Name: 에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 C. elegans에서 RNAi 기반 유전체 스크리닝과 형광 표지 단백질을 활용한 배아 후 단백질 발현 및 국소화 조절자 식별 방법을. 이 기법은 신경과학 및 세포생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자 분사 마커에 대한 dbl-1 cDNA와 닥터 크리스토퍼 Rongo (Waksman 연구소, Rutgers 대학, 뉴저지)의 선물 박사 릭 Padgett (Waksman 연구소, Rutgers 대학, 뉴저지)에 감사드립니다. 닥터 바스 그랜트의 연구실에서 GFP-태그를 dbl-1 구조의 낮은 사본 번호 통합을위한 유전자 총기 포격을 수행. 르네 가르시아 연구실 texIs100의 창출 동안 기술 지원을 제공했습니다. 르네 가르시아, 로빈의 Lints 및 Hongmin 진 실험실 생산적인 조언을 제공했습니다. 이 작품은 분자 및 세포 의학 TAMHSC학과 시동 기금에 의해 자금 지원되었다. 화합물 범위와 회전 디스크 공촛점는 부서와 딘의 의학 사무소의 TAMHSC 대학에서 제공하는 자금으로 구입했습니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기서 제시 RNAi 심사 방법은 정상적인 (또는 형질) postembryonic 표현형에 필요한 유전자 제품의 민감하고 빠른 분석을 가능하게합니다. 표시 예제 fluorescently 태그가 단백질의 subcellular 지방화에 관련된 유전자에 대한 화면입니다. 그러나,이 프로토콜은 관심사의 다른 postembryonic phenotypes에 영향을 미치는 유전자를 식별하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 방법은 RNAi 라이브러리를 사용하여 후보 유전자 접근 방법을 이용합니다. 돌연변이 유발 기술을 사용하여 앞으로 유전 화면 무작위로 유도된 소설 대립 유전자를 식별하지만, 이러한 대립 유전자는 24을 식별하는 데 상당한 시간과 노력, 그리고 / 또는 자금을 필요로합니다. cDNA 라이브러리로, 반면에 관심이 RNAi의 표현형 빠르게 후보 유전자를 확인 의한 cDNA 삽입 순서. 또한 복제 가능한 cDNA 삽입이 확인된 후보자의 다운 스트림 분석을 용이하...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> NGM 한천 </td><td> 선충류 성장 매체 </td><td> IPM 과학, INC </td><td> NGM 한천 프로토콜 25 다음 준비할 수 </td></tr><tr><td> M9 중간 </td><td> 22mM KH 2 PO 4, 42mM 나 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1 ㎜ MgSO 4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> 한천 - 한천 </td><td> EMD 화학 주식 회사 </td><td> 1.01614.1000 </td><td> NGM 플레이트 물에 2 %. 현미경 슬라이드 패드를위한 물 4 % (초기 및 이후 녹기 전자 레인지 압력솥). </td></tr><tr><td> Bacto 펩톤 </td><td> Becton 디킨슨 - Difco CP </td><td> 211,677 </td><td> 0.25 % </TD&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> 연구 제품 국제 주식 회사 </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 ㎜ 최종 농도 </td></tr><tr><td> carbenicillin </td><td> 연구 제품 국제 주식 회사 </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 μg / ML 작업 희석 </td></tr><tr><td> LB 국물 레녹스 </td><td> Becton 디킨슨 - Difco CP </td><td> 240,230 </td><td> 20g / 리터 </td></tr><tr><td> 테트라 사이클린 </td><td> 시그마 </td><td> 268,054 </td><td> 12.5 μg / ML 작업 희석 </td></tr><tr><td> 나트륨 차아 염소 산염 </td><td> 모든 브랜드 </td><td> 5 % 가정용 표백제 </td><td> 신선한 표백제를 사용하십시오. </td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 모든 브랜드 </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N 주식 </td></tr><tr><td> M9 배지 </td><td> Wormlab 제조법 도서 </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td> 시그마 </td><td> 31,742 </td><td> 100 μm의 - 1 MM 근무 희석 </td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 피셔 과학 </td><td> S227 </td><td> M9 근무 희석 10 MM </td></tr><tr><td> 24 잘 플레이트 </td><td> Greiner 바이오 원 </td><td> 662,160 </td><td> VWR 분배기 </td></tr><tr><td> 현미경 슬라이드 </td><td> 모든 브랜드 </td><td> 75 X 25 X 1mm </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 커버 전표 </td><td> 모든 브랜드 </td><td> 22 X 22mm No.1.5 </td><td> 현미경 제조 업체에서 권장하는 두께를 사​​용하십시오. </td></tr><tr><td> 복합 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구 주식 회사 </td><td> A1m </td><td> 실험의 요구에 맞게 목표 및 필터를 사용하십시오. </td></tr><tr><td> 미디어 펌프</td><td> Manostat Varistaltic 펌프 </td><td> 케이트 모델 # 72-620-000 </td><td> 관 그리고 기계에 맞는 설정을 사용 </td></tr></tbody></table>

에 postembryonic phenotypes을 식별하기 위해 rnai 심사 c. elegans</em

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans는 많은 유전자와 유전자 경로 1의 발견과 기능적 특성에 대한 유용한 모델 시스템 것으로 입증되었습니다. 보다 정교한 도구와이 시스템의 연구를위한 자원이 더 미묘한 phenotypes이나 역할과 유전자의 지속적인 발견을 촉진하고 있습니다. 여기에서 우리는 C를 식별 맞게 일반화된 프로토콜을 제시 RNAi 2를 사용 흥미 postembryonic phenotypes와 elegans의 유전자. 이 절차는 쉽게 여부 해부 또는 복합 현미경의 빛 또는 형광 광학에 의해 검정 선택의 표현형으로 수정됩니다. 이 심사 프로토콜은 유기체의 물리적 자산 및 분자 도구 C.에 capitalizes elegans 연구 커뮤니티하였습니다. 예를 들어, 우리는 이것의 일반적인 로컬 라이제이션에 필요한 유전자를 식별하기 위해 RNAi 화면에 형광등 제품을 표현하는 통합 transgene의 사용을 보여줍니다늦은 무대 애벌레와 어른의 제품입니다. 첫째, 우리는 전체 길이 cDNA 삽입으로 상용 게놈 RNAi 라이브러리를 사용했습니다. 이 라이브러리는 후보 유전자 산물의 RNAi 감소하여 여러 후보자의 급속한 식별을 용이하게합니다. 둘째, 우리는 RNAi를 구분 배경에 관심이 우리의 fluorecently 태그가 단백질을 표현 통합 transgene을 올렸습니다. 셋째, RNAi에 부화 동물을 노출하여,이 화면은 특별히 관심 단백질을 규제에서 사후 배아 역할을 숨길 수있는 중요한 배아 역할을 유전자 제품의 식별을 허용합니다. 마지막으로,이 화면은 단세포 결의안에 대한 갖춘 복합 현미경을 사용합니다.

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을 설명<em&gt; C. elegans</em&gt; RNAi 기반 게놈 화면과 기능, fluorescently 태그가 단백질을 표현 통합 transgene을 사용합니다.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans는 많은 유전자와 유전자 경로의 발견 및 기능적 특성 규명을 위한 가치 있는 모델 시스템임이 입증되었습니다1. 더욱 정교한...

이 절차의 목적은 RNAi 기반의 게놈 스크리닝과 형광 표지 단백질을 이용하여 C. elegans의 단백질 발현 및 위치 결정에 관여하는 배아 이후 조절 인자를 식별하는 것입니다. 적절한 스크리닝 균주가 구축되면 RNAi 라이브러리를 선택합니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 라이브러리 클론을 박테리아에 패키징하는 것입니다.그 후 박테리아를 선택하여 배양한 다음, 단계별로 분절된 C. elegans 선충에게 먹이로 제공합니다. 선충을 72시간 동안 성장시킨 후, 관심 있는 표현형의 변화가 있는지 관찰합니다. 최종적으로, 표적 단백질의 발현 또는 세포 내 국소화의 변화를 형광 현미경으로 시각화합니다.이 방법은 형광 표지된 단백질의 적절한 세포 내 국소화를 위해 필요한 유전자를 식별할 수 있습니다. 하지만 이 프로토콜은 관심 있는 다른 포배기 이후의 표현형에 영향을 미치는 유전자를 식별하도록 수정될 수 있습니다. 기존에 발표된 프로토콜과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 배양 전 박테리아에서 이중 가닥 RNA의 생성을 유도함으로써 동물 내 RNAi 반응의 수준과 일관성을 최적화했다는 점입니다.본 절차의 시연은 저희 실험실의 연구원인 Kathy fuss가 진행하겠습니다. 실험 시작 후 2개월 이내에 클론 라이브러리를 준비하십시오. 먼저 선택된 피딩 라이브러리 클론과 양성 및 음성 대조군을 LB 카르보닉 테트라사이클린 플레이트에 스트리킹하십시오. 양성 대조군으로는 BLE four와 같이 용량 의존적 포배기 표현형을 생성하는 유전자를 포함하는 클론을 사용하십시오. 음성 대조군으로는 빈 벡터 또는 관찰된 표현형이 없는 예측 가유전자를 포함하는 클론을 사용하십시오.플레이트를 하룻밤 동안 배양한 후, 각 클론에 대해 스트리킹 플레이트의 단일 콜로니를 50 µg/mL의 카보닉산이 함유된 2 mL LB 배지에 접종합니다. 배양액을 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침 용액이 탁해지면, 배양액에 IPTG를 첨가하여 이중 가닥 RNA의 생산을 유도하고 동일한 조건에서 4~5시간 더 배양합니다.IPTG를 첨가하면 NGM 플레이트의 IPTG와 오거(auger)에만 의존하는 것보다 유전자 산물의 RNAi 유도 녹다운(knockdown)을 더 일관되고 강력하게 보장할 수 있습니다. IPTG 배양 후, 각 클론의 배양액 30 µL를 준비된 24웰 NGM RNAi 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 웰당 하나의 클론을 배정합니다. 각 플레

rnai-screening-to-identify-postembryonic-phenotypes-in-c-elegans

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Neurexins 및 neuroligins는 시냅스 차별화 및 전송에 필수적인 역할을 수행하는 막 - 신경 세포의 접착 단백질입니다. 의 Neuroligin 부족한...

의 삼투 회피 Caenorhabditis 엘레간스 : 두 유전자의 시냅틱 기능, 인간의 Orthologues NRXN1과 NLGN1</em자폐증을위한>로 후보

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

우리가 사용하는 프로토콜을...

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

우리는에서 대상 유전자와 점수 몸 크기 표현형을 노크 RNAi 먹이 기술을 사용하는 방법을...

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.

Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans의 배아 치명률을 정량화하는 간단하고 저비용의 절차를 제공합니다. 전문 장비나 벌레 제거 전문성 없이도 집단 전체에서 배아 이상을 쉽게 감지할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜은 유전적 돌연변이, RNA 간섭 매개 유전자 노크다운, 식이의 효과를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 치명률 정량화

학습하세요 C. elegans에서 RNAi 기반 유전체 스크리닝과 형광 표지 단백질을 활용한 배아 후 단백질 발현 및 국소화 조절자 식별 방법을. 이 기법은 신경과학 및 세포생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans

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