De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar de manera eficiente los títulos virales de la influenza en las vías respiratorias de ratones infectados. Los ratones se inoculan por vía intranasal con el virus de la influenza en el momento seleccionado. Puntos después de la infección.

Se sacrifican los M y se recoge el lavado broncoalveolar o el líquido BAL. A continuación, el líquido BAL se utiliza para infectar las células MDCK. A continuación, las células infectadas se pueden teñir para detectar la presencia de proteínas virales utilizando anticuerpos primarios específicos, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados por infrarrojos.

Las señales infrarrojas se leen con el escáner Lycor Odyssey y el software Odyssey se puede utilizar para determinar los títulos virales. Utilizando una curva estándar, se puede obtener la determinación cuantitativa de los títulos virales. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes es la cuantificación precisa de los títulos virales, la reproducibilidad y el pequeño volumen que se requiere para realizar este ensayo.

Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades virales respiratorias, ya que se puede utilizar para cuantificar títulos virales en muestras clínicas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la QPCR, para responder a preguntas adicionales, como el número de copias virales. Al intentar esta técnica, es importante recordar verificar el título del virus de control estándar después de este desarrollo.

Esta técnica abre el camino para que el investigador en el campo de la lógica viral explore la proteína viral de titulación o tinción de torsión del virus en muestras clínicas. Una vez dominada esta técnica se puede realizar en 17 horas. Infectó ratones por vía intranasal con 5.000 unidades de plataforma o PFU del virus de la influenza PR ocho en 30 microlitros de PBS estéril o con PBS solo como control negativo para la recolección de líquido BAL de animales sacrificados primero, corte que la cavidad torácica se abra y haga una incisión de un centímetro paralela a la tráquea para exponerla con tijeras finas estériles.

Haga una pequeña incisión en la tráquea, infunda la tráquea con 0,5 mililitros de 1% de BSA que contiene PBS y aspire suavemente el líquido de lavado. Almacene los fluidos BAL a menos 20 grados centígrados para cuantificar los títulos virales en los fluidos de lavado. Primero cultive 5 millones de células MDCK en 20 mililitros de RPMI completo en un matraz T 75 durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente, coseche las células y las coloque en una placa negra óptica de 96 pocillos de fondo plano a 10.000 células por pocillo.

Luego incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados después de la incubación. Aspire suavemente el sobrenadante y lave las células dos veces con DMEM completo pero sin suero que contenga 0,2% de BSA en lugar de FBS. Una vez lavadas las células, se añaden 50 microlitros de líquido BAL o 50 microlitros de una suspensión que contenga una concentración conocida de virus por pocillo.

A continuación, añada 50 microlitros por pocillo de DMEM, medio que contiene tripsina tratada con TPCK a 0,2 microgramos por mililitro para mejorar la adhesión, entrada y replicación viral. Incubar las células durante una hora a 37 grados centígrados para permitir que el virus se absorba. A continuación, añada 100 microlitros de FBS que contenga RPMI completo a cada pocillo, cultive las células durante la noche para permitir que la infección se propague después de la incubación nocturna.

Lavar las células con 100 microlitros de 1%B-S-A-P-B-S. Una vez lavadas las células, añadir 100 microlitros por pocillo de 1%paraformaldehído e incubar las placas durante cinco minutos a temperatura ambiente para fijar las células. A continuación, lavar con 100 microlitros por pocillo de 1%B-S-A-P-B-S e incubar las células durante 30 minutos más para bloquearlas. Una vez que las células hayan sido bloqueadas, agregue 50 microlitros por pocillo de anticuerpo antiviral primario M dos diluidos a uno a 1000, e incube las placas durante una hora a temperatura ambiente para teñir cualquier proteína viral presente después de la incubación, lave las células tres veces en 1% B-S-A-P-B-S e incube con 100 microlitros por pocillo de anticuerpo secundario conjugado con colorante infrarrojo a una dilución de uno a 200 durante una hora a temperatura ambiente En la oscuridad, una vez que las células estén manchadas, lávelas tres veces como antes.

A continuación, coloque las placas en la plataforma de cristal de lectura del escáner de infrarrojos Licor Odyssey. Seleccione la configuración de placa de 96 pocillos en el lector utilizando el software Licor Odyssey. Identifique los pocillos de control negativo en blanco, luego cuantifique la fluorescencia de toda la placa.

Utilice la herramienta de forma automática para dibujar la región de interés o el ROI en medio de una prueba. Bien utilizar el ROI de un control negativo. Bueno, para establecer el valor de fluorescencia de referencia para el ensayo, introduzca las dos cruces opuestas proporcionadas por el software Odyssey dentro del ROI para medir la intensidad de la fluorescencia en todo el pocillo.

A continuación, escanee la placa utilizando el canal de 780 nanómetros para la detección y 680 nanómetros como longitud de onda de referencia. Una vez activado el comando de lectura, se medirán las intensidades fluorescentes a intervalos uniformes del ROI. Y luego se integraron los puntos de datos recopilados.

Un multiplicador de desviación estándar determinará el nivel de señal sobre la línea de base que se incluye en el ROI; asegúrese de seleccionar la opción de intensidad integrada para los cálculos, ya que representa el volumen neto de píxeles para áreas definidas, independientemente del tamaño. La fluorescencia de fondo se cuantificará a partir de los controles infectados simulados y se utilizará para estimar la intensidad integrada en los pozos de prueba. La fluorescencia infrarroja de pocillos duplicados que contienen diluciones en serie de virus titulados se utiliza para construir una curva estándar.

A continuación, se puede utilizar la curva estándar para determinar los títulos del líquido BAL de ratones infectados. En este experimento, se observó un aumento significativo de la carga viral a los dos y cuatro días. El virus posterior a la infección se eliminó el día 10, como se muestra aquí.

Los títulos virales medidos con este ensayo se correlacionan bien con la pérdida de peso en ratones después de la infección. Esta técnica también se puede aplicar a muestras humanas. Aquí se muestra una cuantificación del virus H uno N one a partir de un hisopo nasal humano.

El límite de detección aquí es de 10 a la tercera dosis infecciosa de TCID o cultivo de tejidos. Después de ver este video, también comprende bien cómo estimar el título del virus de la influenza mediante un ensayo infrarrojo basado en troqueles. La demostración visual de esta técnica es fundamental porque el uso del generador de imágenes corp puede ser difícil y esto ayudará a simplificar y demostrar nuestros métodos para cuantificar títulos virales en una placa de 96 o 384 pocillos.

Y, por último, no olvide que trabajar con virus puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precursores como el equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento.