie etwa 20 Minuten lang zu trocknen. Lassen Sie nicht zu, dass sich die Ränder des Agars von der Platte lösen.

Nach dem Trocknen in abgestuften Nematoden auf den Platten werden Anweisungen zur Nematodenvorbereitung gegeben. Beginnen Sie im nächsten Abschnitt mit einer abgestuften Population von Nematoden im ersten Larvenstadium oder L 1. Beginnend mit L umgeht eine Larve potentielle embryonale letale Phänotypen.

Eine gestaffelte Population von Tieren zum Screening erhöht auch die Sicherheit, dass alle beobachteten Variationen auf die RNAi zurückzuführen sind und nicht einfach normale Variationen sind, die in verschiedenen Stadien auftreten. Verursacht die RNAi jedoch eine Entwicklungsverzögerung, sollte dies durch den Screener Bleach vermerkt werden. Eine gemischte Population des Screening-Stammes.

Nur durch Eierschalen geschützte Embryonen überleben diesen Schritt innerhalb von 12 Stunden, wenn die Tiere bei 20 Grad Celsius oder innerhalb von 18 Stunden durchgeführt werden. Wenn sie an dem Tag, an dem die Bakterienkulturen geimpft werden, bei 16 Grad Celsius durchgeführt wird. Wählen Sie drei 100-Millimeter-Platten mit Screening-Stämmen aus, die gesund sind und sowohl Schwerkraft, adulte Tiere als auch Embryonen enthalten.

Waschen Sie alle Tiere in sterilen M nine-Medien und füllen Sie die Wäsche in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen mit Schraubverschluss um. Wenn die Wäsche mehr als 3,5 Milliliter beträgt, schleudern Sie die Tiere an und entfernen Sie alle bis auf 3,5 Milliliter Flüssigkeit. Wenn weniger als 3,5 Milliliter.

Erhöhen Sie das Volumen auf 3,5 Milliliter mit Wasser oder M neun, um die Embryonen von den Erwachsenen bei 1,5 Millilitern einer Mischung aus Natriumhydroxid und Bleiche bei jeder Wäsche zu befreien. Lassen Sie die Tiere nicht länger als 10 Minuten in dieser Lösung inkubieren. Nachdem Sie einen Timer gestartet haben, wirbeln Sie jedes Rohr 10 Sekunden lang und wiederholen Sie das Vortexen alle zwei Minuten.

Nach jedem Vortexen die Lösung unter einem Präparierfernrohr für Tierkadaver beobachten. Innerhalb von sechs bis acht Minuten werden die erwachsenen Tiere fragmentiert und die Embryonen sollten freigesetzt werden. Entfernen Sie die Embryonen aus der Bleichlösung, indem Sie sie pelletieren und so viel Überstand wie möglich entfernen, ohne das Pellet zu stören.

Anschließend wird das Pellet in einem Volumen von 10 Millilitern durch Zugabe von sterilem M nine und unter Rühren resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang mindestens noch einmal, bis der Geruch von Bleichmittel nicht mehr wahrnehmbar ist. Um die Stadien enger zu halten, verhaften die Tiere sie in ihrem L-1-Stadium, indem sie Embryonen in M neun Medium ohne Nahrung ausbrüten.

Dies geschieht durch den Transfer der Embryonen in M neun in einen kleinen Erlenmeyerkolben. Schütteln Sie den Kolben über Nacht bei der für den Stamm geeigneten Temperatur und experimentieren Sie. In dieser Zeit schlüpfen alle Tiere und verhaften in der L eine Diapause am nächsten Tag.

Nehmen Sie das Wachstum der Larven ab einem festgelegten Zeitpunkt wieder auf, indem Sie sie auf die vorbereiteten Bakterien übertragen, die doppelsträngiges RN exprimieren. Dies ist der gleiche Tag, an dem die 24-Well-Platten mit Bakterien befleckt wurden. Beginnen Sie damit, die L one Tiere in ein 15 Milliliter Röhrchen zu geben und sie zu schleudern. Dann konzentrieren Sie die Tiere auf einen halben bis einen Milliliter M neun und legen Sie fünf Mikroliter konzentrierte Nematoden auf einen Teller.

Zählen Sie die Anzahl der Tiere auf dem Teller und passen Sie die konzentrierte Nematodenlösung an. TE 30 Würmer pro drei bis 10 Mikroliter. Zum Schluss werden ca. 30 l einstufige Tiere auf die Bakterien in jeder Vertiefung der vorbereiteten Vertiefung verteilt.

24-Well-Platte mehr als 30 Tiere pro Mulde können zum Hungertod führen Nachdem die Flecken getrocknet sind, was einige Minuten dauern wird, den Deckel mit dem Gummiband sichern, inkubieren Sie die Tiere umgedreht bei der erforderlichen Temperatur und Dauer, um die Tiere im gewünschten Stadium zu ritzen. Sobald die Nematoden bereit für das Screening sind, bestätigen Sie, dass die Positiv- und Negativkontrollen die erwarteten Phänotypen erzeugen. Beobachten Sie dann die Versuchstiere auf Entwicklungsstörungen.

Als nächstes montieren Sie mit einem Präpariermikroskop acht bis 12 Tiere aus jeder Vertiefung auf 4%Agri PET-Objektträger mit einem Tropfen Anästhetikum von fünf Mikrolitern. Nach dem Auftragen des entsprechenden Deckglases sind mindestens fünf Tiere mit Hilfe des Verbindungsmikroskops zu beobachten. Führen Sie eine organisierte Datenbank mit dem Gen, der Anzahl der beobachteten Tiere und den phänotypischen Ergebnissen.

Überprüfen Sie für jedes RNAI-Experiment jeden R-RNAi-produzierten Phänotyp nach Möglichkeit durch einen anderen sekundären Phänotyp, und durch Wiederholen des Experiments können in wiederholten Experimenten Bakterien aus demselben Streifen verwendet werden. Ältere Streifen können zu einem schlechten Wachstum in flüssigen Übernachtkulturen führen und sollten zuerst erneut gestreift werden. Einige Bakterienkulturen wachsen aufgrund des Genprodukts, das in ihrem Plasmid exprimiert wird, nicht gut.

In diesem Fall konzentrieren Sie die Bakterien einfach vor dem Anrichten. Für ein laufendes Screening ist es wichtig, immer viele Embryonen für das Staging bereit zu halten. Der Screening-Stamm sollte immer gefüttert, nicht ausgehungert und frei von Verunreinigungen sein, die den interessierenden Phänotyp beeinflussen könnten.

Wir haben einen Wartungsplan für die Fütterung von Tieren erstellt. Gene, die die DBL-1-Lokalisation beeinflussen, wurden von RNAi unter Verwendung eines Stammdesigns für diesen Screen identifiziert. Die normale Expression des GFP-Tags dbl eins umfasst ventrale Nervenstrangzellkörper und eine Reihe von Puncti-Tieren, die mit Antisense RA an DBL gefüttert wurden.

Eine mRNA zeigte eine stark abgeschwächte Expression von DBL eins. Diese Tiere waren auch klein, wie z.B. Tiere, denen das funktionsfähige DBL L one fehlte. Das RNA-I-Screening identifizierte erfolgreich viele andere Gene, deren Produkte die DBL-1-Lokalisierung beeinflussen, und erweiterte so unser Verständnis darüber, wie TGF beta subzellulär transportiert wird, und bot einen Ausgangspunkt für viele weitere Untersuchungen.

Mit dieser Methode kann eine einzelne Person zwei bis vier Versuchsreihen pro Woche sinnvoll inszenieren und beobachten. So können z.B. Tiere, die am Montag und Dienstag gehalten werden, am Donnerstag bzw. Freitag beobachtet werden, und Tiere können wieder am Freitag und Samstag für Montag und Dienstag beobachtet werden. Beobachtung Während Sie dieses Verfahren auf dem gesamten Bildschirm befolgen.

Es ist wichtig, viele Embryonen für das Staging bereit zu halten, also halten Sie den Screening-Stamm regelmäßig aufrecht. Außerdem ist es wichtig, sich detaillierte Notizen zu allen Beobachtungen zu machen.