에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans

이 절차의 목표는 RNAi 기반 게놈 스크리닝과 형광 표지된 단백질을 사용하여 C elegance에서 단백질 발현 및 국소화의 배아 후 조절자를 식별하는 것입니다. 적절한 스크리닝 균주가 구성되면 RNAi 라이브러리가 선택됩니다. 절차의 첫 번째 단계는 라이브러리 클론을 박테리아로 패키징하는 것입니다.

그런 다음 박테리아를 선택하고 성장시켜 단계적 인 c elegance 선충에게 공급합니다. 선충이 72시간 동안 자라도록 한 후, 관심 표현형의 변화를 관찰합니다. 궁극적으로, 공격받은 단백질의 발현 또는 세포 내 국소화의 변화는 형광 현미경으로 시각화됩니다.

이 방법은 형광 표지된 단백질의 적절한 세포 내 국소화에 필요한 유전자를 식별할 수 있습니다. 그러나, 이 프로토콜은 관심있는 다른 배아 후 표현형에 영향을 미치는 유전자를 식별하기 위해 수정될 수 있습니다. 기존에 발표된 프로토콜에 비해 이 기술의 주요 장점은 도금하기 전에 박테리아에서 이중 가닥 RNA의 생산을 유도하여 동물에서 RNAi 반응의 일관성과 수준을 최적화했다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 제 연구실의 연구원인 Kathy fuss가 될 것입니다 실험을 시작한 지 2개월 이내에 선택된 영양 라이브러리 클론에서 클론 라이브러리 첫 번째 줄무늬 박테리아와 LB 탄산 테트라사이클린 플레이트에 대한 양성 및 음성 대조군을 준비합니다. 양성 대조군의 경우, BLE 4와 같은 용량 의존적 배아 후 표현형을 생성하는 유전자를 포함하는 클론을 사용합니다. negative control의 경우, 빈 벡터 또는 관찰된 표현형이 없는 예측된 pseudogene을 포함하는 클론을 사용합니다.

각 클론에 대해 플레이트를 밤새 배양하고 밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 LB 배지 2밀리리터를 접종합니다. 줄무늬 플레이트에서 단일 식민지를 가진 탄산은 다음날 아침 교반으로 밤새 배양물을 배양합니다. 용액은 배양액에 IPTG를 첨가하여 이중 가닥 RNA를 흐리게 유도하고 동일한 조건에서 추가로 4-5시간 동안 배양해야 합니다.

IPTG를 추가하면 IPTG와 NGM 플레이트의 오거에만 의존하는 것보다 더 일관되고 강력한 RNAI 유도 녹다운이 보장됩니다.IPTG 배양 후 각 클론에서 30마이크로리터의 배양물을 준비된 24웰 NGM RNAi 플레이트의 각 웰로 스폿합니다. 웰당 클론 1개. 각 플레이트에는 제어 전용 우물이 두 개 있어야 합니다.

각 라이브러리의 위치를 주의 깊게 파악하십시오. 24개의 웰 플레이트에 클론을 넣으면 이제 플레이트를 덮개가 없는 상태로 멸균 흐름 후드에 넣어 약 20분 동안 건조시킵니다. 한천의 가장자리가 플레이트에서 떨어지지 않도록 하십시오.

단계적 선충에서 플레이트로 건조되면 선충 준비에 대한 지침이 제공됩니다. 다음 섹션에서는 첫 번째 유충 단계 또는 L one 선충의 단계적 개체군으로 시작합니다. L로 시작하여 하나의 유충은 잠재적인 배아 치사 표현형을 우회합니다.

선별할 동물의 단계적 개체군을 갖는 것은 또한 보이는 모든 변이가 RNAi에 의한 것이며 단순히 다른 단계에서 발생하는 정상적인 변이가 아니라는 확신을 증가시킵니다. 그러나 RNAi가 발달 지연을 일으키는 경우 스크리너 Bleach에 의해 기록되어야 합니다. 스크리닝 균주의 혼합 단계 모집단.

달걀 껍질로 보호된 배아만이 이 단계에서 살아남을 수 있으며, 섭씨 20도에서 수행되면 12시간 이내, 18시간 이내에 동물을 단계화합니다. 박테리아 배양액이 접종된 날 섭씨 16도에서 실시하는 경우. 건강하고 중력, 성체 및 배아를 모두 포함하는 스크리닝 균주 동물 3 개의 100mm 플레이트를 선택하십시오.

모든 동물을 멸균 M nine 매체로 세척하고 세척액을 나사 캡이 있는 멸균 15mm 튜브로 옮깁니다. 세척량이 3.5ml보다 크면 동물을 회전시키고 3.5ml를 제외한 모든 액체를 제거합니다. 3.5 밀리리터 미만인 경우.

물을 넣으면 3.5 밀리리터로 부피를 늘리거나 M 9를 넣어 씻을 때마다 수산화 나트륨과 표백제의 혼합물을 1.5 밀리리터로 성인으로부터 배아를 풀어줍니다. 이 용액에서 동물이 10분 이상 부화하지 않도록 합니다. 타이머를 시작한 후 각 튜브를 10초 동안 소용돌이치고 2분마다 소용돌이를 반복합니다.

각 와류 후에는 동물 사체에 대한 해부 범위 아래에서 용액을 관찰합니다. 6분에서 8분 이내에 성체는 분열되고 배아는 방출되어야 합니다. 표백제 용액에서 배아를 펠릿화하여 제거하고 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 제거합니다.

그런 다음 멸균 M nine을 첨가하고 교반을 사용하여 펠릿을 10 밀리리터 부피로 재현탁시킵니다. 표백제 냄새가 완전히 감지되지 않을 때까지 이 세탁 과정을 한 번 이상 반복하십시오. 더 단단히 단계를 빚기 위해 동물들은 먹이 없이 M 9 배지에서 배아를 부화시켜 L 1 단계에서 그들을 붙잡습니다.

이것은 M nine의 배아를 작은 삼각 플라스크로 옮겨 수행한다. 스트레인에 적합한 온도에서 밤새 플라스크를 흔들어 실험합니다. 이 시간 동안 동물들은 모두 부화하고 다음날 L 1 휴지기에서 체포됩니다.

이중 가닥 RN을 발현하는 준비된 박테리아로 이동시켜 설정된 시점부터 유충 성장을 재개합니다. 이 날은 24개의 웰 플레이트에서 박테리아가 발견된 날과 같은 날입니다. L one 동물을 15mm 튜브에 옮기고 회전시키는 것으로 시작합니다. 그런 다음 동물을 M nine 1/2에서 1 밀리리터로 농축하고 농축 선충 5 마이크로 리터를 접시에 놓습니다.

접시에 있는 동물의 수를 세고 농축된 선충 용액을 조정하십시오. TE 30 3 마이크로 리터마다 10 웜. 마지막으로, 약 30 L 1 단계 동물을 준비된 각 우물에있는 박테리아에 발견하십시오.

24 우물 플레이트 우물 당 30 마리 이상의 동물은 굶어 죽을 수 있습니다 반점이 마르면 몇 분이 소요되며 고무 밴드로 뚜껑을 고정하고 필요한 온도와 지속 시간으로 거꾸로 동물을 배양하여 원하는 단계에서 동물의 점수를 매깁니다. 선충을 스크리닝할 준비가 되면 positive 및 negative control이 예상되는 표현형을 생성하는지 확인합니다. 그런 다음 실험 동물의 발달 이상을 관찰합니다.

다음으로, 해부 현미경을 사용하여 각 웰에서 8-12마리의 동물을 5마이크로리터의 마취제를 떨어뜨린 4% Agri PET 슬라이드에 장착합니다. 적절한 커버 슬립을 적용한 후 복합 현미경을 사용하여 최소 5마리의 동물을 관찰합니다. 유전자, 관찰된 동물의 수 및 표현형 결과에 대한 체계적인 데이터베이스를 유지하십시오.

각 RNAI 실험에 대해 가능한 경우 다른 2차 표현형에 의해 생성된 R RNAi 표현형을 확인하고, 실험을 반복하여 반복된 실험에서 동일한 줄무늬의 박테리아를 사용할 수 있습니다. 오래된 줄무늬는 액체 하룻밤 배양에서 성장이 저해할 수 있으므로 먼저 줄무늬를 다시 만들어야 합니다. 일부 박테리아 배양은 플라스미드에서 발현되는 유전자 산물 때문에 잘 자라지 않습니다.

이 경우 도금하기 전에 박테리아를 농축하기만 하면 됩니다. 지속적인 스크리닝을 위해서는 항상 병기를 결정할 수 있도록 충분한 배아를 준비하는 것이 중요합니다. 스크리닝 균주는 항상 먹이를 주어야 하고, 굶주리지 않아야 하며, 관심 표현형에 영향을 줄 수 있는 오염 물질이 없어야 합니다.

우리는 동물에게 먹이를 주기 위한 유지 관리 일정을 수립했습니다. DBL one 국소화에 영향을 미치는 유전자는 이 스크리닝을 위한 균주 설계를 사용하여 RNAi에 의해 확인되었습니다. GFP 태그 dbl one의 정상적인 발현에는 복부 신경삭 세포체가 포함되며, DBL에 안티센스 RA를 공급한 한 줄의 반점 동물이 포함됩니다.

하나의 mRNA는 DBL one의 심하게 약독화된 발현을 보였다. 이 동물들은 DBL L 1이 없는 동물처럼 작았다. RNA I 스크리닝은 DBL one 국소화에 영향을 미치는 다른 많은 유전자를 성공적으로 식별하여 TGF 베타가 세포 내 교통에 대한 이해를 넓히고 더 많은 연구를 위한 시작점을 제공했습니다.

이 방법을 사용하면 한 사람이 매주 2-4세트의 실험을 합리적으로 준비하고 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 월요일과 화요일에 상연된 동물은 각각 목요일과 금요일에 관찰될 수 있으며, 월요일과 화요일에는 금요일과 토요일에 다시 상연될 수 있습니다. 관찰 화면 전체에서 이 절차를 수행하는 동안.

병기 결정을 위해 충분한 배아를 준비하는 것이 중요하므로 정기적으로 선별 검사를 유지하십시오. 또한 모든 관찰 내용을 자세히 기록하는 것이 중요합니다.