Name: Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez une méthode de détection à haut débit pour quantifier les titres viraux de grippe H1N1 dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire de souris infectées. Cette technique utilise un système d'imagerie à infrarouge offrant une sensibilité élevée avec seulement 10 µl d'échantillon.

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Ce travail est soutenu en partie des subventions du NIH R01 A1064826-01, U19-01 AI062627, NO1-HHSN26600500032C (à SM). Nous remercions nos membres de laboratoire à l&#39;aide de discussion et technique, Tina Heil pour l&#39;examen critique du manuscrit. Nous tenons à remercier David Bina, Milwaukee Département de la Santé Laboratoire de culture de virus et PCR.

<ol><li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+%28PR8%29+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li>
<li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+%28H5N1%29+viruses+using+a+pyrosequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Directigen+flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li>
<li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li>
<li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR%3A+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+%28FLU+OIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+into+the+infrared%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li>
<li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

La flambée récente épidémie de la grippe aviaire en Asie du Sud et une peur globale de la pandémie de grippe porcine imposer préoccupations énormes pour la santé publique et de la sécurité. Mise au point critique a été consacrée à générer des vaccins pour les souches existantes et nouvelles du virus de la grippe. Disponibilité des rapides technologies à haut débit pour la détection précise et exacte des calculs titre viral va considérablement améliorer le traitement. Les techniques les plus couramment utilisées employées pour calculer titre du virus comprennent des essais de plaque d&#39;hémagglutination de formation et de la grippe. Le test de formation de plaques a d&#39;abord été élaboré pour estimer titres bactériophages et a été adopté par Renato Dulbecco pour calculer animales titres viraux 4. Pour effectuer ce test, 10 des dilutions du stock de la grippe ou des spécimens d&#39;animaux tels que le liquide de LBA sont préparés et aliquotes de 0,1 ml sont inoculés sur la monocouche de cellules MDCK en plaques 6 puits. Le virus est autorisé à s&#39;adsorber sur les cellules MDCK suivies par l&#39;annoncedition d&#39;un milieu nutritif et d&#39;agarose. Au cours de l&#39;incubation, les cellules d&#39;origine infectées libèrent descendance virale qui s&#39;est propagée uniquement aux cellules voisines. L&#39;effet cytopathogène de l&#39;infection par le virus grippal produit une zone circulaire de cellules infectées appelé une plaque. Chaque plaque est sans doute formé après l&#39;infection d&#39;une cellule unique avec une seule particule de virus suivie par la réplication du virus. Le contraste entre les cellules vivantes et les plaques peuvent être améliorées par des colorants tels que le cristal violet. Un inconvénient majeur de cet essai est le manque de reproductibilité et de fortes disparités au sein des expériences. Un autre test utilisé pour déterminer le titre virus de la grippe est le dosage de l&#39;hémagglutination. Le présente protéine hémagglutinine sur la surface de la virus de la grippe se lie efficacement à N-acétylneuraminique l&#39;acide-les protéines contenant sur ​​mammifères et aviaires globules rouges 1. Cette interaction entre le virus de l&#39;influenza et les érythrocytes conduit à d&#39;agglutination sous la forme d&#39;un treillis. Le lEvel d&#39;agglutination est utilisée pour estimer le titre du virus de la grippe dans les éprouvettes. Test d&#39;agglutination érythrocytaire est utilisée uniquement pour déterminer le titrage d&#39;un virus connu et ne peut pas être utilisé à des fins d&#39;identification des souches. Depuis cet essai ne fait pas de distinction entre le live et les virus morts, il est difficile d&#39;obtenir un calcul précis de titres viraux. Actuelles des diagnostics cliniques d&#39;infections de la grippe sont basées sur des tests sérologiques, la réaction en chaîne par polymérase, l&#39;immunofluorescence directe et 1,6 spécimen de culture cellulaire. La nouvelle méthode décrite ici a aussi le potentiel clinique et de laboratoire de diagnostic. Grippe détection kits Directigen FLU-A. (BD Biosciences, San Jose, CA) et BinaxNOW (Binax, Inc, Scarborough, ME) test immunochromatographie utilisation pour détecter l&#39;antigène viral tel que nucléoprotéine 7 L&#39;utilisation de ces kits, la détection du virus peut être réalisé dans les 15 minutes, mais tous les échantillons négatifs doivent être en outre screened par le Procédé de culture cellulaire. Diverses études ont également rapporté une faible sensibilité de ces kits, en particulier, lorsque l&#39;infection était légère ou faible 8. Dans notre méthode, nous avons constamment de détecter aussi peu que 100 PFU de virus. Cela donne à penser notre technique est utile dans la détection du virus H1N1 dans des échantillons cliniques, même lorsque l&#39;infection est bénigne. Une méthode à base de fluorescence pour détecter les antigènes viraux ont été signalés, soit des échantillons où aspirat rhinopharyngé ont été analysés directement ou ont été ensemencés sur une monocouche de cellules sensibles à la multiplication du virus et les analyses subséquentes 9. Cependant, ces méthodes sont limitées à des fins de diagnostic et ne conviennent pas pour les calculs titre du virus. Q-PCR aide à identifier la présence de l&#39;ARN viral et de ne pas estimer l&#39;infectiosité des virus vivants. Par rapport à ces essais, le système de dosage IR à base de colorant aidera dans la recherche et le dénombrement titre viral dans les échantillons cliniques et de laboratoire. En cas de flambée de grippe, il estcritique pour diagnostiquer beaucoup d&#39;échantillons dans une période de temps courte. Notre méthode repose sur une plaque de 384 puits et d&#39;un scanner IR permet de numériser 6 plaques à la fois (&gt; 2.000 échantillons), offrant ainsi un plus grand avantage par rapport aux autres méthodes directes fluorescentes. Faisabilité d&#39;un traitement rapide de milliers d&#39;échantillons cliniques pourrait réduire la variabilité des essais, la durée de dosage et les coûts. L&#39;utilisation d&#39;un anticorps M2-spécifique offre l&#39;avantage d&#39;être indépendante des différences entre les souches dans les protéines H et N. La protéine M2-est relativement conservée dans la plupart des souches de la grippe infectant les humains. Si des anticorps spécifiques aux taches qui circulent sont combinés avec notre système de on peut mesurer à la fois le titre de virus et d&#39;identifier la souche. Cependant, depuis M2 est la cible pour les médicaments amantadine comme des mutants peuvent survenir qui pourraient changer le site de liaison pour l&#39;anticorps monoclonal utilisé ici. Ceci constitue une limitation potentielle de ce système chez les individus qui sont traités par ces médicaments. Multipledosages sont utilisés pour énumérer les titres de la grippe dans des échantillons d&#39;essai. Pour calculer le virus de titre, 50% de la dose infectieuse de culture tissulaire (DICT 50) et d&#39;œufs allantoïques fluide à base de tests sont largement utilisés 1,10. Toutefois, les exigences de plusieurs jours que ces méthodes soient moins fiables. En outre, dans ces méthodes des calculs basés sur le changement de 50% dans le nombre de plaques de fournir théoriques, mais pas exacte titrages viraux. Plaque formant des tests peuvent être effectués dans les 96 heures, mais, manque de reproductibilité est une préoccupation majeure dans les calculs de titre viral. La technique décrite ici présente a plusieurs avantages distincts. D&#39;abord, il s&#39;agit d&#39;une technique hautement reproductible avec des résultats cohérents. Deuxièmement, les calculs titre viral sont basées sur la quantification simple des intensités de fluorescence, qui sont comparées contre de définition des courbes standard. Troisièmement, deux ou plusieurs anticorps primaires peuvent être utilisés pour diagnostiquer de multiples sérotypes dans un échantillon donné. En outre, IR colorant anticorps conjugués ont minimal autofluorescence et ont été utilisés pour l&#39;imagerie des cellules 11. UV ou visuelle de rayonnement (300-600 nM) des résultats de l&#39;autofluorescence cellulaire élevée en raison de la présence de hautes quantique rendement fluorophores endogènes. Il s&#39;agit notamment des acides aminés aromatiques, les lipo-pigments, des nucléotides pyridiniques (NADPH), l&#39;élastine, le collagène et coenzymes flavines. Cette propriété intrinsèque des cellules, il est difficile d&#39;utiliser ces sources de rayonnement en tant que sondes pour quantifier l&#39;expression de protéines spécifiques. En revanche, le proche infrarouge colorants exciter et émettent entre 670-1000 nm. Beaucoup de molécules hôtes cellulaires et d&#39;hydrocarbures aromatiques polycycliques n&#39;excitent pas à cette longueur d&#39;onde et en raison de diffusion de la lumière réduite, émettre de la fluorescence de fond extrêmement faible. En outre, la fenêtre entre le fond et la détection spécifique est largement améliorée en raison d&#39;un coefficient d&#39;extinction élevé des fluorophores dans le proche infrarouge. Photostabilité, supérieure signal de-sur-bruit, est extrêmement pertinente dans la quantification des titres viraux. Utilisez des microflchambres uidic permettra d&#39;automatiser le processus de sélection grâce à des contrôles robotiques, et pourrait nous permettre de tester des échantillons cliniques hautement contagieuses en toute simplicité. Ainsi, l&#39;utilisation des colorants dans le proche infrarouge dans ces méthodes est idéal et très fiable d&#39;énumérer les titres viraux dans des échantillons de tissus.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sérum-albumine bovine </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> Virus PR8 </td><td></td><td></td><td> De Dr Thomas Moran M </td></tr><tr><td> De chèvre anti-souris IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 de dilution </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR scanner </td><td> LI-COR-biosciences </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 puits fond plat </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-puits fond plat </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> Du milieu DMEM </td><td> Invitrfibrinogène </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 anticorps </td><td></td><td></td><td> De Dr Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Obtenu par un autre MTA </td></tr></tbody></table>

méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Virus de la grippe est un agent pathogène respiratoire qui provoque une degré élevé de morbidité et de mortalité chaque année en plusieurs parties du monde. Par conséquent, le diagnostic précis de la souche infectante et rapide criblage à haut débit d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons cliniques est primordiale pour lutter contre la propagation des infections en cas de pandémie. Actuelles des diagnostics cliniques d&#39;infections de la grippe sont basées sur des tests sérologiques, la réaction en chaîne par polymérase, l&#39;immunofluorescence directe et de 1,2 spécimen de culture cellulaire. Nous rapportons ici le développement d&#39;une nouvelle technique de diagnostic utilisé pour détecter les virus de la grippe en direct. Nous avons utilisé les ressources humaines adaptée à la souris A/PR/8/34 (PR8, H1N1) de 3 à tester l&#39;efficacité de cette technique en utilisant des cellules MDCK 4. Cellules MDCK (10 4 ou 5 x 10 3 par puits) ont été cultivées dans 96 - ou de plaques de 384 puits, des infectées par le PR8 et de protéines virales ont été détectées utilisant des anticorps anti-M2 suivie par une IR de colorant-conjugué Secanticorps secondaire. M2 5 et l&#39;hémagglutinine 1 sont deux protéines marqueurs majeurs utilisés dans de nombreux différents tests de diagnostic. Embauche IR-dye-anticorps secondaires conjugués à minimiser l&#39;autofluorescence associée à d&#39;autres colorants fluorescents. L&#39;utilisation de l&#39;anticorps anti-M2 nous a permis d&#39;utiliser l&#39;intensité de fluorescence spécifique de l&#39;antigène comme une métrique directe de la quantité virale. Pour énumérer l&#39;intensité de fluorescence, nous avons utilisé le LI-COR Odyssey à base de scanner IR. Ce système utilise deux canaux à base de laser détections infrarouges pour identifier les fluorophores et de les différencier du bruit de fond. Le premier canal excite à 680 nm et émet à 700 nm pour aider à quantifier l&#39;arrière-plan. Le second canal détecte fluorophores que excitent à 780 nm et émettent à 800 nm. Numérisation de PR8-infectés cellules MDCK dans le scanner IR a indiqué une infection virale titre dépendant fluorescence brillante. Une corrélation positive de l&#39;intensité de fluorescence à titre de virus à partir de 10 2 -10 5 UFP pourrait être consistently observée. Positivité minimale détectable, mais toujours vu avec 10 2 -10 3 PFU PR8 titres viraux ont démontré la sensibilité élevée des colorants dans le proche infrarouge. Le rapport signal-bruit a été déterminée en comparant la maquette infectés ou isotype-traités des cellules MDCK. En utilisant les intensités de fluorescence à partir de 96 - ou des formats de plaques de 384 puits, nous avons construit des courbes de titrage standard. Dans ces calculs, la première variable est le titre viral tandis que le deuxième variable est l&#39;intensité de fluorescence. Par conséquent, nous avons utilisé la distribution exponentielle pour générer une courbe d&#39;ajustement afin de déterminer la relation polynomiale entre les titres viraux et des intensités de fluorescence. Collectivement, nous concluons que IR à base de colorant système de détection de protéines peut aider à diagnostiquer l&#39;infection des souches virales et précisément énumérer le titre des agents pathogènes infectieux.

Cette méthode décrit l&#39;utilisation de système d&#39;imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut &lt;volume de 10 ul de matériel d&#39;essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Le virus de l'influenza est un agent pathogène respiratoire qui cause chaque année un taux élevé de morbidité et de mortalité dans plusieurs régions du monde. Par conséquent, ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier efficacement les titres viraux de la grippe dans les voies respiratoires de souris infectées. Les souris sont d'abord inoculées par voie intranasale avec le virus de la grippe à des moments choisis après l'infection.Les M sont sacrifiés et le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) est recueilli. Ensuite, le liquide de LBA est utilisé pour infecter des cellules MDCK. Les cellules infectées peuvent alors être marquées en vue de détecter la présence de protéines virales à l'aide d'anticorps primaires spécifiques, suivis d'anticorps secondaires conjugués à l'infrarouge.Les signaux infrarouges sont lus à l'aide du scanner Lycor Odyssey, et le logiciel Odyssey peut être utilisé pour déterminer les titres viraux. À l'aide d'une courbe standard, une détermination quantitative des titres viraux peut être obtenue. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont la quantification précise des titres viraux, la reproductibilité et le faible volume nécessaire pour réaliser ce dosage.Les implications de cette technique peuvent être étendues au diagnostic et au traitement de diverses maladies virales respiratoires, car elle permet de quantifier les titres viraux dans des échantillons cliniques suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme la QPCR, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le nombre de copies virales. Lors de la mise en œuvre de cette technique, il est important de se rappeler de vérifier le virus témoin de contrôle de titre après ce développement.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la logique virale pour explorer la titration virale ou détecter par immunomarquage les protéines virales dans des échantillons cliniques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 17 heures. Elle consiste à infecter précisément des souris par voie intranasale avec 5 000 unités formant des plaques (PFU) du virus de la grippe PR8 dans 30 microlitres de PBS stérile, ou avec du PBS seul comme témoin négatif, pour la collecte de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL) à partir d'animaux euthanasiés. Tout d'abord, ouvrez la cavité thoracique et pratiquez une incision d'un centimètre parallèlement à la trachée à l’aide de fines ciseaux stériles afin de l’exposer.Réalisez une petite incision dans la trachée, perfusez la trachée avec 0,5 millilitre de PBS contenant 1 % de BSA et aspirez doucement le liquide de lavage. Conservez les liquides de LBA à moins 20 degrés Celsius afin de quantifier les titres viraux dans les liquides de lavage. Commencez par cultiver 5 millions de cellules MDCK dans 20 millilitres de RPMI complet dans un flacon T75 pendant la nuit à 37 degrés Celsius ; le jour suivant, récoltez les cellules et les semez dans une plaque optique noire à fond plat de 96 puits, à raison de 10 000 cellules par puits.Incuber ensuite la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius après l'incubation. Aspirer délicatement le surnageant et laver les cellules deux fois dans du DMEM complet mais sans sérum, contenant 0,2 % de BSA au lieu de FBS. Une fois les cellules lavées, ajouter 50 microlitres de liquide de lavage broncho-alvéolaire ou 50 microlitres d'une suspension contenant une concentration connue de virus par puits.Ensuite, ajouter 50 microlitres par puits de DMEM, un milieu contenant de la trypsine traitée au TPCK à 0,2 microgramme par millilitre, afin de favoriser l'attachement, l'entrée et la réplication virale. Incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre l'absorption du virus. Puis ajouter 100 microlitres de RPMI complet contenant du SFB à chaque puits et cultiver les cellules pendant la nuit pour permettre la propagation de l'infection après l'incubation nocturne.Lavez les cellules avec 100 microlitres de PBS contenant 1 % de BSA. Une fois les cellules lavées, ajoutez 100 microlitres par puits de paraformaldéhyde à 1 % et incubez les plaques pendant cinq minutes à température ambiante pour fixer les cellules. Lavez ensuite avec 100 microlitres par puits de PBS contenant 1 % de BSA et incubez les cellules pendant 30 minutes supplémentaires pour le blocage. Une fois les cellules bloquées, ajoutez 50 microlitres par puits d'anticorps primaire anti-viral M2 dilué au 1/1000, et incubez les plaques pendant une heure à température ambiante afin de marquer toute protéine virale présente. Après l'incubation, lavez les cellules trois fois dans du PBS contenant 1 % de BSA, puis incubez-les avec 100 microlitres par puits d'anticorps secondaire conjugué à un colorant infrarouge, dilué au 1/200, pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière. Une fois les cellules marquées, lavez-les trois fois comme précédemment.Ensuite, positionnez les plaques sur la plateforme de lecture en verre du scanner infrarouge Licor Odyssey. Sélectionnez le paramètre de plaque 96 puits sur le lecteur à l'aide du logiciel Licor Odyssey. Identifiez les puits témoins négatifs blancs, puis quantifiez la fluorescence provenant de toute la plaque.Utilisez l'outil de forme automatique pour dessiner la région d'intérêt ou ROI au centre d'un puits. Nous utiliserons la ROI provenant d'un témoin négatif afin de définir la valeur de fluorescence de base pour le test, puis introduisez les deux lignes de visée croisées opposées fournies par le logiciel Odyssey à l'intérieur de la ROI pour mesurer l'intensité de la fluorescence à travers le puits.Ensuite, analyser la plaque en utilisant le canal de 780 nanomètres pour la détection et 680 nanomètres comme longueur d'onde de référence. Une fois la commande de lecture activée, les intensités fluorescentes seront mesurées à des intervalles uniformes de la région d'intérêt (ROI). Puis les points de données recueillis seront intégrés.Un multiplicateur de l'écart type déterminera le niveau de signal par rapport à la ligne de base qui sera inclus dans la région d'intérêt. Veillez à sélectionner l'option d'intensité intégrée pour les calculs, car celle-ci représente le volume net des pixels pour des zones définies, indépendamment de leur taille. La fluorescence de fond sera quantifiée à partir des témoins non infectés et servira à estimer l'intensité intégrée dans les puits test. La fluorescence infrarouge provenant de puits dupliqués contenant des dilutions sérielles de virus titrés est utilisée pour établir une courbe standard.La courbe standard peut ensuite être utilisée pour déterminer les titres du liquide de lavage broncho-alvéolaire provenant de souris infectées. Dans cette expérience, une augmentation significative de la charge virale a été observée aux jours deux et quatre. Le virus a été éliminé dix jours après l'infection, comme indiqué ici.Les titres viraux mesurés à l’aide de cet essai sont fortement corrélés à la perte de poids chez la souris après infection. Cette technique peut également être appliquée à des échantillons humains. On voit ici une quantification du virus H1N1 provenant d’un prélèvement nasal humain.La limite de détection ici est de 10 à la puissance 3 CIDT, ou dose infectieuse pour culture tissulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous avez également une bonne compréhension de la manière d'estimer la titration du virus de la grippe à l'aide d'un dosage basé sur un colorant infrarouge. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car l'utilisation de l'imagerie Corp peut s'avérer difficile, et cela permettra de simplifier et d'illustrer nos méthodes de quantification des titres viraux dans une plaque de 96 ou 384 puits.Et enfin, n'oubliez pas que le travail avec des virus peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Immunologie et infection

Sauvetage des virus grippaux A partir de l'ADN plasmidique est une technique de base et essentiels expérimentale qui permet aux chercheurs de la grippe pour générer des virus recombinants pour étudier les multiples aspects de la biologie du virus de la grippe, et pour être utilisés comme vecteurs potentiels ou de vaccins.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est présentée comme une alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence pour les microarrays. Basé sur la photopolymérisation, ampliPHOX produit des taches polymère solide visible à l'œil nu dans quelques minutes. Les résultats sont ensuite imagé et automatiquement interprété avec un logiciel simple mais puissant.

ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d&#39;ADN pour la grippe

Cette étude décrit le diagnostic de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages en utilisant un portable RT-PCR système. La méthode tire parti des réactifs lyophilisés à l'écran les oiseaux sauvages dans un cadre non-laboratoire, typique d'un scénario d'épidémie. L'utilisation d'outils moléculaires fournit des solutions de rechange précise et sensible pour le diagnostic rapide.

Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L&#39;utilisation d&#39;un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine

Dans cette vidéo, nous abordons la corrélation entre le CIT50 et la multiplicité des infections virales. Les cellules infectées par le virus présentent des effets cytopathiques, provoquant leur mort et leur détachement de la microélectrode d’or, ce qui réduit l’impédance.

Dosage cellulaire basé sur l’impédance pour mesurer la multiplicité de l’infection du virus de la grippe

La vidéo montre un test de quantification des virus grippaux A et B. Ce test utilise l’amplification des endonucléases par entaille avec des amorces spécifiques à la grippe et la détection de cibles à l’aide de sondes de balise moléculaire.

Un test moléculaire pour quantifier les virus de la grippe A et B

Une puce microfluidique intégré thermoplastique a été mis au point pour une utilisation comme diagnostic moléculaire. La puce effectue l'extraction d'acide nucléique, la transcriptase inverse et la PCR. Des procédés de fabrication et le fonctionnement de la puce sont décrits.

Fabrication puce microfluidique et méthode pour la détection de la grippe

À l’aide d’une stratégie de microréseau de glycanes imprimée, un test conventionnel sur plaque à 96 puits a été miniaturisé pour l’analyse de l’avidité de l’hémagglutinine du virus de la grippe A et de la spécificité des récepteurs contenant de l’acide sialique.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Nous décrivons un essai rapide, à base moléculaire de la grippe A et B. L'essai détecte la grippe chaque cible dans les 15 minutes en utilisant une amplification isotherme avec des amorces spécifiques de la grippe suivie par la détection de cibles avec des sondes de balises moléculaires. Le dosage et la grippe A B est convivial et nécessaire minimes mains sur le temps d'effectuer.

Rapid Détection moléculaire et différenciation des virus grippaux A et B

test à haut débit d'agents pathogènes à base d'ADN et d'ARN par PCR à l'échelle nanométrique est décrit en utilisant un chien syndromique et le panneau PCR respiratoire équine.

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Cette étude décrit un   à base d'imagerie-dosage micro-neutralisation pour analyser les relations antigéniques entre les virus. Le protocole utilise un scanner à plat et comporte quatre étapes, dont le titrage, titrage quantification, la neutralisation et la neutralisation quantification. Le test fonctionne bien avec un courant circulant de la grippe A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B.

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

Nous décrivons l'utilisation d'un test d'inhibition de la neuraminidase par fluorescence phénotypiques pour évaluer la sensibilité des virus grippaux A et B à la classe des inhibiteurs de la neuraminidase de Antiviraux.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

Découvrez une méthode de détection à haut débit pour quantifier les titres viraux de grippe H1N1 dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire de souris infectées. Cette technique utilise un système d'imagerie à infrarouge offrant une sensibilité élevée avec seulement 10 µl d'échantillon.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

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