JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Dutch was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

1, 1

1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Neuroscience. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 23.22.83.105, User IP: 23.22.83.105, User IP Hex: 387339113

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Een benadering voor het analyseren van migratie en de uiteindelijke lot van aviaire neurale lijst cellen in kwartel-chick chimere embryo's wordt beschreven. Deze methode is een eenvoudige en directe techniek voor het opsporen van neurale lijst cellen tijdens migratie en differentiatie die anders moeilijk te onderscheiden binnen een ongemanipuleerde kippenembryo.

    Date Published: 2/07/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3622

    Cite this Article

    Griswold, S. L., Lwigale, P. Y. Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation. J. Vis. Exp. (60), e3622, doi:10.3791/3622 (2012).

    Abstract

    Aviaire embryo's bieden een uniek platform voor het bestuderen van vele gewervelde ontwikkelingsprocessen, als gevolg van de gemakkelijke toegang van de embryo's in het ei. Chimère aviaire embryo's, waarbij kwartel donor weefsel wordt in een kippenembryo getransplanteerd in ovo, combineren de kracht van onuitwisbare genetische kenmerken van celpopulaties met het gemak van manipulatie door het aviaire embryo.

    Quail-chick hersenspinsels zijn een klassiek instrument voor het opsporen van trekkende neurale lijst cellen (NCC's) 1-3. NCC's zijn een tijdelijke trekkende populatie van cellen in het embryo, die van oorsprong in het dorsale gebied van de ontwikkeling van neurale buis 4. Ze ondergaan een epitheliale naar mesenchymale transitie en vervolgens migreren naar andere regio's van het embryo, waar ze differentiëren in verschillende soorten cellen, waaronder kraakbeen 5-13, melanocyten 11,14-20, neuronen en glia 21-32. NCC's zijn multipotente, en hun uiteindelijke lot is invloedbeïnvloed door 1) het gebied van de neurale buis waaruit zij van oorsprong langs de Rostro-caudale as van het embryo 11,33-37, 2) signalen van naburige cellen als ze 38-44 migreren, en 3) de micro-omgeving van hun uiteindelijke bestemming binnen het embryo 45,46. Tracing deze cellen vanuit hun oorsprong in de neurale buis, op hun definitieve standpunt en het lot in het embryo, levert belangrijke inzicht in de ontwikkelingsprocessen die patronen en organogenese te reguleren.

    Transplantatie van complementaire regio's van donor neurale buis (homotopic enten) of verschillende regio's van donor neurale buis (heterotope enten) kan onthullen verschillen in de pre-specificatie van NCC's langs de Rostro-caudale as 2,47. Deze techniek kan verder worden aangepast aan een eenzijdige compartiment van de neurale buis, zodat een zijde uit donorweefsel transplanteren en contralaterale zijde blijft onverstoord in de gastheer embryo, yielding een interne controle binnen hetzelfde monster 2,47. Het kan ook worden aangepast voor transplantatie van hersenen segmenten later embryo na HH10 wanneer de voorste neurale buis gesloten 47.

    Hier melden wij technieken voor het genereren van kwartel-chick hersenschimmen via neurale buis transplantatie, die het mogelijk maken voor het traceren van de trekkende NCC's afgeleid van een discrete segment van de neurale buis. Soortspecifieke kenmerken van de donor-afgeleide cellen met de kwartel-specifieke antilichaam QCPN 48-56 kan de onderzoeker om donor en gastheercellen te onderscheiden in een experimentele eindpunt. Deze techniek is eenvoudig, goedkoop, en heeft vele toepassingen, waaronder het lot-mapping, cellijn opsporen en identificeren van pre-patronen evenementen langs de Rostro-caudale as 45. Vanwege het gemak van toegang tot de aviaire embryo, kan de kwartel-chick graft techniek worden gecombineerd met andere bewerkingen, met inbegrip van maar niet beperkt tot lens ablatie 40, injectie van remmende moleculen 57,58, of genetische manipulatie via elektroporatie van meningsuiting plasmiden 59-61, om de reactie van bepaalde trekkende stromen van NCC's tot verstoringen in ontwikkeling van het embryo-programma te identificeren. Bovendien kan deze enten techniek ook gebruikt worden om andere interspecifieke chimere embryo's, zoals kwartel-eend hersenschimmen genereren NCC bijdrage aan craniofaciale morfogenese, of muis-chick hersenschimmen om de kracht van de muis genetica te combineren met het gemak van manipulatie van de aviaire embryo te bestuderen 62.

    Protocol

    1. Incubate kuiken en kwarteleitjes op de gewenste fase

    Voor HH9 embryo's, typische incubatietijd varieert 29 tot 33 uur bij 38 ° C 63

    1. Was de puin van de eieren met lauw water.
    2. Horizontaal Leg eieren op de tray. Markeer de zijde naar boven met potlood, dit komt overeen met de regio waar het embryo zal worden gelokaliseerd. Incubeer kwarteleitjes stomp eindigen.
    3. Plaats in 38 ° C bevochtigde incubator. Zet schommelen functie.

    2. Bereid eieren voor windowing en dissectie

    1. Verwijder eieren van incubator, en steriliseer de toppen met 70% ethanol. Het beste is om spuiten in de richting van de ethanol en veeg snel met een papieren handdoek of Kimwipe aan een opname van ethanol te vermijden door de eierschaal.
    2. Leg de kip ei op een individueel ei houder (wij gebruik van een petrischaal bekleed met gevouwen papieren handdoeken, bijv. "Kimwipes"). Met behulp van AA tang, tikt u op een klein hole in het bovenvlak van de eierschaal aan het puntige uiteinde van het ei.
    3. Verwijder de 1,5-3 ml van het licht albumine van de kip ei met een 18 ½ G injectienaald en 5 ml spuit. Het beste is om de naald verticaal in te voegen in het gat, met de schuine rand met uitzicht op de puntige kant van het ei (figuur 2A). Deze manier, als albumine wordt ingetrokken, is er weinig kans op per ongeluk beschadiging van de dooier via de afzuiging. Gooi de albumine. Deze stap zal verlagen de dooier en embryo in het ei, zodat een venster worden geopend in de eierschaal.
    4. Veeg het gat met 70% ethanol zoals hierboven beschreven en sluit deze af met Scotch tape. Het is belangrijk dat de eierschaal rondom het gat volledig vrij van albumine en droge of de lijm afdichting.
    5. Met de AA-tang, tikt u op een ander gat in de gemarkeerde bovenkant van de horizontale ei, niet helemaal aan de top. Zorg ervoor dat u laat de tang te ver gaan door de eierschaal heen om te voorkomen dat schade aan het eigeel of embryo.
    6. Induw een zijde van de gekromde iris pincet in het gat evenwijdig aan de eieren schaal. Knijpen naar beneden op de schelp, het werken in een draaiende beweging een ~ 2 cm in diameter venster in het kippenei schaal te breken. Gooi de verwijderde eierschaal. Als alternatief, bedek de bovenkant van het ei met verpakkingstape en gebruik een schaar te snijden uit het raam. Dit minimaliseert de kans op eierschaal puin vallen in het ei. De embryo moet verschijnen als een opaak schijf boven de dooier. Gooi onbevruchte eitjes (te herkennen aan kleine witte vlek op het oppervlak van de dooier, of afwezigheid van blastoderm).
    7. Spuit een kleine hoeveelheid van de Oost-Indische inkt (1:10 verdund in oplossing steriele Ringer's met "Pen / Strep" antibioticum: uiteindelijke concentratie 100 ug / ml penicilline en 100 pg / ml streptomycine) onder de blastoderm om te helpen met het organiseren van het embryo. Gebruik van 1 ml spuit en 26 ½ G injectienaald, gebogen in een hoek van 45 ° aan de basis van de naald met de schuine naar boven, als alternatief, een may gebruik maken van een getrokken glas Pasteur pipet en mond pipetteren apparaten (oogbescherming bij het buigen injectienaald of het breken van glas naald). Doorprik de dooiervlies buiten de omtrek van de blastoderm en de punt van de naald onder de embryo schuiven, dichtbij het oppervlak van de dooier maar niet in de embryonale lagen (Figuur 2B). Injecteer net genoeg inkt om het embryo te schetsen, dan voorzichtig de naald (figuur 2C). Het injecteren van te veel inkt kan leiden tot embryonale sterfte. Het is belangrijk om geen luchtbellen te injecteren onder het embryo, want dit kan een bron voor verontreiniging zijn. NB: Alle Ringer's oplossing in deze procedure wordt gesteriliseerd en bevat pen / strep zoals hierboven gedefinieerd. Steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) is ook een aanvaardbaar alternatief voor Ringer's in alle stappen van dit protocol.
    8. Fase het embryo volgens Hamburger en Hamilton 63 en noteer de etappe op de eierschaal in permanente inkt of potlood. Stages kunnen het best worden beoordeeld in het kader m³omicroscopy, met glasvezel "zwanenhals" lichtbronnen met een beperkte warmtelast hebben.
    9. Breng 2-3 druppels warm steriele Ringer's oplossing aan het oppervlak van de embryo uitdroging en te voorkomen. Tijdelijk afdichten het venster met parafilm gespannen over het oppervlak van het ei.
    10. Herhaal de stappen 2.2-2.9 met alle chick eieren voor het begin van de transplantatie-experimenten.
    11. Aangezien kwartel embryo's alleen gebruikt voor donor weefsels, in ovo stappen 2.2-2.9 worden weggelaten. Voor ex ovo voorbereiding van de donor embryo's, zijn kwarteleitjes geïncubeerd botte kant op en deed in deze regio met gebogen tang om het embryo te onthullen. Met behulp van het ontleden van een schaar, maken vier sneden in de vorm van een vierkant door het vitelline membraan en blastoderm buiten het embryo (zorg ervoor dat alle zaagsneden elkaar ontmoeten). Met behulp van een gebogen iris pincet voorzichtig Pak een snijrand en til het embryo uit het ei en overbrengen naar Ringers oplossing in een petrischaal. Alternatief kan men de curved iris tang het uitgesneden embryo optillen onder of een embryo lepel of plastic transferpipet doorgesneden het brede deel van de cilinder kan worden gebruikt om de embryo-transfer van het ei. Verwijder voorzichtig de vitelline membraan met # 5 tang. Verzamel de overgebleven embryo's kwartel als hierboven, en ensceneren ze onder een stereomicroscoop.

    3. Bereid de gastheer embryo aan het transplantaat te ontvangen

    1. Verwijder Parafilm van de host (kuiken) embryo's en het gebruik van een geslepen wolfraam naald of pincet # 5, scheur een klein gaatje in de vitelline membraan op de gewenste regio van de neurale buis (figuur 3A).
    2. Voeg een druppel Ringer het embryo. Zorg ervoor dat het embryo volledig ondergedompeld in Ringer's tijdens de gehele procedure om uitdroging van het weefsel te voorkomen houden. Blijven toevoegen druppels Ringer aan het oppervlak van de embryo via transferpipet indien nodig.
    3. Met behulp van een getrokken glazen naald, met zorg te maken rostrale en caUdal dwarse incisies overeenkomt met de lengte en de regio van belang in de dorsale neurale buis. (Getrokken glas naalden worden gegenereerd silicium capillaire glazen buisjes die zijn onder hitte getrokken met een naald trekken inrichting.) Voor eenzijdige enten de insnijdingen alleen uit tot de lumen van de dorsale neurale buis, en bilaterale transplantaten, de insnijdingen te maken tussen de gehele dorsale neurale buis. Dan bilateraal knip tussen de dorsale neurale buis en de paraxiale mesoderm
    4. Voorzichtig de weggesneden explant te scheiden van de neurale buis en verwijder het uit het embryo door opzuigen in een glas micropipet (Figuur 3B).

    4. Bereid de donor weefsel

    1. Kies een podium voor elkaar onderdoen kwartel embryo. Houd het embryo naar beneden met AA tang, verwijder de vitelline membraan, en accijnzen een vergelijkbare grootte gebied van de neurale buis zoals hierboven beschreven (+3,3 tot 3,4) (figuur 3A'-B '). Afhankelijk van de behoeften van uw experiment, kan dit gebied eencomplementaire regio van de host (kuiken) neurale buis of uit een andere regio langs de Rostro-caudale as. (NB: voor grotere regionale enten, met inbegrip van volledige neurale buis enten, kunnen onderzoekers willen een protease spijsvertering toe te voegen aan deze stap om alle aanhangend mesenchymale weefsel van de donor weefsel voor transplantatie te verwijderen Echter, voor kleine dorsale neurale buis enten in een vroeg stadium. , zoals hier beschreven, protease spijsvertering is niet nodig omdat de neurale buis is gemakkelijk gescheiden van aangrenzende mesenchym door een strikte chirurgische technieken.)

    5. Graft het weefsel

    1. Zuig de donor in een glazen explantaat micropipet met Ringer's oplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen te introduceren in de pipet.
    2. Breng het explantaat naast het uitgesneden deel van het kuiken gastheer. Met behulp van getrokken glas naald, de explant oosten en voorzichtig de weg wijzen naar het te verdampen regio (Figuur 3C).
    3. Voeg voorzichtig een paar druppels van de oplossing Ringer'sde embryo uitdroging. Zorg ervoor dat het niet laat vallen vloeistof rechtstreeks op het transplantaat site als dit kan de graft te verwijderen.
    4. Sluit het venster met verpakkingstape. Zorg ervoor dat de band sluit de hele regio van de windowed ei. Dit voorkomt uitdroging en contaminatie van het embryo tijdens verdere incubatie.
    5. Breng het ei naar de couveuse tot het gewenste podium. Zorg ervoor dat de "rockende"-functie wordt uitgeschakeld terwijl het incuberen van de hersenschimmen. Eieren kan ze voorzichtig met de hand gedraaid twee keer per dag, dit kan de houdbaarheid ervan toenemen als de latere stadia van ontwikkeling zijn gericht.

    6. Bereid chimere embryo's voor het snijden

    1. Bij de experimentele eindpunt, snijdt u het tape op het raam met behulp van fijne schaar.
    2. Pak de rand van de blastoderm met gebogen iris pincet (makkelijkst te maken met gekartelde tips), dan weggesneden het embryo uit de dooier met 4 grote stukken buiten de grenzen van de blastoderm. Breng het embryo een Petri schaal die Ringer's oplossing. Zorg ervoor dat blootstelling van het embryo naar de lucht te minimaliseren, om uitdroging van het weefsel te voorkomen.
    3. Onder stereomicroscopie voorzichtig scheiden de vitelline membraan van de blastoderm met behulp van # 5 tang.
    4. Voorzichtig te regelen het embryo in de schaal, zodat het embryo zich in dezelfde richting als het was in het ei, met omliggende membranen aangelegd vlak.
    5. Gebruik ontleden naalden uit wolfraam draad 64 van de omgeving blastoderm zuiver uit het embryo aanbrengen van de naald op de grens van het embryo en extra-embryonale weefsels met de lengte van de wolfraamdraad evenwijdig aan de bodem van de schaal. Gebruik een zachte zagende beweging om door de weefsels.
    6. Verwijder voorzichtig het amnion met # 5 tang. Op dit punt kan, wil of verder te ontleden de regio van uw interesse, of laat de embryo geheel.
    7. Breng de embryo tot ijskoude 4% paraformaldehyde en rock overnacht bij 4 ° C.
    8. Bereid monsters en insluiten voor cryo-of paraffine snijden.

    Trace de geënte weefsel in de gastheer embryo. Er zijn verschillende technieken voor het identificeren van kwartel weefsel in een kuiken embryo, met inbegrip van detectiemethoden van kwartels nucleoli door hematoxyline kleuring (kwartel kernen hebben een zeer grote, donkere vlekken insluitsels dan chick kernen), de Feulgen-Rossenbeck reactie, acridine-oranje of biz-benzamide vlek in combinatie met elektronenmicroscopie, of immunokleuring voor kwartels-specifieke antigenen 3,47,65,66. Hier gebruiken we QCPN antigeen en standaard hele-mount of sectie immunofluorescentie technieken om kwartel neurale lijst cellen te identificeren in de kwartel-chick hersenschimmen (figuur 4). Deze techniek biedt de flexibiliteit experimentele ontwerp als QCPN immunofluorescentie kan ook worden gecombineerd met andere antilichamen gedifferentieerde cellen van de donor (kwartel) weefsel vast. Gebruik Standard hele-mount of sectie immunofluorescentie technieken om kwartel-afgeleide cellen te labelen in hersenschimmen.

    7. Representatieve resultaten

    Een representatief beeld van de geënte gebied van neurale buis na 6 uur incubatie van re-(tot HH11) toont verwacht opnemen van de geënte donor (kwartel) weefsel in de gastheer (kuiken) neurale buis (Figuur 4A). Embryo's met onvolledige integratie van het transplantaat, of asymmetrische ontwikkeling van de schedel of somieten na reincubation moet worden weggegooid.

    Doorsnede de geënte regio in HH11 tonen NCC voorzien HNK-1 migreren zijdelings van de neurale buis. Quail cellen die bijdragen aan de NCC migratiestroom en de neurale buis, duidelijk voorzien QCPN (Figuur 4B).

    In een later stadium kan kwartel NCC-afgeleide cellen worden herleid tot hun uiteindelijke doel weefsel. QCPN gelabelde cellen worden afgewisseld binnen het kippenembryo mesenchymvan de bovenkaak proces E5 (Figuur 4C).

    De QCPN antilichaam kan eenvoudig worden gecombineerd met andere antilichamen tegen de differentiatie van de kwartel-afgeleide NCC's in de ontvangende omgeving te onderzoeken. Quail NCC-afgeleide trigeminus sensorische neuronen worden gelabeld door QCPN en Tuj1 antilichamen (Figuur 4D).

    Figuur 1
    Figuur 1. Overzicht van de experimentele procedure en de nodige instrumenten. A) Host (kuiken) en donor (kwartel)'s moeten het podium op elkaar afgestemd. Om het etiket van de NCC stroom die bijdraagt ​​aan de trigeminus ganglion en maxillo-mandibulaire regio, HH9 is ideaal. Op HH9, is de neurale buis begint te sluiten in de rostrale regio, maar is nog niet volledig afgesloten. De grijze lijn in het schema staat voor de middellijn van het sluiten neurale buis. De gestippelde witte lijnen geven de cut lijnen voor uitsnijden van een middenhersenen gebied van de rechterkant van de neurale buis van de gastheer en donor embryos. Het gezuiverde gebied van de gastheer embryo wordt verwijderd en het donorweefsel getransplanteerd in de chimeer embryo te genereren. B) Noodzakelijke instrumenten zijn onder meer: ​​a) 5 ml spuit met 18 ½ G injectienaald, b) 1 ml spuit met 26 ½ G injectienaald gebogen op 45 °, c) Oost-Indische inkt, d) duidelijke verpakkingstape, e) glazen pipet met de mond pipetteren apparatuur, f) 60 mm-petrischaal, g) AA-tang, h) gebogen iris pincet met gekartelde tips, i) # 5 tang, j) fijne schaar, k) verscherpt wolfraam draad, l) getrokken glazen naald, m) parafilm pleinen.

    Figuur 2
    Figuur 2. Voorbereiding van de eieren en embryo's. A) Cross-doorsnede van het ei, ook ideaal invoegpunt van 18 ½ G injectienaald voor de intrekking van het licht albumine. B) Na het intrekken van ~ 3 ml van het licht albumine, de dooier en embryo verlaagt in het ei, waardoor de onderzoekers om een ​​"venster" (pijlen) snijden in thij eierschaal om het embryo te openen. India inkt 1:10 verdund in oplossing steriele Ringer's kan vervolgens geïnjecteerd worden onder de blastoderm om contrast gemakkelijk opvoeren van de embryo's. C) Chick embryo na inkten.

    Figuur 3
    Figuur 3. Schematische en voorbeelden van HH stadium 9 donor-en gastheer embryo's bij elke stap van het enten procedure. A) Chick gastheer embryo. Onderbroken lijnen in het diagram geeft aan waar de vitelline membraan moet worden verscheurd tot de schedel voor het enten te openen. Zodra gescheurd de driehoekige flap van vitelline membraan moet caudaal worden geschild. Box in beeld geeft aan inzet in (BC). A ') Kwartel donor embryo. Afbeelding is van donor embryo uitgesneden uit ei en geplaatst in Petri-schaal voor dissectie van het transplantaat weefsel. Box in beeld geeft aan inzet in (B '). Stippellijnen in schema (A ') geven aan waar de vitelline en de dooier membranen moeten worden gesneden om t te verwijderenhij embryo uit het ei. B) Host embryo met een unilaterale middenhersenen regio weggesneden neurale buis (witte pijlen) in afwachting van graft. Stippellijn in schema geeft aan waar sneden moeten worden aangebracht accijnzen de neurale buis in de middenhersenen regio. B ') Donor embryo met dorsale neurale buis graft weefsel weggesneden (graft weefsel aangegeven met zwarte pijlen). Gestippelde lijn in de grafiek geeft aan waar sneden dient te geschieden in de kwartel embryo aan accijns de donor weefsel voor eenzijdige enten van de middenhersenen gebied van de neurale buis. C) chimeer embryo na de transplantatie van kwartels dorsale neurale buis explant in het kuiken middenhersenen regio.

    Figuur 4
    Figuur 4. Immunofluorescentie het detecteren van kwartel-specifieke nucleaire antigeen QCPN in donor-afgeleide cellen in de chimeer embryo. A) Hele-mount beeld van HH11 Chimera (geënt op HH9), waaruit blijkt QCPN kleuring in rood, en HNK-1 kleuring (een marker van migrerende NCC's) ingroen. 10X-, rug-uitzicht. B) Dwarsdoorsnede door middel van embryo's in (A), waaruit blijkt QCPN-positieve kwartel afgeleide cellen in de neurale buis en trekkende NCC co-gekleurd met HNK-1 (groen). 40X vergroting. C) Dwarsdoorsnede door maxillaire proces van E5 Chimera (gedurende 3 dagen na de graft), waaruit blijkt QCPN-positieve NCC-afgeleide cellen (rood) die zijn gemigreerd van de geënte gebied van de neurale buis op hun definitieve plaats in het embryo. 10X vergroting. D) punt door middel van E5 hersenschim met bijdrage van kwartel afgeleid NCC aan de trigeminus ganglion (rood) en differentiatie in TuJ1-positieve neuronen (groen). 40X vergroting. *, NCC's, MP, maxillaire proces; NT, neurale buis, TG, trigeminus ganglion.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Het enten van kwartel neurale buis in gastheercellen kippenembryo's die hier beschreven is een eenvoudige en goedkope techniek voor het opsporen van specifieke subpopulaties van het migreren van NCC's afkomstig uit verschillende regio's langs de Rostro-caudale as 21,67-69. Deze techniek maakt gebruik van de bereikbaarheid van aviaire embryo's (ten opzichte van zoogdieren embryo) en kan worden gecombineerd met andere technieken, zoals weefsel ablatie injectie remmende moleculen of genetische manipulatie via elektroporatie van expressie-plasmiden, experimenteel onderzoeken reactie van specifieke trekkende NCC populaties van verschillende ontwikkelings-signalen in de embryo's 47,69.

    Quail-chick hersenspinsels zijn een krachtig hulpmiddel voor de behandeling van NCC migratie en differentiatie, en deze techniek kan worden aangepast aan transplantatie van andere weefsels naast de neurale buis op te nemen. Enten van kwartels weefsel in het kippenembryo is een gevestigde technique 13,21,70-76, maar wordt het best geleerd door visuele demonstratie, als de microdissectie van kleine regio's van de neurale buis vereisen zeer fijne motoriek.

    Omdat de kwartel-afgeleide cellen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van gastheer chick cellen via immunokleuring met de kwartel-specifiek antilichaam QCPN, kunnen de ontwikkelingsmogelijkheden van NCC's die voortvloeien uit specifieke regio's van de neurale buis worden afgeleid uit differentiatie van de donor (kwartel) cellen in de experimentele eindpunt, bijvoorbeeld de aanwezigheid van QCPN positieve cellen in de peri-oculaire regio hoornvlies na transplantatie kwartel neurale buis in de middenhersenen regio kippenembryo's op HH9 aangeeft dat trekkende neurale uit deze regio leiden tot corneale endothelium en stroma 77. Neurale buis enten op HH9-10 laten zien NCC bijdrage aan de trigeminus ganglion en de kieuwbogen. Ook kan kwartel-afgeleide sensorische neuronen worden gevolgd met behulp van een andere kwartel-neuron specifieke (QN) antilichaam 78,79.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Acknowledgements

    De auteurs danken de leden van de Lwigale laboratorium voor kritiek op het manuscript. SLG wordt ondersteund door een Ruth L. Kirschstein NRSA Fellowship van de National Eye Institute (F32 EY02167301). Pyl wordt ondersteund door de National Eye Institute (EY018050).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chick eggs Various
    Quail eggs Various
    Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) Poultry Supply 1502
    Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated Fine Science Tools 11210-10
    Scotch tape Any Supplier
    Curved Iris forceps Fine Science Tools 11065-07
    India ink Any Supplier
    Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR international 101447-068
    Clear Packing tape Any Supplier
    Needle pulling apparatus Narishige International PE-21
    Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube Kimble Chase 34500 99
    Pulled glass pipette, made from 5¾" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A
    Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) Sigma-Aldrich A5177-52A
    Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30
    Tungsten wire, 0.1mm diameter VWR international AA10404-H2
    Needle holders (Nickel-plated pin holder) Fine Science Tools 26018-17
    QCPN antiserum Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
    Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) Invitrogen A21125
    Ringer’s Solution (2L):
    • 14.4g NaCl
    • 0.34g CaCl2
    • 0.74g KCl
    • 0.230g Na2HPO4
    • 0.04g KH2PO4
    • ddH2O to 2L
    • Filter and autoclave
    Fisher Scientific
    • 7647-14-5
    • 10043-52-4
    • 7447-40-7
    • 7558-79-4
    • 7778-77-0

    References

    1. Le Douarin, G. & Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
    2. Teillet, M.A., Ziller, C., & Le Douarin, N.M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol. 461, 337-350 (2008).
    3. Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Dev. Biol. 30 (1), 217-222 (1973).
    4. Noden, D.M. An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev. Biol. 42 (1), 106-130 (1975).
    5. Johnston, M.C. A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo. Anat. Rec. 156 (2), 143-155 (1966).
    6. Noden, D.M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev. Biol. 67 (2), 296-312 (1978).
    7. Oka, K., et al. The role of TGF-beta signaling in regulating chondrogenesis and osteogenesis during mandibular development. Dev. Biol. 303 (1), 391-404 (2007).
    8. Chai, Y., et al. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development. 127 (8), 1671-1679 (2000).
    9. Lengele, B., Schowing, J., & Dhem, A. Embryonic origin and fate of chondroid tissue and secondary cartilages in the avian skull. Anat. Rec. 246 (3), 377-393 (1996).
    10. Le Douarin, N.M., Ziller, C., & Couly, G.F. Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo: in vivo and in vitro studies. Dev. Biol. 159 (1), 24-49 (1993).
    11. Lallier, T.E. Cell lineage and cell migration in the neural crest. Ann. N.Y. Acad. Sci. 615, 158-171 (1991).
    12. Nakamura, H. Mesenchymal derivatives from the neural crest. Arch. Histol. Jpn. 45 (2), 127-138 (1982).
    13. Le Lievre, C.S. & Le Douarin, N.M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 34 (1), 125-154 (1975).
    14. Rawles, M.E. The Development of Melanophores from Embryonic Mouse Tissues Grown in the Coelom of Chick Embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (12), 673-680 (1940).
    15. Rawles, M.E. The Pigment-Forming Potency of Early Chick Blastoderms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (1), 86-94 (1940).
    16. Mosher, J.T., et al. Intrinsic differences among spatially distinct neural crest stem cells in terms of migratory properties, fate determination, and ability to colonize the enteric nervous system. Dev. Biol. 303 (1), 1-15 (2007).
    17. Dupin, E. & Le Douarin, N.M. Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene. 22 (20), 3016-3023 (2003).
    18. Faraco, C.D., Vaz, S.A., Pastor, M.V., & Erickson, C.A. Hyperpigmentation in the Silkie fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and loss of environmental barrier molecules. Dev. Dyn. 220 (3), 212-225 (2001).
    19. Selleck, M.A. & Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell fate decisions: a diffusible signal mediates induction of neural crest by the ectoderm. Int. J. Dev. Neurosci. 18 (7), 621-627 (2000).
    20. Stocker, K.M., Sherman, L., Rees, S., & Ciment, G. Basic FGF and TGF-beta 1 influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development. 111 (2), 635-645 (1991).
    21. Le Douarin, N.M. & Teillet, M.A. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique. Dev. Biol. 41 (1), 162-184 (1974).
    22. Noden, D.M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. II. Neural tissues. Dev. Biol. 67 (2), 313-329 (1978).
    23. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (49), 21040-21045 (2010).
    24. Li, H.Y., Say, E.H., & Zhou, X.F. Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia. Stem Cells. 25 (8), 2053-2065 (2007).
    25. Carney, T.J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
    26. Maro, G.S., et al. Neural crest boundary cap cells constitute a source of neuronal and glial cells of the PNS. Nat. Neurosci. 7 (9), 930-938 (2004).
    27. Bronner-Fraser, M. Molecular analysis of neural crest formation. J. Physiol. Paris. 96 (1-2), 3-8 (2002).
    28. Paratore, C., Goerich, D.E., Suter, U., Wegner, M., & Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Development. 128 (20), 3949-3961 (2001).
    29. Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
    30. Bronner-Fraser, M. Origin of the avian neural crest. Stem Cells. 13 (6), 640-646 (1995).
    31. Jessen, K.R. & Mirsky, R. Neural development. Fate diverted. Curr. Biol. 4 (9), 824-827 (1994).
    32. Le Douarin, N., Dulac, C., Dupin, E., & Cameron-Curry, P. Glial cell lineages in the neural crest. Glia. 4 (2), 175-184 (1991).
    33. Chan, W.Y., Cheung, C.S., Yung, K.M., & Copp, A.J. Cardiac neural crest of the mouse embryo: axial level of origin, migratory pathway and cell autonomy of the splotch (Sp2H) mutant effect. Development. 131 (14), 3367-3379 (2004).
    34. Bronner-Fraser, M. Segregation of cell lineage in the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (4), 641-647 (1993).
    35. Peters-van der Sanden, M.J., Luider, T.M., van der Kamp, A.W., Tibboel, D., & Meijers, C. Regional differences between various axial segments of the avian neural crest regarding the formation of enteric ganglia. Differentiation. 53 (1), 17-24 (1993).
    36. Kuratani, S. & Bockman, D.E. Capacity of neural crest cells from various axial levels to participate in thymic development. Cell Tissue Res. 263 (1), 99-105 (1991).
    37. Leblanc, G.G., Epstein, M.L., & Bronner-Fraser, M.E. Differential development of cholinergic neurons from cranial and trunk neural crest cells in vitro. Dev. Biol. 137 (2), 318-330 (1990).
    38. Golding, J.P., Trainor, P., Krumlauf, R., & Gassmann, M. Defects in pathfinding by cranial neural crest cells in mice lacking the neuregulin receptor ErbB4. Nat. Cell. Biol. 2 (2), 103-109 (2000).
    39. Kulesa, P.M., Bailey, C.M., Kasemeier-Kulesa, J.C., & McLennan, R. Cranial neural crest migration: new rules for an old road. Dev. Biol. 344 (2), 543-554.
    40. Lwigale, P.Y. & Bronner-Fraser, M. Semaphorin3A/neuropilin-1 signaling acts as a molecular switch regulating neural crest migration during cornea development. Dev. Biol. 336 (2), 257-265 (2009).
    41. Olesnicky Killian, E.C., Birkholz, D.A., & Artinger, K.B. A role for chemokine signaling in neural crest cell migration and craniofacial development. Dev. Biol. 333 (1), 161-172 (2009).
    42. Gammill, L.S., Gonzalez, C., & Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67 (1), 47-56 (2007).
    43. Osborne, N.J., Begbie, J., Chilton, J.K., Schmidt, H., & Eickholt, B.J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232 (4), 939-949 (2005).
    44. Kanzler, B., Foreman, R.K., Labosky, P.A., & Mallo, M. BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest. Development. 127 (5), 1095-1104 (2000).
    45. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., & Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
    46. Goldstein, A.M. & Nagy, N. A bird's eye view of enteric nervous system development: lessons from the avian embryo. Pediatr. Res. 64 (4), 326-333 (2008).
    47. Le Douarin, N., Dieterlen-Lievre, F., Creuzet, S., & Teillet, M.A. Quail-chick transplantations. Methods Cell. Biol. 87, 19-58 (2008).
    48. Wingate, R.J. & Lumsden, A. Persistence of rhombomeric organisation in the postsegmental hindbrain. Development. 122 (7), 2143-2152 (1996).
    49. Karagenc, L. & Sandikci, M. Tissue distribution of cells derived from the area opaca in heterospecific quail-chick blastodermal chimeras. J. Anat. 216 (1), 16-22 (2010).
    50. Teague, W.J., Jayanthi, N.V., Lear, P.V., & Johnson, P.R. Foregut mesenchyme contributes cells to pancreatic acini during embryonic development in a chick-quail chimera model. Pediatr. Surg. Int. 21 (3), 138-142 (2005).
    51. Borue, X. & Noden, D.M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
    52. He, L., et al. Three different fates of cells migrating from somites into the limb bud. Anat. Embryol. (Berl). 207 (1), 29-34 (2003).
    53. Huang, R., Zhi, Q., & Christ, B. The relationship between limb muscle and endothelial cells migrating from single somite. Anat. Embryol. (Berl). 206 (4), 283-289 (2003).
    54. Hidalgo-Sanchez, M., Simeone, A., & Alvarado-Mallart, R.M. Fgf8 and Gbx2 induction concomitant with Otx2 repression is correlated with midbrain-hindbrain fate of caudal prosencephalon. Development. 126 (14), 3191-3203 (1999).
    55. Verberne, M.E., Gittenberger-de Groot, A.C., & Poelmann, R.E. Lineage and development of the parasympathetic nervous system of the embryonic chick heart. Anat. Embryol. (Berl). 198 (3), 171-184 (1998).
    56. Burns, A.J. & Douarin, N.M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125 (21), 4335-4347 (1998).
    57. Debby-Brafman, A., Burstyn-Cohen, T., Klar, A., & Kalcheim, C. F-Spondin, expressed in somite regions avoided by neural crest cells, mediates inhibition of distinct somite domains to neural crest migration. Neuron. 22 (3), 475-488 (1999).
    58. Lwigale, P.Y. & Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Dev. Biol. 306 (2), 750-759 (2007).
    59. Nakamura, H. & Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24 (1), 43-48 (2001).
    60. Chen, Y.X., Krull, C.E., & Reneker, L.W. Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation. Mol. Vis. 10, 874-883 (2004).
    61. Sato, F., Nakagawa, T., Ito, M., Kitagawa, Y., & Hattori, M.A. Application of RNA interference to chicken embryos using small interfering RNA. J. Exp. Zool. A. Comp. Exp. Biol. 301 (10), 820-827 (2004).
    62. Lwigale, P.Y. & Schneider, R.A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell. Biol. 87, 59-74 (2008).
    63. Hamburger, V. & Hamilton, H.L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
    64. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
    65. Le Douarin, N.M. A Feulgen-positive nucleolus. Exp. Cell. Res. 77 (1), 459-468 (1973).
    66. Feulgen, R. & Rossenbeck, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsaure vom typus der Thymonucleinsiiure und die darauf beruhende elektive Faibung von Zellkemen in mikroskopischen Praparaten. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 135, 203-252 (1924).
    67. Lwigale, P.Y., Conrad, G.W., & Bronner-Fraser, M. Graded potential of neural crest to form cornea, sensory neurons and cartilage along the rostrocaudal axis. Development. 131 (9), 1979-1991 (2004).
    68. Weston, J.A. A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick. Dev. Biol. 6, 279-310 (1963).
    69. Le Douarin, N.M. & Kalcheim, C. The Neural Crest, 2nd ed., Cambridge University Press, (2009).
    70. Le Douarin, N.M. & Teillet, M.A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 30 (1), 31-48 (1973).
    71. Le Douarin, N.M. & Jotereau, F.V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142 (1), 17-40 (1975).
    72. Le Douarin, N.M., Renaud, D., Teillet, M.A., & Le Douarin, G.H. Cholinergic differentiation of presumptive adrenergic neuroblasts in interspecific chimeras after heterotopic transplantations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72 (2), 728-732 (1975).
    73. Houssaint, E., Belo, M., & Le Douarin, N.M. Investigations on cell lineage and tissue interactions in the developing bursa of Fabricius through interspecific chimeras. Dev. Biol. 53 (2), 250-264 (1976).
    74. Le Douarin, N.M., Jotereau, F.V., Houssaint, E., & Belo, M. Ontogeny of the avian thymus and bursa of Fabricius studied in interspecific chimeras. Ann. Immunol. (Paris). 127 (6), 849-856 (1976).
    75. Fontaine, J. & Le Douarin, N.M. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras. The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series. J. Embryol. Exp. Morphol. 41, 209-222 (1977).
    76. Narayanan, C.H. & Narayanan, Y. On the origin of the ciliary ganglion in birds studied by the method of interspecific transplantation of embryonic brain regions between quail and chick. J. Embryol. Exp. Morphol. 47, 137-148 (1978).
    77. Lwigale, P.Y., Cressy, P.A., & Bronner-Fraser, M. Corneal keratocytes retain neural crest progenitor cell properties. Dev. Biol. 288 (1), 284-293 (2005).
    78. Lwigale, P.Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev. Biol. 239 (2), 323-337 (2001).
    79. Tanaka, H., Kinutani, M., Agata, A., Takashima, Y., & Obata, K. Pathfinding during spinal tract formation in the chick-quail chimera analysed by species-specific monoclonal antibodies. Development. 110 (2), 565-571 (1990).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter