Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

L’objectif global de cette procédure est de quantifier efficacement les titres viraux de la grippe dans les voies respiratoires des souris infectées. Les souris sont d’abord inoculées par voie intranasale avec le virus de la grippe à un moment choisi. Points après l’infection.

Les M sont sacrifiés et le lavage broncho-alvéolaire ou liquide BAL est recueilli. Ensuite, le liquide BAL est utilisé pour infecter les cellules MDCK. Les cellules infectées peuvent ensuite être colorées pour détecter la présence de protéines virales à l’aide d’anticorps primaires spécifiques, suivis d’anticorps secondaires conjugués à l’infrarouge.

Les signaux infrarouges sont lus à l’aide du scanner Lycor Odyssey et le logiciel Odyssey peut être utilisé pour déterminer les titres viraux. À l’aide d’une courbe standard, il est possible d’obtenir une détermination quantitative des titres viraux. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont la quantification précise des titres viraux, la reproductibilité et le faible volume nécessaire à la réalisation de ce dosage.

Les implications de cette technique peuvent être étendues au diagnostic et au traitement de diverses maladies virales respiratoires, car elle peut être utilisée pour quantifier les titres viraux dans les échantillons cliniques après cette procédure. D’autres méthodes comme la QPCR peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le nombre de copies virales. Lorsque vous essayez cette technique, il est important de ne pas oublier de vérifier le titre du virus de contrôle standard après ce développement.

Cette technique permet au chercheur dans le domaine de la logique virale d’explorer la protéine virale de titrage viral ou de coloration par torsion dans des échantillons cliniques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 17 heures. Il a effectué avec précision Infecter les souris par voie intranasale avec 5 000 unités de plate-forme ou PFU du virus de la grippe PR huit dans 30 microlitres de PBS stérile ou avec PBS seul comme contrôle négatif pour la collecte de liquide BAL sur les animaux euthanasiés d’abord, couper que la cavité thoracique ouverte et faire une incision d’un centimètre parallèle à la trachée pour l’exposer avec de fines ciseaux stériles.

Faites une petite incision dans la trachée, perfiez la trachée avec 0,5 millilitre de 1 % BSA contenant du PBS et aspirez doucement le liquide de lavage. Stockez les fluides BAL à moins 20 degrés centigrades pour quantifier les titres viraux dans les fluides de lavage. Cultivez d’abord 5 millions de cellules MDCK dans 20 millilitres de RPMI complet dans un flacon T 75 pendant la nuit à 37 degrés centigrades le lendemain, récoltez les cellules et plaquez-les dans une plaque noire optique à fond plat de 96 puits à 10 000 cellules par puits.

Ensuite, incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés centigrades après l’incubation. Aspirez doucement le surnageant et lavez les cellules deux fois dans du DMEM complet mais sans sérum contenant 0,2 % BSA au lieu de FBS. Une fois les cellules lavées, ajoutez 50 microlitres de liquide BAL ou 50 microlitres d’une suspension contenant une concentration connue de virus par puits.

Ajoutez ensuite 50 microlitres par puits de DMEM, un milieu contenant de la trypsine traitée au TPCK à 0,2 microgramme par millilitre pour améliorer l’attachement, l’entrée et la réplication virales. Incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés centigrades pour permettre au virus d’absorber. Ajoutez ensuite 100 microlitres de FBS contenant du RPMI complet à chaque puits de culture des cellules pendant la nuit pour permettre à l’infection de se propager après l’incubation pendant la nuit.

Lavez les cellules avec 100 microlitres de 1 %B-S-A-P-B-S. Une fois les cellules lavées, ajoutez 100 microlitres par puits de 1 % de para formaldéhyde et incubez les plaques pendant cinq minutes à température ambiante pour fixer les cellules Ensuite, lavez avec 100 microlitres par puits de 1 % B-S-A-P-B-S et incubez les cellules pendant 30 minutes supplémentaires pour le blocage. Une fois les cellules bloquées, ajoutez 50 microlitres par puits d’anticorps antiviraux primaires M deux dilués à un à 1000, et incubez les plaques pendant une heure à température ambiante pour colorer toute protéine virale présente après l’incubation, lavez les cellules trois fois dans 1 %B-S-A-P-B-S et incubez-les avec 100 microlitres par puits d’anticorps secondaires conjugués à un colorant infrarouge à une dilution de un à 200 pendant une heure à température ambiante Dans l’obscurité, une fois les cellules tachées, lavez-les trois fois comme précédemment.

Positionnez ensuite les plaques sur la plate-forme de lecture du scanner infrarouge Licor Odyssey. Sélectionnez le réglage de la plaque à 96 puits sur le lecteur à l’aide du logiciel Licor Odyssey. Identifiez les puits de contrôle négatifs à blanc, puis quantifiez la fluorescence de l’ensemble de la plaque.

Utilisez l’outil de forme automatique pour dessiner la région d’intérêt ou le retour d’intérêt au milieu d’un test. Bien utiliser le retour sur investissement d’un contrôle négatif. Eh bien, pour définir la valeur de fluorescence de base pour le test, introduisez les deux réticules opposés fournis par le logiciel Odyssey dans le retour sur investissement pour mesurer l’intensité de la fluorescence à travers le puits.

Ensuite, scannez la plaque en utilisant le canal de détection de 780 nanomètres et de 680 nanomètres comme longueur d’onde de référence. Une fois la commande de lecture activée, les intensités fluorescentes à des intervalles uniformes du retour sur investissement seront mesurées. Ensuite, les points de données collectés sont intégrés.

Un multiplicateur d’écart-type déterminera le niveau de signal sur la ligne de base qui est inclus dans le retour sur investissement : assurez-vous de sélectionner l’option d’intensité intégrée pour les calculs, car elle représente le volume net de pixels pour des zones définies, indépendamment de la taille. La fluorescence de fond sera quantifiée à partir des témoins infectés simulés et sera utilisée pour estimer l’intensité intégrée dans les puits d’essai. La fluorescence infrarouge des puits dupliqués contenant des dilutions en série de virus titré est utilisée pour construire une courbe standard.

La courbe standard peut ensuite être utilisée pour déterminer les titres de liquide BAL de souris infectées. Dans cette expérience, une augmentation significative de la charge virale a été observée aux deuxième et quatrième jours. Le virus post-infection a été éliminé au jour 10, comme indiqué ici.

Les titres viraux mesurés à l’aide de ce test sont bien corrélés avec la perte de poids chez la souris après l’infection. Cette technique peut également être appliquée à des échantillons humains. Voici une quantification du virus H one N one à partir d’un écouvillon nasal humain.

La limite de détection ici est de 10 à la troisième dose infectieuse de TCID ou de culture tissulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous avez également une bonne compréhension de la façon d’estimer le titre du virus de la grippe à l’aide d’un test basé sur une matrice infrarouge. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle car l’utilisation de l’imageur corp peut être difficile, ce qui permettra de simplifier et de démontrer nos méthodes de quantification des titres viraux dans une plaque de 96 ou 384 puits.

Et enfin, n’oubliez pas que travailler avec un virus peut être extrêmement dangereux et que des précurseurs tels que des équipements de protection individuelle doivent toujours être pris lors de cette procédure.