Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

L'objectif général de cette procédure est de quantifier efficacement les titres viraux de la grippe dans les voies respiratoires de souris infectées. Les souris sont d'abord inoculées par voie intranasale avec le virus de la grippe à des moments choisis après l'infection.

Les M sont sacrifiés et le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) est recueilli. Ensuite, le liquide de LBA est utilisé pour infecter des cellules MDCK. Les cellules infectées peuvent alors être marquées en vue de détecter la présence de protéines virales à l'aide d'anticorps primaires spécifiques, suivis d'anticorps secondaires conjugués à l'infrarouge.

Les signaux infrarouges sont lus à l'aide du scanner Lycor Odyssey, et le logiciel Odyssey peut être utilisé pour déterminer les titres viraux. À l'aide d'une courbe standard, une détermination quantitative des titres viraux peut être obtenue. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont la quantification précise des titres viraux, la reproductibilité et le faible volume nécessaire pour réaliser ce dosage.

Les implications de cette technique peuvent être étendues au diagnostic et au traitement de diverses maladies virales respiratoires, car elle permet de quantifier les titres viraux dans des échantillons cliniques suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme la QPCR, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le nombre de copies virales. Lors de la mise en œuvre de cette technique, il est important de se rappeler de vérifier le virus témoin de contrôle de titre après ce développement.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la logique virale pour explorer la titration virale ou détecter par immunomarquage les protéines virales dans des échantillons cliniques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 17 heures. Elle consiste à infecter précisément des souris par voie intranasale avec 5 000 unités formant des plaques (PFU) du virus de la grippe PR8 dans 30 microlitres de PBS stérile, ou avec du PBS seul comme témoin négatif, pour la collecte de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL) à partir d'animaux euthanasiés. Tout d'abord, ouvrez la cavité thoracique et pratiquez une incision d'un centimètre parallèlement à la trachée à l’aide de fines ciseaux stériles afin de l’exposer.

Réalisez une petite incision dans la trachée, perfusez la trachée avec 0,5 millilitre de PBS contenant 1 % de BSA et aspirez doucement le liquide de lavage. Conservez les liquides de LBA à moins 20 degrés Celsius afin de quantifier les titres viraux dans les liquides de lavage. Commencez par cultiver 5 millions de cellules MDCK dans 20 millilitres de RPMI complet dans un flacon T75 pendant la nuit à 37 degrés Celsius ; le jour suivant, récoltez les cellules et les semez dans une plaque optique noire à fond plat de 96 puits, à raison de 10 000 cellules par puits.

Incuber ensuite la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius après l'incubation. Aspirer délicatement le surnageant et laver les cellules deux fois dans du DMEM complet mais sans sérum, contenant 0,2 % de BSA au lieu de FBS. Une fois les cellules lavées, ajouter 50 microlitres de liquide de lavage broncho-alvéolaire ou 50 microlitres d'une suspension contenant une concentration connue de virus par puits.

Ensuite, ajouter 50 microlitres par puits de DMEM, un milieu contenant de la trypsine traitée au TPCK à 0,2 microgramme par millilitre, afin de favoriser l'attachement, l'entrée et la réplication virale. Incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre l'absorption du virus. Puis ajouter 100 microlitres de RPMI complet contenant du SFB à chaque puits et cultiver les cellules pendant la nuit pour permettre la propagation de l'infection après l'incubation nocturne.

Lavez les cellules avec 100 microlitres de PBS contenant 1 % de BSA. Une fois les cellules lavées, ajoutez 100 microlitres par puits de paraformaldéhyde à 1 % et incubez les plaques pendant cinq minutes à température ambiante pour fixer les cellules. Lavez ensuite avec 100 microlitres par puits de PBS contenant 1 % de BSA et incubez les cellules pendant 30 minutes supplémentaires pour le blocage. Une fois les cellules bloquées, ajoutez 50 microlitres par puits d'anticorps primaire anti-viral M2 dilué au 1/1000, et incubez les plaques pendant une heure à température ambiante afin de marquer toute protéine virale présente. Après l'incubation, lavez les cellules trois fois dans du PBS contenant 1 % de BSA, puis incubez-les avec 100 microlitres par puits d'anticorps secondaire conjugué à un colorant infrarouge, dilué au 1/200, pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière. Une fois les cellules marquées, lavez-les trois fois comme précédemment.

Ensuite, positionnez les plaques sur la plateforme de lecture en verre du scanner infrarouge Licor Odyssey. Sélectionnez le paramètre de plaque 96 puits sur le lecteur à l'aide du logiciel Licor Odyssey. Identifiez les puits témoins négatifs blancs, puis quantifiez la fluorescence provenant de toute la plaque.

Utilisez l'outil de forme automatique pour dessiner la région d'intérêt ou ROI au centre d'un puits. Nous utiliserons la ROI provenant d'un témoin négatif afin de définir la valeur de fluorescence de base pour le test, puis introduisez les deux lignes de visée croisées opposées fournies par le logiciel Odyssey à l'intérieur de la ROI pour mesurer l'intensité de la fluorescence à travers le puits.

Ensuite, analyser la plaque en utilisant le canal de 780 nanomètres pour la détection et 680 nanomètres comme longueur d'onde de référence. Une fois la commande de lecture activée, les intensités fluorescentes seront mesurées à des intervalles uniformes de la région d'intérêt (ROI). Puis les points de données recueillis seront intégrés.

Un multiplicateur de l'écart type déterminera le niveau de signal par rapport à la ligne de base qui sera inclus dans la région d'intérêt. Veillez à sélectionner l'option d'intensité intégrée pour les calculs, car celle-ci représente le volume net des pixels pour des zones définies, indépendamment de leur taille. La fluorescence de fond sera quantifiée à partir des témoins non infectés et servira à estimer l'intensité intégrée dans les puits test. La fluorescence infrarouge provenant de puits dupliqués contenant des dilutions sérielles de virus titrés est utilisée pour établir une courbe standard.

La courbe standard peut ensuite être utilisée pour déterminer les titres du liquide de lavage broncho-alvéolaire provenant de souris infectées. Dans cette expérience, une augmentation significative de la charge virale a été observée aux jours deux et quatre. Le virus a été éliminé dix jours après l'infection, comme indiqué ici.

Les titres viraux mesurés à l’aide de cet essai sont fortement corrélés à la perte de poids chez la souris après infection. Cette technique peut également être appliquée à des échantillons humains. On voit ici une quantification du virus H1N1 provenant d’un prélèvement nasal humain.

La limite de détection ici est de 10 à la puissance 3 CIDT, ou dose infectieuse pour culture tissulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous avez également une bonne compréhension de la manière d'estimer la titration du virus de la grippe à l'aide d'un dosage basé sur un colorant infrarouge. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car l'utilisation de l'imagerie Corp peut s'avérer difficile, et cela permettra de simplifier et d'illustrer nos méthodes de quantification des titres viraux dans une plaque de 96 ou 384 puits.

Et enfin, n'oubliez pas que le travail avec des virus peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.