De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar de manera eficiente las titulaciones virales de influenza en las vías respiratorias de ratones infectados. Primero, los ratones se inoculan por vía intranasal con el virus de la influenza en momentos seleccionados tras la infección.

Se sacrifican los M y se recoge el lavado broncoalveolar o líquido BAL. A continuación, el líquido BAL se utiliza para infectar células MDCK. Las células infectadas pueden teñirse para detectar la presencia de proteínas virales utilizando anticuerpos primarios específicos, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con infrarrojo.

Las señales infrarrojas se leen utilizando el escáner Lycor Odyssey y el software Odyssey puede utilizarse para determinar los títulos virales. Mediante una curva estándar, se puede obtener la determinación cuantitativa de los títulos virales. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes son la cuantificación precisa de los títulos virales, la reproducibilidad y el pequeño volumen necesario para realizar este ensayo.

Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades virales respiratorias, ya que puede utilizarse para cuantificar títulos virales en muestras clínicas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la QPCR, para responder preguntas adicionales, tales como el número de copias virales. Al intentar esta técnica, es importante recordar verificar el virus control del estándar de título tras este desarrollo.

Esta técnica allana el camino para que el investigador en el campo de la lógica viral explore la titulación viral o la tinción de proteínas virales en muestras clínicas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 17 horas. Se realiza infectando con precisión ratones por vía intranasal con 5.000 unidades formadoras de placas o PFU del virus de la influenza PR8 en 30 microlitros de PBS estéril o con PBS solo como control negativo para la recolección de líquido de lavado broncoalveolar de animales sacrificados; primero, se abre la cavidad torácica y se realiza una incisión de un centímetro paralela a la tráquea para exponerla con tijeras estériles finas.

Realice una pequeña incisión en la tráquea, infunda la tráquea con 0,5 mililitros de PBS que contenga BSA al 1 % y aspire suavemente el líquido de lavado. Almacene los líquidos de BAL a menos 20 grados centígrados para cuantificar los títulos virales en los líquidos de lavado. Primero, cultive 5 millones de células MDCK en 20 mililitros de RPMI completo en un matraz T75 durante la noche a 37 grados centígrados; al día siguiente, recolecte las células y siembrelas en una placa negra de 96 pocillos con fondo óptico plano a 10.000 células por pocillo.

Luego, incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados tras la incubación. Aspirar suavemente el sobrenadante y lavar las células dos veces con DMEM completo pero sin suero, que contenga 0,2 % de BSA en lugar de FBS. Una vez lavadas las células, añadir 50 microlitros de líquido BAL o 50 microlitros de una suspensión que contenga una concentración conocida de virus por pocillo.

Luego, agregue 50 microlitros por pocillo de DMEM, medio que contiene tripsina tratada con TPCK a 0,2 microgramos por mililitro, para mejorar la adhesión, entrada y replicación viral. Incube las células durante una hora a 37 grados centígrados para permitir la absorción del virus. A continuación, agregue 100 microlitros de RPMI completo que contenga SFB a cada pocillo y cultive las células durante la noche para permitir la propagación de la infección tras la incubación nocturna.

Lave las células con 100 microlitros de PBS con 1 % de BSA. Una vez lavadas las células, añada 100 microlitros por pocillo de paraformaldehído al 1 % e incube las placas durante cinco minutos a temperatura ambiente para fijar las células. A continuación, lave con 100 microlitros por pocillo de PBS con 1 % de BSA e incube las células durante 30 minutos adicionales para bloquear. Una vez bloqueadas las células, añada 50 microlitros por pocillo del anticuerpo primario antiviral M2 diluido 1:1000 e incube las placas durante una hora a temperatura ambiente para teñir cualquier proteína viral presente. Tras la incubación, lave las células tres veces con PBS con 1 % de BSA e incúbelas con 100 microlitros por pocillo de anticuerpo secundario conjugado con colorante infrarrojo, diluido 1:200, durante una hora a temperatura ambiente y en la oscuridad. Una vez teñidas las células, lávelas tres veces como antes.

Luego coloque las placas sobre la plataforma de lectura del escáner infrarrojo Licor Odyssey. Seleccione la configuración de placa de 96 pocillos en el lector utilizando el software Licor Odyssey. Identifique los pocillos de control negativo en blanco, luego cuantifique la fluorescencia de toda la placa.

Utilice la herramienta de forma automática para dibujar la región de interés o ROI en el centro de una prueba. Utilizaremos el ROI de un control negativo para establecer el valor de fluorescencia basal del ensayo, y luego introduciremos los dos hilos de mira opuestos proporcionados por el software Odyssey dentro del ROI para medir la intensidad de la fluorescencia a través del pocillo.

A continuación, escanee la placa utilizando el canal de 780 nanómetros para la detección y 680 nanómetros como longitud de onda de referencia. Una vez que se haya activado el comando de lectura, se medirán las intensidades fluorescentes a intervalos uniformes de la ROI. Luego, se integrarán los puntos de datos recopilados.

Un multiplicador de la desviación estándar determinará el nivel de señal por encima de la línea base que se incluirá en la región de interés; asegúrese de seleccionar la opción de intensidad integrada para los cálculos, ya que representa el volumen neto de píxeles para áreas definidas independientemente del tamaño. La fluorescencia de fondo se cuantificará a partir de los controles no infectados y se utilizará para estimar la intensidad integrada en los pocillos de prueba. La fluorescencia infrarroja de pocillos duplicados que contienen diluciones en serie de virus titulados se utiliza para construir una curva estándar.

La curva estándar puede utilizarse entonces para determinar los títulos del líquido de lavado broncoalveolar de ratones infectados. En este experimento, se observó un aumento significativo en la carga viral en los días dos y cuatro. El virus se eliminó tras la infección para el día 10, como se muestra aquí.

Los títulos virales medidos utilizando este ensayo se correlacionan bien con la pérdida de peso en ratones tras la infección. Esta técnica también puede aplicarse a muestras humanas. Aquí se muestra una cuantificación del virus H one N one a partir de un hisopo nasal humano.

El límite de detección aquí es de 10 a la tercera TCID, o dosis infectiva para cultivo de tejidos. Después de ver este video, también tendrá un buen entendimiento de cómo estimar la titulación del virus de la influenza utilizando un ensayo basado en tinción por infrarrojos. La demostración visual de esta técnica es fundamental porque el uso del lector de imágenes puede ser difícil, y esto ayudará a simplificar y demostrar nuestros métodos para cuantificar títulos virales en una placa de 96 o 384 pocillos.

Y finalmente, no olvide que trabajar con virus puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el equipo de protección personal al realizar este procedimiento.