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 JoVE Immunology and Infection

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

1, 1, 2, 3, 4, 4, 1,5, 1,6

1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, 2Department of Microbiology, Mount Sinai School of Medicine, 3Laboratory of Molecular Genetics, Blood Research Institute, 4City of Milwaukee Health Department Laboratory, 5Division of Hematology-Oncology/BMT, Children's Hospital of Wisconsin, Medical College of Wisconsin, 6Division of Hematology and Oncology, Dept Medicine, Medical College of Wisconsin

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    Summary

    Cette méthode décrit l'utilisation de système d'imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut <volume de 10 ul de matériel d'essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

    Date Published: 2/04/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3623

    Cite this Article

    Kumar, P., Bartoszek, A. E., Moran, T. M., Gorski, J., Bhattacharyya, S., Navidad, J. F., et al. High-throughput Detection Method for Influenza Virus. J. Vis. Exp. (60), e3623, doi:10.3791/3623 (2012).

    Abstract

    Virus de la grippe est un agent pathogène respiratoire qui provoque une degré élevé de morbidité et de mortalité chaque année en plusieurs parties du monde. Par conséquent, le diagnostic précis de la souche infectante et rapide criblage à haut débit d'un grand nombre d'échantillons cliniques est primordiale pour lutter contre la propagation des infections en cas de pandémie. Actuelles des diagnostics cliniques d'infections de la grippe sont basées sur des tests sérologiques, la réaction en chaîne par polymérase, l'immunofluorescence directe et de 1,2 spécimen de culture cellulaire.

    Nous rapportons ici le développement d'une nouvelle technique de diagnostic utilisé pour détecter les virus de la grippe en direct. Nous avons utilisé les ressources humaines adaptée à la souris A/PR/8/34 (PR8, H1N1) de 3 à tester l'efficacité de cette technique en utilisant des cellules MDCK 4. Cellules MDCK (10 4 ou 5 x 10 3 par puits) ont été cultivées dans 96 - ou de plaques de 384 puits, des infectées par le PR8 et de protéines virales ont été détectées utilisant des anticorps anti-M2 suivie par une IR de colorant-conjugué Secanticorps secondaire. M2 5 et l'hémagglutinine 1 sont deux protéines marqueurs majeurs utilisés dans de nombreux différents tests de diagnostic. Embauche IR-dye-anticorps secondaires conjugués à minimiser l'autofluorescence associée à d'autres colorants fluorescents. L'utilisation de l'anticorps anti-M2 nous a permis d'utiliser l'intensité de fluorescence spécifique de l'antigène comme une métrique directe de la quantité virale. Pour énumérer l'intensité de fluorescence, nous avons utilisé le LI-COR Odyssey à base de scanner IR. Ce système utilise deux canaux à base de laser détections infrarouges pour identifier les fluorophores et de les différencier du bruit de fond. Le premier canal excite à 680 nm et émet à 700 nm pour aider à quantifier l'arrière-plan. Le second canal détecte fluorophores que excitent à 780 nm et émettent à 800 nm. Numérisation de PR8-infectés cellules MDCK dans le scanner IR a indiqué une infection virale titre dépendant fluorescence brillante. Une corrélation positive de l'intensité de fluorescence à titre de virus à partir de 10 2 -10 5 UFP pourrait être consistently observée. Positivité minimale détectable, mais toujours vu avec 10 2 -10 3 PFU PR8 titres viraux ont démontré la sensibilité élevée des colorants dans le proche infrarouge. Le rapport signal-bruit a été déterminée en comparant la maquette infectés ou isotype-traités des cellules MDCK.

    En utilisant les intensités de fluorescence à partir de 96 - ou des formats de plaques de 384 puits, nous avons construit des courbes de titrage standard. Dans ces calculs, la première variable est le titre viral tandis que le deuxième variable est l'intensité de fluorescence. Par conséquent, nous avons utilisé la distribution exponentielle pour générer une courbe d'ajustement afin de déterminer la relation polynomiale entre les titres viraux et des intensités de fluorescence. Collectivement, nous concluons que IR à base de colorant système de détection de protéines peut aider à diagnostiquer l'infection des souches virales et précisément énumérer le titre des agents pathogènes infectieux.

    Protocol

    1. MDCK culture de cellules

    1. Culture 5 millions de cellules MDCK nuit dans un T-75 cm 2 flacon dans 20 ml de milieu RPMI1640 complet avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 1 mM pyruvate de sodium, 5% de bicarbonate de sodium 7,5% solution et 0,001% β-mercaptoéthanol dans un incubateur à 37 ° C infusé avec 5,2% de CO 2.

    2. PR8 infection et de collecte de fluide BAL

    1. Défi souris C57BL / 6 par voie intranasale avec 5000 UFP de virus PR8 dans du PBS stérile dans un volume total de 30 pi par une narine. Effectuer des simulations en utilisant uniquement les infections du PBS stérile sans le virus.
    2. Euthanasier souris 0, 2, 4 et 7 jours après l'infection et de réduire la cavité thoracique ouvrir et faire un parallèle 1 cm incision de la trachée à travers la fourrure de la souris pour l'exposer.
    3. Faire une incision médiane sur la partie proximale de la trachée.
    4. Faire infuser la trachée avec 0,5 ml de BSA PBS-1% et aspirer la BAL de liquide. Liquides de LBA peut être stocké dans -20 ° C congélateur jusqu'à ce que utilisé.

    3. Infection par le virus et la détection de protéine de la matrice virale (M2) avec l'Odyssée LI-COR

    1. Pour quantifier les titres viraux à l'aide infra rouge colorant conjugués anticorps, récolter les cellules MDCK de T-75 cm 2 flacons et les plaques en optique à fond plat noir 96 puits (10.000 cellules par puits) ou de 384 puits (5000 cellules par puits ) plaques. Culture des cellules MDCK pour une nuit à 37 ° C en milieu RPMI1640 complet et laver deux fois avec du sérum sans DMEM contenant BSA (0,2%, en poids / volume), la pénicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), de sodium pyruvate (1 mM), une solution de bicarbonate de sodium (5% de 7,5%) et β-mercaptoéthanol (0,001%).
    2. Incuber les cellules MDCK avec le liquide de LBA (50 pi pour plaque de 96 puits ou 10 pi pour plaque 384 puits) ou virus PR8 avec des titres connus dans chaque puits avec un volume égal (50 microlitres par plaque de 96 puits ou 10 pl pour 384 - puits) de milieu DMEM,contenant de la L-1-tosylamido-2-phényléthyle cétone chlorométhyl (TPCK)-traitée la trypsine (0,2 ug / ml).
    3. Après 1 h d'infection, ajouter 100 ul (plaque de 96 puits) ou 20 pi (384 puits) de 10% de FBS contenant RPMI1640 milieu complet à chaque puits.
    4. Continuer à cultiver des cellules MDCK pour un autre h 16 de l'infection; laver les cellules MDCK deux fois avec 100 pi (plaque de 96 puits) ou 20 pi (384 puits) de PBS-1% solution de BSA et de fixer avec 100 pi (96 puits plaque) ou 20 pi (384 puits) de 1% de paraformaldéhyde pendant 5 min.
    5. Après fixation, incuber les cellules MDCK encore pendant 30 min avec 100 pi (plaque de 96 puits) ou 20 pi (384 puits) de BSA PBS-1% pour le blocage.
    6. Après le blocage incuber les cellules MDCK pendant 1 h avec l'anticorps primaire contre la protéine M2 (1:1000, dilué dans du PBS-BSA 1%). Utiliser 50 pi par ul bien et 20 de l'anticorps dilué par puits dans 96 puits ou 384 puits de plaques, respectivement.
    7. Laver les cellules MDCK trois fois avec 100 pi (plaque de 96 puits) Ou 20 pi (384 puits) de PBS contenant 1% de BSA et incuber pendant 1 h avec 50 pi (plaque de 96 puits) ou 20 pi (384 puits) de chèvre anti-souris IRDye @ 800 anticorps secondaire ( 1:200 de dilution).
    8. Laver les cellules MDCK trois fois avec 100 pi de PBS contenant 1% de BSA. Placez les plaques colorées sur la plate-forme de verre de lecture du scanner Odyssey LI-COR IR et mettre le lecteur pour un 96 - ou lecture des plaques de 384 puits.
    9. Vierges puits témoins négatifs peut être réglé en utilisant le logiciel Odyssey LI-COR. Quantifier plaque entière ou des puits sélectionnés dans la plaque en utilisant le logiciel Odyssey LI-COR.
    10. Utilisation de l'outil Forme automatique, tracer les frontières d'une région cible (ROI) au milieu d'un puits d'essai de 96 - ou 384-puits. Création d'un retour sur investissement permet au logiciel de comparer les puits de fond définies aux échantillons du virus-titrés.
    11. Pour définir la valeur de référence pour le dosage entier, utilisez un retour sur investissement de fond. Introduire les deux réticules opposées fournies par le logiciel Odyssée dans le retour sur investissement pour mesurer la vre l'intensité de la fluorescence dans l'ensemble du bien.
    12. Numérisation des plaques en utilisant 780 canaux nm pour la détection et de 680 nm comme longueur d'onde de référence dans un scanner Odyssey LI-COR IR.
    13. Une fois la commande 'Lecture' est activé, les intensités de fluorescence à des intervalles uniformes de la ROI sera mesurée et les données recueillies points intégrés. Un multiplicateur de l'écart-type sera de déterminer le niveau de signal sur la ligne de base qui est inclus dans la détermination ROI.
    14. Fluorescence de fond sera quantifié à partir de l'anticorps maquette infecté ou secondaire contrôle seule, et sera utilisé pour estimer l'intensité intégrée dans les puits d'essai.
    15. Choisissez 'intensité intégrée »pour les calculs, car il représente le volume net pixel pour une place définie individu et est indépendant de la dimension de l'élément. Utilisez la courbe standard à partir des titres viraux connus pour calculer les titres viraux des échantillons inconnus. Utilisez une courbe d'interpolation de temps pour calculer avec précision les titres viraux. Calculer la vtitres d'IRAL dans les échantillons d'épreuve by sont comparés les les intensités des échantillons d'essai avec la courbe standard.

    4. Les résultats représentatifs

    Normalisation de l'IR à base de colorant système de détection virale élevée débit

    PR8 virus peut infecter les cellules MDCK, par conséquent, nous avons utilisé ces cellules pour développer ce test. Nous avons mesuré les titres viraux en utilisant un anticorps primaire contre une protéine de la matrice de la grippe virale (M2). Contrairement à d'autres méthodes, nous avons utilisé un anticorps secondaire est conjugué à un colorant IR proche. Cette méthode fournit un moyen simple, automatisée PR8 détermination du titre du virus en utilisant l'intensité de fluorescence qui est généré lors de la détection protéine M2. Après l'infection virus de l'influenza, protéine M2 est traduit d', transportés et s'accumule dans la cellule hôte y compris la surface de la cellule. Ainsi, la quantité de la protéine M2 représente un paramètre mesurable pour déterminer la quantité du virus. En comparant les intensités deles échantillons d'essai avec la courbe standard fournit la mesure précise de titres viraux.

    Pour déterminer l'efficacité de la méthode à base de fluorescence, nous avons cultivé des cellules MDCK 10 4 / puits dans la chambre de glisse pendant la nuit. PR8 stocks viraux de titres connus ont été ajoutés à des puits en double avec des unités différentes plaques de formage (UFP) et autorisé à s'adsorber sur les cellules pendant une heure. Les cellules ont été incubées pendant 16 h pour permettre au virus de se propager. Après cela, les cellules MDCK dans les diapositives de la chambre ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 1%, lavées et colorées avec des anticorps anti-M2 pour 1 h, suivie par AlexaFluor 488-conjugué anticorps secondaire pendant 1 h supplémentaire. Confocale analyses microscopiques de cellules infectées par MDCK démontré la monocouche adhérente était en grande partie intact et la protéine dérivée PR8-M2 était présent en abondance à l'intérieur des cellules infectées MDCK (figure 1A). Les cellules fluorescentes a pu être détecté dans les infections virales avec des titres aussi bas que 10 2

    Par conséquent, d'établir une méthode d'estimation précise virale nous avons utilisé un IR à base de colorant de détection et de quantification du système. Les cellules MDCK (10 4 / puits) ont été cultivées dans des plaques à 96 puits, infectés par le virus PR8 et des protéines virales ont été détectées à l'aide anti-M2 suivi par un colorant IR-anticorps secondaire conjugué. L'utilisation de l'anticorps anti-M2 nous a permis d'utiliser l'intensité de fluorescence spécifique de l'antigène comme une métrique directe de la quantité virale. Pour énumérer l'intensité de fluorescence, nous avons utilisé le LI-COR Odyssey à base de scanner IR. Ce système utilise deux canaux laser-based détections infrarouges pour identifier les fluorophores et de les différencier du bruit de fond. Le premier canal excite à 680 nm et émet à 700 nm pour aider à quantifier l'arrière-plan. Le second canal détecte fluorophores que excitent à 780 nm et émettent à 800 nm. Numérisation de PR8-infectés dans des cellules MDCK LI-COR Odyssey a indiqué une infection virale titre dépendant fluorescence brillante (figure 1B). M2 positifs fluorescents des cellules MDCK étaient clairement visibles à l'intérieur du puits (figure 1B). Une corrélation positive de l'intensité de fluorescence à titre de virus à partir de 10 2 -10 5 UFP pourrait être constamment observé. PR8 titrages viraux plus élevés que 10 6 PFU plomb à la mort cellulaire, qui fixe une limite supérieure pour la sensibilité du dosage. Positivité minimale détectable, mais toujours vu avec 10 2 -10 3 PFU PR8 titres viraux ont démontré la sensibilité élevée des colorants dans le proche infrarouge. Le rapport signal-bruit a été déterminée en comparant le mock-infectés ou isotypes d'anticorps traités des cellules MDCK. Ces deux contrôles abouti à des niveaux négligeables ou indétectables de fluorescence (figure 1B).

    Pour améliorer encore la sensibilité et de réduire les exigences d'essai d'échantillons de volume, nous avons infecté 5 × 10 3 cellules MDCK / puits dans 384 puits. PFU différentes de PR8 ont été testés comme un dilutions en série de log (figure 1C). La sensibilité de détection à partir de plaques de 384 puits était comparable à celle des essais de plaques à 96 puits. Les deux 10 1 et 10 2 PFU travaillé sans relâche de mieux dans les plaques de 384 puits par rapport à plaques à 96 puits. En utilisant les intensités de fluorescence à partir de 96 - ou des formats de plaques de 384 puits, nous avons construit des courbes de titrage standard (figure 1D). Dans ces calculs, la première variable est le titre viral tandis que le deuxième variable est l'intensité de fluorescence. Par conséquent, nous avons utilisé la distribution exponentielle pour générer une courbe-apte à détermine la relation polynomiale entre les titres viraux et des intensités de fluorescence. Nous avons également validé nos observations en utilisant un autre anticorps qui est dirigé contre la nucléoprotéine (NP) de virus PR8 (données non présentées). Sources distinctes de PR8 souches ont également été utilisés pour infecter les cellules MDCK qui ont été testés avec des anti-NP ou anti-M2 anticorps (données non présentées). Collectivement, nous concluons que IR à base de colorant système de détection de protéines peut aider à diagnostiquer l'infection des souches virales et précisément énumérer le titre des agents pathogènes infectieux.

    Considérations mathématiques pour le calcul des titres viraux

    Les calculs mathématiques de l'intensité de fluorescence et de déterminations du titre se fait comme décrit ci-dessous. Suite à la procédure de coloration, plaque entière ou des puits sélectionnés au sein de la plaque sont quantifiés à l'aide du logiciel Odyssey LI-COR. Utilisation de l'outil Forme automatique, les limites d'une région cible (ROI) a été élaboré au milieu des puits d'essai de 96 - ou 384-nousll plaques (figure 2A et B). Création d'un retour sur investissement permet au logiciel de comparer les puits de fond définies aux échantillons du virus-titrés. Un retour sur investissement de fond a été utilisé pour définir la valeur de référence pour le dosage entier. Deux opposés réticule (blanc) ont été introduits dans le retour sur investissement pour mesurer l'intensité de la fluorescence dans le puits (figure 2C). Courbes à le côté droit et ci-dessous les puits représentatifs dans la Figure 2C représentent l'intensité de les pixels le long de ces poils croisées. Les intensités de fluorescence à des intervalles uniformes de la ROI ont été mesurés et les points de données recueillies ont été intégrées. Un multiplicateur de l'écart-type déterminé le niveau de signal sur la ligne de base qui a été inclus dans la détermination ROI. Contexte de fluorescence a été quantifiée à partir de l'anticorps maquette infecté ou secondaire seul contrôles et utilisées pour estimer l'intensité intégrée dans les puits d'essai. Nous avons choisi l'intensité intégrée pour les calculs, car il représvolume de parents pixel nette pour une place individuelle définie et est indépendante de la taille caractéristique. En outre, intensité intégrée est sensiblement indépendante de la résolution. Intensité totale / pixel (I) correspond à l'intensité du signal résultant de l'. Cupule sélectionnée dans la zone de pixels (Est-) plus l'le signal résultant de l'arrière-plan de la zone de pixels (b) Par conséquent, pour le pixel «i»:

    I i = i S i + b i

    Volume de Pixel Taille d'représente à la fois l'ampleur du signal et de la zone dans laquelle il est distribué. Zone de signal d'est en relation avec la distribution de l'échantillon qui est générer le signal de. Le volume pixel est égal au signal total mesuré en pixel «i» dans la zone (a) du pixel fois sa hauteur (I). Donc, pour le pixel «i»:

    vi = a I i

    Le volume total de pixels est la somme du signal total de toute la zone ainsi:

    ; n n
    V = Σv i = aΣI i
    i = 1 i = 1

    Intensité intégrée est la somme de les valeurs d'intensité de tous les pixels délimitées par les fonctionnalité, multiplié par l'aire du cercle / rectangle de (mm comte 2). Par conséquent, l'intensité intégrée =

    un (ΣI i - b)

    Ici, b représente l'intensité du pixel de fond moyen. Cette formule calcule les intensités des signaux intégrés de contrôle ou des puits expérimentaux et établit ainsi une courbe standard. Les titres viraux dans les échantillons d'essai ont été calculées à l'aide de cette courbe standard. Opération de concentration (de l'intensité) est définie comme la quantité de présents de fluorescence dans un retour sur investissement défini. Les concentrations dans les échantillons d'essai sont calculpar rapport à Ted les concentrations définies par les normes en la même image. Pour calculer les titres d'précises virales, l'intensité de chaque norme de concentration est tracée et équipé d'une courbe d'interpolation à long. Les concentrations des échantillons de test sont calculées en comparant l'intensité de la zone à l'intérieur de la courbe standard.

    Détermination de titres viraux dans le liquide BAL de souris infectées par la grippe

    La détection de particules virales de la grippe en direct dans des échantillons cliniques et de laboratoire est d'une importance critique. Par conséquent, nous a ensuite examiné si nous pouvons utiliser cette méthode pour déterminer les titres viraux dans les échantillons de laboratoire. Liquides de LBA ont été recueillies à partir de souris non immunisées et dopé avec une quantité connue de virus PR8. Pointes liquides de LBA ont été linéairement titré de l'énumération des titres viraux. Des aliquotes de pointes liquides de LBA ont été utilisés pour infecter les cellules MDCK en plaques à 96 puits, fixées et colorées avec des anticorps anti-M2 et IR colorant conjugué secondard'anticorps y. Les résultats présentés dans la figure 3A démontrer que les titres viraux dans le liquide enrichi BAL étaient détectables et en corrélation avec les PR8 titres dans la courbe standard. Utilisation de la courbe standard, le nombre précis virales dans le liquide enrichi et titré BAL a été quantifiée. Exponentielles calculs d'ajustement de courbe a fourni une mesure de calculer les titres viraux dans le liquide enrichi BAL (figure 3B). Grâce à cette méthode, nous avons obtenu d'excellents corrélations entre les titres calculés et dopé virales, la validation de cette approche (figure 3C).

    Ensuite, nous avons analysé le liquide BAL de PR8-souris infectées. PR8 a été largement utilisé dans des modèles murins pour comprendre l'immunité humaine 3 pathologie et anti-virale. Des groupes de souris ont été infectées par voie intranasale avec 5.000 PFU de PR8. Les souris ont été suivis pendant une perte de poids, l'apparence de dos voûté, la fourrure ébouriffée et d'autres symptômes cliniques. Les jours 0, 2, 4, 7 et 10 de la post-infection,souris ont été sacrifiées et liquides de LBA ont été recueillies. Pour utiliser ces échantillons de laboratoire, des cellules MDCK ont été incubées avec des dilutions successives de liquide de LBA dans un volume final de 50 ul pendant 17 h dans des plaques 96 puits. Puits de contrôle de cellules MDCK infectées avec des titres connus de stock virus PR8 servi à générer une courbe standard. Après l'infection, les cellules ont été lavées, fixées et colorées avec des anticorps anti-M2 primaire, suivis par le proche infrarouge colorant conjugué anticorps secondaire. Les cellules MDCK qui étaient maquette infectés ou traités avec des contrôles d'isotype après l'infection à condition que les intensités de fluorescence de fond pour les calculs du titre.

    Les analyses de la liquide de LBA a démontré que le virus PR8 dans l'échantillon de laboratoire est détectable par le système de dosage IR à base de colorant. Une augmentation significative de la charge virale dans le liquide de LBA a été observée aux jours 2 et 4 après l'infection (figure 4A). Les calculs de l'intensité intégrée a indiqué que les fluides de BAL jours 2 et 4 de i posternfection contenaient des niveaux importants de virus PR8 (figure 4B). Nos résultats montrent une perte de poids progressive mais significative au cours de la phase précoce de l'infection PR8, ce qui démontre la gravité de la maladie. Néanmoins, la plupart des souris commencé à se redresser à partir de symptômes de la maladie et la prise de poids 7 jours après l'infection (figure 4C). Souris à jour 10 après l'infection n'avait aucune PR8 détectable indiquant la clairance du virus, qui a également corrélée avec l'augmentation du poids corporel et des réductions considérables dans les symptômes de la maladie.

    Pour étendre l'application de ce test, nous avons testé une année 2009 de la grippe A (H1N1) humaine isoler avec IR à base de colorant système de détection d'anticorps et l'a comparé en temps réel PCR Cet échantillon clinique a été isolé à partir d'un écouvillon nasopharyngé combiné / obtenu à partir de la gorge du patient suspect. L'isolat a été propagé dans une lignée cellulaire MDCK au Laboratoire Milwaukee Département de la santé. Les résultats des tests étaient comparablesrouge pour vérifier la sensibilité de l'IR à base de colorant méthode en temps réel aux tests de PCR (Figure 5). Les résultats indiquent que l'IR à base de colorant système de détection d'anticorps a le potentiel pour détecter la charge virale aussi bas que 10 3 DICT 50 / ml, ce qui est comparable à la PCR basée sur dosage (10 DICT 50 / ml) et à l'automne au sein de la pertinence clinique gamme pour la plupart des échantillons de patients. Ces résultats fournissent des preuves solides que le système de dosage IR à base de colorant a une sensibilité suffisante et le potentiel pour être appliqué pour le dénombrement titre viral dans le laboratoire de recherche et les paramètres cliniques.

    Figure 1
    Figure 1. IR à base de colorant de détection immunitaire des virus de la grippe. (A) confocale analyses microscopiques de la grippe infectées par les cellules MDCK dans les diapositives de la chambre 8-même. Immunofluorescence des analyses microscopiques démontrer la monocouche adhérente MDCK est en grande partie intacte et chargé par le virus dérivé de M2 protéines. (Colombie-Britannique) Quantification des titres viraux basés sur IR colorant et le système Odyssey LI-COR. (D) Génération de courbes exponentielles standard et la courbe-ajustement des profils. Les données présentées dans AD sont représentatifs de cinq expériences indépendantes.

    Figure 2
    Figure 2. Méthodologie de la détermination de titres viraux utilisant des colorants IR. (A) intégrés mesures d'intensité de fluorescence. Un zone définie à l'intérieur du puits d'essai (retour sur investissement) a été marquée pour mesurer les intensités de fluorescence. Utilisation de l'outil Forme automatique, les limites de la ROI ont été établis dans le milieu des puits d'essai de 96 - ou 384 puits plaques. Fluorescence a été mesurée sous forme de pixels individuels (pixel = n) au sein de la ROI. Intensité intégrée est la somme de les valeurs d'intensité de tous les pixels délimitées par les fonctionnalité, multiplié par l'aire du cercle / rectangle de (mm comte 2). (B) Détermination des intensités de fluorescence intégré dans chaque puits. Création d'un retour sur investissementa permis le scanner LI-COR pour comparer les puits de fond définies aux échantillons du virus-titrés. Contexte de fluorescence a été quantifiée à partir de l'anticorps maquette infecté ou secondaire seul contrôles et utilisées pour estimer l'intensité intégrée dans les puits d'essai. (C) Collection de points de données au sein de la ROI. Deux opposés réticule (blanc) ont été introduits dans le retour sur investissement pour mesurer l'intensité de la fluorescence dans le puits. Courbes à le côté droit et ci-dessous les puits représentatifs représentez l'intensité de les pixels le long de ces poils croisées.

    Figure 3
    Figure 3. Détection et quantification des titres de virus dans les liquides de LBA PR8 pointes. (A) des cellules MDCK ont été cultivées dans des plaques 96 puits pendant la nuit et a ajouté avec PR8-pointes liquide de LBA. Les plaques ont été lues dans le système Odyssey LI-COR. (B) exogène fluide enrichi BAL a été comparée avec les courbes standard. (C) Comparaison des calculée à vir devrait titres al. Ajustement de la courbe exponentielle y = 9.4784e fourni 0.0014x. Les données présentées dans AC sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

    Figure 4
    Figure 4. Détection et quantification des virus de la grippe dans les fluides de BAL PR8 souris infectées. (A) Des groupes de souris ont été infectées par voie intranasale avec 5.000 PFU de PR8. Les cellules MDCK ont été incubées avec des dilutions successives de liquide de LBA dans un volume final de 50 ul pendant 17 h dans des plaques 96 puits. Après l'infection, les cellules ont été lavées, fixées et colorées avec des anticorps anti-M2 anticorps primaire suivie par IR colorant conjugué anticorps secondaire. Le panneau de droite représente la courbe standard. (B) Quantification des titres viraux dans le liquide BAL des souris infectées. La perte de poids (C) des souris au cours PR8 l'infection corrélée avec la charge virale. Les données présentées dans AC sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

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    Figure 5. Détection et la quantification de l'année 2009 A (H1N1) (pdm) isolat de l'influenza à partir d'un patient humain. (A) Le IR à base de colorant système de détection d'anticorps par fluorescence pour la demi-fois le titrage de lignée cellulaire infectée MDCK. Les résultats de fluorescence indiquent un dosage a un potentiel pour détecter la charge virale aussi bas que 10 3 DICT 50 / ml. (B) l'acide nucléique extrait de la culture d'isoler avec de série de dix dilutions de quelques H1N1 connus titrés isolat ont été analysés avec la CDC en temps réel PCR 12. La limite de détection pour les PCR en temps réel a été de 10 DICT 50 / ml.

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    Discussion

    La flambée récente épidémie de la grippe aviaire en Asie du Sud et une peur globale de la pandémie de grippe porcine imposer préoccupations énormes pour la santé publique et de la sécurité. Mise au point critique a été consacrée à générer des vaccins pour les souches existantes et nouvelles du virus de la grippe. Disponibilité des rapides technologies à haut débit pour la détection précise et exacte des calculs titre viral va considérablement améliorer le traitement. Les techniques les plus couramment utilisées employées pour calculer titre du virus comprennent des essais de plaque d'hémagglutination de formation et de la grippe. Le test de formation de plaques a d'abord été élaboré pour estimer titres bactériophages et a été adopté par Renato Dulbecco pour calculer animales titres viraux 4. Pour effectuer ce test, 10 des dilutions du stock de la grippe ou des spécimens d'animaux tels que le liquide de LBA sont préparés et aliquotes de 0,1 ml sont inoculés sur la monocouche de cellules MDCK en plaques 6 puits. Le virus est autorisé à s'adsorber sur les cellules MDCK suivies par l'annoncedition d'un milieu nutritif et d'agarose. Au cours de l'incubation, les cellules d'origine infectées libèrent descendance virale qui s'est propagée uniquement aux cellules voisines. L'effet cytopathogène de l'infection par le virus grippal produit une zone circulaire de cellules infectées appelé une plaque. Chaque plaque est sans doute formé après l'infection d'une cellule unique avec une seule particule de virus suivie par la réplication du virus. Le contraste entre les cellules vivantes et les plaques peuvent être améliorées par des colorants tels que le cristal violet. Un inconvénient majeur de cet essai est le manque de reproductibilité et de fortes disparités au sein des expériences. Un autre test utilisé pour déterminer le titre virus de la grippe est le dosage de l'hémagglutination. Le présente protéine hémagglutinine sur la surface de la virus de la grippe se lie efficacement à N-acétylneuraminique l'acide-les protéines contenant sur ​​mammifères et aviaires globules rouges 1. Cette interaction entre le virus de l'influenza et les érythrocytes conduit à d'agglutination sous la forme d'un treillis. Le lEvel d'agglutination est utilisée pour estimer le titre du virus de la grippe dans les éprouvettes. Test d'agglutination érythrocytaire est utilisée uniquement pour déterminer le titrage d'un virus connu et ne peut pas être utilisé à des fins d'identification des souches. Depuis cet essai ne fait pas de distinction entre le live et les virus morts, il est difficile d'obtenir un calcul précis de titres viraux.

    Actuelles des diagnostics cliniques d'infections de la grippe sont basées sur des tests sérologiques, la réaction en chaîne par polymérase, l'immunofluorescence directe et 1,6 spécimen de culture cellulaire. La nouvelle méthode décrite ici a aussi le potentiel clinique et de laboratoire de diagnostic. Grippe détection kits Directigen FLU-A. (BD Biosciences, San Jose, CA) et BinaxNOW (Binax, Inc, Scarborough, ME) test immunochromatographie utilisation pour détecter l'antigène viral tel que nucléoprotéine 7 L'utilisation de ces kits, la détection du virus peut être réalisé dans les 15 minutes, mais tous les échantillons négatifs doivent être en outre screened par le Procédé de culture cellulaire. Diverses études ont également rapporté une faible sensibilité de ces kits, en particulier, lorsque l'infection était légère ou faible 8. Dans notre méthode, nous avons constamment de détecter aussi peu que 100 PFU de virus. Cela donne à penser notre technique est utile dans la détection du virus H1N1 dans des échantillons cliniques, même lorsque l'infection est bénigne. Une méthode à base de fluorescence pour détecter les antigènes viraux ont été signalés, soit des échantillons où aspirat rhinopharyngé ont été analysés directement ou ont été ensemencés sur une monocouche de cellules sensibles à la multiplication du virus et les analyses subséquentes 9. Cependant, ces méthodes sont limitées à des fins de diagnostic et ne conviennent pas pour les calculs titre du virus. Q-PCR aide à identifier la présence de l'ARN viral et de ne pas estimer l'infectiosité des virus vivants. Par rapport à ces essais, le système de dosage IR à base de colorant aidera dans la recherche et le dénombrement titre viral dans les échantillons cliniques et de laboratoire. En cas de flambée de grippe, il estcritique pour diagnostiquer beaucoup d'échantillons dans une période de temps courte. Notre méthode repose sur une plaque de 384 puits et d'un scanner IR permet de numériser 6 plaques à la fois (> 2.000 échantillons), offrant ainsi un plus grand avantage par rapport aux autres méthodes directes fluorescentes. Faisabilité d'un traitement rapide de milliers d'échantillons cliniques pourrait réduire la variabilité des essais, la durée de dosage et les coûts. L'utilisation d'un anticorps M2-spécifique offre l'avantage d'être indépendante des différences entre les souches dans les protéines H et N. La protéine M2-est relativement conservée dans la plupart des souches de la grippe infectant les humains. Si des anticorps spécifiques aux taches qui circulent sont combinés avec notre système de on peut mesurer à la fois le titre de virus et d'identifier la souche. Cependant, depuis M2 est la cible pour les médicaments amantadine comme des mutants peuvent survenir qui pourraient changer le site de liaison pour l'anticorps monoclonal utilisé ici. Ceci constitue une limitation potentielle de ce système chez les individus qui sont traités par ces médicaments.

    Multipledosages sont utilisés pour énumérer les titres de la grippe dans des échantillons d'essai. Pour calculer le virus de titre, 50% de la dose infectieuse de culture tissulaire (DICT 50) et d'œufs allantoïques fluide à base de tests sont largement utilisés 1,10. Toutefois, les exigences de plusieurs jours que ces méthodes soient moins fiables. En outre, dans ces méthodes des calculs basés sur le changement de 50% dans le nombre de plaques de fournir théoriques, mais pas exacte titrages viraux. Plaque formant des tests peuvent être effectués dans les 96 heures, mais, manque de reproductibilité est une préoccupation majeure dans les calculs de titre viral. La technique décrite ici présente a plusieurs avantages distincts. D'abord, il s'agit d'une technique hautement reproductible avec des résultats cohérents. Deuxièmement, les calculs titre viral sont basées sur la quantification simple des intensités de fluorescence, qui sont comparées contre de définition des courbes standard. Troisièmement, deux ou plusieurs anticorps primaires peuvent être utilisés pour diagnostiquer de multiples sérotypes dans un échantillon donné. En outre, IR colorant anticorps conjugués ont minimal autofluorescence et ont été utilisés pour l'imagerie des cellules 11. UV ou visuelle de rayonnement (300-600 nM) des résultats de l'autofluorescence cellulaire élevée en raison de la présence de hautes quantique rendement fluorophores endogènes. Il s'agit notamment des acides aminés aromatiques, les lipo-pigments, des nucléotides pyridiniques (NADPH), l'élastine, le collagène et coenzymes flavines. Cette propriété intrinsèque des cellules, il est difficile d'utiliser ces sources de rayonnement en tant que sondes pour quantifier l'expression de protéines spécifiques. En revanche, le proche infrarouge colorants exciter et émettent entre 670-1000 nm. Beaucoup de molécules hôtes cellulaires et d'hydrocarbures aromatiques polycycliques n'excitent pas à cette longueur d'onde et en raison de diffusion de la lumière réduite, émettre de la fluorescence de fond extrêmement faible. En outre, la fenêtre entre le fond et la détection spécifique est largement améliorée en raison d'un coefficient d'extinction élevé des fluorophores dans le proche infrarouge. Photostabilité, supérieure signal de-sur-bruit, est extrêmement pertinente dans la quantification des titres viraux. Utilisez des microflchambres uidic permettra d'automatiser le processus de sélection grâce à des contrôles robotiques, et pourrait nous permettre de tester des échantillons cliniques hautement contagieuses en toute simplicité. Ainsi, l'utilisation des colorants dans le proche infrarouge dans ces méthodes est idéal et très fiable d'énumérer les titres viraux dans des échantillons de tissus.

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    Disclosures

    Nous n'avons rien à communiquer.

    Acknowledgements

    Ce travail est soutenu en partie des subventions du NIH R01 A1064826-01, U19-01 AI062627, NO1-HHSN26600500032C (à SM). Nous remercions nos membres de laboratoire à l'aide de discussion et technique, Tina Heil pour l'examen critique du manuscrit. Nous tenons à remercier David Bina, Milwaukee Département de la Santé Laboratoire de culture de virus et PCR.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Bovine serum albumin Atlanta Biologicals S11750
    PR8 virus From Dr Thomas M Moran
    Goat anti-mouse IRDye@800 LI-COR Biosciences 926-32210 1:200 dilution
    LI-COR Odyssey IR scanner LI-COR Biosciences 9201-01
    384-wells flat bottom plate Nalge Nunc international 164730
    96-wells flat bottom plate Nalge Nunc international 165305
    DMEM medium Invitrogen 11965126
    RPMI medium Invitrogen 11875135
    Sodium bicarbonate Invitrogen 25080
    L-glutamine 100x Invitrogen 25030
    Trypson-EDTA Invitrogen R001100
    Sodium Pyruvate Invitrogen 11360070
    Anti-M-2 antibody From Dr Thomas M Moran
    Anti-NP mAb CDC V2S2208 Obtained with an MTA

    References

    1. Hirst, G.K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 94, 22-23 (1941).
    2. Jonsson, N., Gullberg, M., & Lindberg, A.M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
    3. Kalter, S.S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184 (1949).
    4. Dulbecco, R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).
    5. Deyde, V.M., Nguyen, T., Bright, R.A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A.I., & Gubareva, L.V. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).
    6. Jonsson, N., Gullberg, M., & Lindberg, A.M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
    7. Rahman, M., Kieke, B.A., Vandermause, M.F., Mitchell, P.D., Greenlee, R.T., & Belongia, E.A. Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).
    8. Landry, M.L. & Ferguson, D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).
    9. Herrmann, B., Larsson, C., & Zweygberg, B.W. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA). J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).
    10. Reed, L.J. & Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).
    11. Doerr, A. Fluorescent proteins: into the infrared. Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).
    12. Shu, B., Wu, KH., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., & Lindstrom, S. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).

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