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 JoVE Biology

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

1, 1, 1

1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

Article
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    Summary

    우리는 라이신 methylation의 변화를 계량하는 데 든 질량 분광법과 reductive methylation 화학을 사용하는 방법을 제시한다.

    Date Published: 3/11/2012, Issue 61; doi: 10.3791/3604

    Cite this Article

    Blair, L. P., Avaritt, N. L., Tackett, A. J. Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity. J. Vis. Exp. (61), e3604, doi:10.3791/3604 (2012).

    Abstract

    최근 epigenetic 규제는 1-3 여러 가지 질병의 주요 선수로 발견되었습니다. 결과적으로 이러한 효소는 작은 분자 연구 및 약물 개발 4 주요 목표입니다. 많은 epigenetic 규제는 최근에 발견하고 분류하는 과정이 아직 없습니다. 이들 효소 중 histones 및 다른 단백질에 lysines에서 메틸 그룹을 제거 라이신 demethylases 있습니다. 효소의이 클래스의 소설 특성으로 인해 몇 assays들은 활동을 공부하기 위해 개발되었습니다. 이 분류와 히스톤 demethylases의 높은 처리량 연구 양쪽에 도로를 차단했습니다. 현재 거의 demethylase의 assays가 존재합니다. 존재하지 그것들은 자연에서 질적 경향 동시에 다른 라이신 methylation 상태 사이에 분별없는 수 있습니다 (취소, 모노 -, 디 - 및 트라이 -). 질량 분석법은 일반적으로 demethylase 활동을 결정하는 데 사용하지만 현재 대량 spectrometric assays 할있다differentially methylated 펩티드 다르게 이온화 여부를 해결할 수 없습니다. methylated 펩티드의 차동 이온화는 methylation 상태가 어렵고 (그림 1A) 확실히 양적되지 비교 있습니다. 따라서 가능한 assays는 demethylase 활동의 포괄적인 분석을 위해 최적화되지 않습니다.

    여기 따라서 본질적으로 동일한 화학 종족들을 만들고, 모든 lysines는 디 - methylated로 강제로 진정제를 맞았을 포름 알데히드와 아민 그룹의 reductive methylation을 기반으로 MassSQUIRM라는 방법을 (isotopic reductive methylation을 사용하여 질량 spectrometric quantitation) 설명하고 있으므로이 이온화 동일한 (그림 1B). reductive methylation에 따라 유일한 화학 변화는 수소와 든 이온화 효율에 영향을주지 않습니다 중수소입니다. MassSQUIRM 분석이 해제, 모노 또는 디 - methylated lysines와 demethylase 반응 제품에 대한 구체적인 것입니다. 분석은 또한 SA주는 라이신 methyltransferases에 적용나에게 반응 제품보기. 여기서는 reductive methylation 화학 및 든 질량 분광법 LSD1의 활동을 측정, 합성 펩티드 기질 5, 디 - 및 모노 - 메틸 그룹을 제거하는 능력이 라이신 demethylase.의 조합을 사용 이 분석은 간단하고 실험실이나 proteomics 시설을 통해 든 질량 분석기에 대한 액세스 권한이있는 모든 실험실로 쉽게받을 수있는 것입니다. 검정은 ~ 8 배 다이나믹 레인지를 가지고 있으며, 플레이트 형식 5 ~ 쉽게 확장 가능합니다.

    Protocol

    이 프로토콜은 블레어 외에서 수정됩니다. 6.

    1. LSD1 Demethylation 분석

    1. 20 μL의 최종 볼륨에서 demethylase 버퍼에서 0.25 μg 디 - 메틸 히스톤 H3 펩타이드 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-비오틴) (50 MM 트리스-CL 산도 8.5, 50 MM KCl, 5 밀리미터 MgCl 2, 5 %의 125 NG 재조합 LSD1을 결합 글리세롤). 또한, 아니 효소와 펩티드 혼자 컨트롤을 수행합니다. 제어 섹션 3이며 reductive methylation이 필요하지 않습니다.
    2. 37에서 2 시간 동안 품어 ° C.
    3. 펩티드를 수집하려면 각 샘플 ~ 8 μL POROS의 R2 20 마이크론 구슬을 추가하고 실온에서 15 분 동안 선동. 메탄올 1 볼륨으로 구슬 1 볼륨을 정지하여 POROS 비즈를 준비하고 5퍼센트 개미의 산성 / 0.2 % TFA 10 볼륨을 추가합니다.
    4. 2 급 끝에 0.1 %의 TFA 20 μL를 aspirating하고 pipettor들과 다시 한번 밀어 C 18 ZipTips. 0.1 %의 T로 두번이 작업을 수행FA, 넷 70 % acetonitrile과 회 / 0.1 %의 TFA, 그리고 0.1 %의 TFA로 다시 네 번.
    5. ZipTips에서 C 18 수지 뒤에 비드 슬러리를 pipetting과 pipettor로를 통해 볼륨을 밀어 에어컨 C 18 ZipTips에 두 개의 샘플을 (제어 및 demethylase 반응)로드합니다.
    6. 0.1 %의 TFA 20 μL으로 두 번 ZipTips 씻으십시오.
    7. 70 % acetonitrile / 0.1 %의 TFA의 40 μL에 Elute.
    8. Speed​​Vac 농축기로 완전히 각 eluant을 Lyophilize.

    2. Reductive Methylation

    프로토콜의이 부분은 ​​블레어 외에서 수정됩니다. 및 Rayment 외. 6,7.

    1. 50 밀리미터 인산 버퍼, 산도 7.4의 100 μL의 demethylase 반응을 다시 일시 중지합니다.
    2. demethylase 반응으로, 15 밀리그램 / ML borane dimethylamine 8 μL를 추가합니다. Borane dimethylamine은 15 밀리그램 / ML 재고 솔루션을 제공하기 위해, 50 MM 인산 버퍼, 산도 7.4에 녹아있다.이것은 신선한하여야한다.
    3. demethylase 반응으로, 250 MM 진정제를 맞았을 포름 알데히드의 16 μL를 추가합니다. 250 MM 진정제를 맞았을 포름 알데히드는 H 2 0에서 주식을 diluting에 의해 준비가되어 있습니다. 이것은 신선한하여야한다.
    4. 12 시간 동안 4 ° C에서 품어.
    5. 단계 2.2, 2.3 및 2.4 반복합니다.
    6. 단계 2.2를 반복합니다.
    7. 4에서 품어 ° C ~ 15 시간.
    8. demethylase 샘플로 1M 트리스, reductive methylation 반응을 끄지하는 산도 7.4의 12.5 μL를 추가합니다.

    3. 든 질량 분광법

    1. demethylase 반응에 POROS R2 20 마이크론 구슬을 추가하고 단계 1.3-1.6에 설명된대로 ZipTips를 수집합니다.

    참고 : 50 MM 인산 버퍼, 산도 7.4의 100 μL에 컨트롤을 다시 중지되고 다른 샘플 단계 3.1으로 시작하는으로 취급합니다.

    1. 33%가 포화 2 μL를 사용 든 샘플 플레이트에 ZipTips에서 제어 및 demethylase 반응 샘플을 EluteD 2,5 - dihydroxybenzoic 산. 33%에게 2,5-dihydroxybenzoic 산성을 준비하려면 70 % acetonitrile / 0.1 % TFA에 포화 33%로 희석 후 70 % acetonitrile / 0.1 % TFA에 2,5-dihydroxybenzoic 산성의 포화 용액을 만들고. eluted 샘플 건조하고 구체화하도록 허용합니다.
    2. PerkinElmerSciex 든-prOTOF 질량 분석기 또는 가능한 고해상도 든 질량 분석계 8,9,10을 사용하여 질량 스펙트럼을 수집합니다.
    3. 스펙트럼보기 및 질량 분광계 제조 업체에서 제공 PerkinElmerSciex TOFworks 소프트웨어 또는 소프트웨어를 사용하여 피크 영역을 추출합니다.
    4. 탠덤 질량 spectrometric 기능을 제공하는 사용 가능한 대량 spectrometric 시스템과 석사 2로 반응 제품을 확인합니다.

    4. 데이터 분석

    1. 무거운 포름 알데히드 (그림 1B)를 사용하여 만든 isotopic 중복 보상하기 위해, 피크 면적 13 C 2와 13 C 4 동위 원소 relativ의 (A)의 비율을 결정reductive methylation (그림 2A)를 겪은하지 않은 컨트롤 샘플에 대한 monoisotopic 최대 5.
      EQ 1 : 13C2 / 12C = R 1
      EQ 2 : 13C4 / 12C = R 2
      이렇게하면 실험 및 질량 분석계에 특정한 이들 isotopic 상태에서 기존 펩타이드의 비율 (R 1 & R 2)를 제공할 것입니다.
    2. demethylase 반응 시료의 각 변형 상태 (그림 2B)에 기존 펩타이드의 상대적 양을 quantifying에 대해 다음 수식에서 R 1 & R이 값을 사용
      EQ 3 : H3K4me2 = 1
      EQ 4 : H3K4me = 2 - R 1 (1)
      EQ 5 : H3K4 = 3 - R 2 (1) - [R 1 (2 - R 1 (1))]

    5. 대표 결과

    LSD1를 사용하여, 우리는 quantifying 위해 MassSQUIRM의 효과를 보여라이신 demethylation. 와 같은 프로토콜 텍스트 섹션에서 설명한, 우리는 LSD1 125 NG와 0.25 μg 디 - 메틸 히스톤 H3 펩타이드 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-비오틴)와 demethylase 분석을 수행. 제어 및 demethylase 반응 표본 reductive methylation 및 든 질량 분광법를 받게되었다. reductive methylation을 받다 없었 제어 반응이 펩타이드에 대한 전형적인 isotopic 봉투를 보여주와 방정식 1과 2 (그림 2A)에 피크 영역을 제공했습니다. demethylase 반응에 대한 질량 스펙트럼은 방정식 3-5 (그림 2B)의 피크 영역을 제공했습니다. 제어 및 demethylase 반응의 피크 영역을 사용하여, 우리는 LSD1는 다음과 같은 반응 제품을주는 펩타이드를 demethylated 것을 결정 : 33.7 % 디 - 메틸 Lys4, 42.3 % 모노 메틸 Lys4 및 24% 해제 methylated LYS 4. 블레어 외 참조하십시오. 전체 LSD1 demethylase 활동의 분석뿐만 아니라 억제제 연구 6. 참고 이러한 반응 시간, 효소 등 변화하는 변수농도와 기판 농도는 활동에 대한 심층 분석에있게됩니다.

    그림 1
    그림 1. MassSQUIRM 개요. () 히스톤 H3의 N-터미널 펩타이드가되는대로 표시됩니다 취소 (녹색), 모노 (빨간색) 또는 디 - (파란색) 라이신 4에 methylated. 각 펩타이드의 화학적 구성의 변화는 부량 복합 만들기 차등 이온화로 안내합니다. (B) Reductive methylation은 모든 펩티드가 비슷하게 이온화로 인해 디 - 메틸 상태에 대한 모든 리진 잔류물을 변환합니다. reductive methylation 반응에 무거운 포름 알데히드의 사용은 원래 methylation의 정체성 유지 수 있습니다. 닫힌 서클이 심한 methylation을 나타내는 반면 오픈 서클 밝은 methylation을 나타냅니다. 블레어 외. 2,011 6에서 수정하였습니다.

    그림 2
    FigurE 2. MassSQUIRM는 differentially methylated 펩티드를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. () 디 - methylated 합성 히스톤 H3 펩타이드 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-비오틴)은 R 1 및 방정식 1과 2에서 R 2로 언급했다 질량 분광법과 monoisotopic에서 최대 상대적인 최대 비율을 사용하여 분석되었다. (B) 같은 합성 펩타이드는 37 ° C.에 두 시간 동안이나 demethylase 버퍼에 125 NG의 LSD1 함께 incubated되었다 샘플은 다음 분석을 MassSQUIRM를 받게되었다. 봉우리 중복의 혼합 인구는 그림 1B에서 본 세 가지 다른 methylation 상태를 나타냅니다. monoisotopic 봉우리 아래의 영역은 1, 23으로 언급되었다. 피크 영역은 방정식 3-5에 사용되었다. 닫힌 서클이 심한 methylation을 나타내는 반면 오픈 서클 밝은 methylation을 나타냅니다. 블레어 외에서 수정하였습니다. 2011 6.

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    Discussion

    MassSQUIRM은 모노와 DI-methylation에 관여 라이신 demethylases의 활동의 종합적인 분석을위한 저렴하고 양적 방법입니다. MassSQUIRM는 반응의 제품뿐만 아니라 중간체를위한뿐만 아니라 quantitation를 제공합니다. 이 분석은 LSD1 및 기타 히스톤 demethylases의 메커니즘을 연구의 강력한 도구로 사용될 수 있습니다. 그것은 또한 PHF8 많은 새로 발견된 라이신 demethylase 효소를 분류하고 특정 methyltransferase 효소에 사용될 수 유용할 것입니다.

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    Disclosures

    우리는 공개 할게 없다.

    Acknowledgements

    우리는 대량 spectrometric 지원 UAMS의 Proteomics 시설 감사드립니다. 이 프로젝트에 대한 자금 지원은 NIH 보조금 P20RR015569, P20RR016460 및 R01DA025755에 의해 제공되었다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    LSD1 BPS Biosciences 50100
    H3K4me2-biotin peptide Prepared in Lab none
    POROS R2 20 micron beads Applied Biosystems 1-1129-06
    C18 ZipTip EMD Millipore ZTC18M
    Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo Fisher Scientific, Inc. 28904
    acetonitrile Fisher Scientific A996
    2,5-dihydroxybenzoic acid Sigma-Aldrich 85707
    Borane dimethylamine Sigma-Aldrich 180238
    isotopically heavy d2-formaldehyde Cambridge Isotope Laboratories DLM-805-20
    Tris Fisher Scientific BP154
    KCl Fisher Scientific BP366
    MgCl2 Fisher Scientific BP214
    Glycerol Fisher Scientific G33
    Formic acid Fluka 06440
    Methanol Fisher Scientific A452
    Na-phosphate Fisher Scientific BP329
    SpeedVac Concentrator Savant DNA110
    MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software PerkinElmer, Inc. none

    References

    1. Goldberg, A.D., Allis, C.D., & Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-8 (2007).
    2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
    3. Blair, L.P., Cao, J., Zou, M.R., Sayegh, J., & Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
    4. Cole, P.A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-7 (2008).
    5. Shi, Y., et al. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-53 (2004).
    6. Blair, L.P., et al. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-9 (2011).
    7. Rayment, I., et al. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-8 (1993).
    8. Collom, S.L., Jamakhandi, A.P., Tackett, A.J., Radominska-Pandya, A., & Miller, G.P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
    9. Gradolatto, A., et al. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
    10. Taverna, S.D., et al. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).

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