인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 절차의 전반적인 목표는 감염된 마우스의 기도에서 인플루엔자 바이러스 역가를 효율적으로 정량화하는 것입니다. 마우스는 먼저 선택한 시간에 인플루엔자 바이러스를 비강 내 접종합니다. 감염 후 포인트.

M을 희생하고 기관지폐포 세척 또는 BAL 액체를 수집합니다. 다음으로, BAL 액체는 MDCK 세포를 감염시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 감염된 세포를 특정 1차 항체를 사용하여 바이러스 단백질의 존재 여부를 염색한 다음 적외선 접합 2차 항체를 염색할 수 있습니다.

적외선 신호는 Lycor Odyssey 스캐너를 사용하여 판독되며 Odyssey 소프트웨어를 사용하여 바이러스 역가를 측정할 수 있습니다. 표준 곡선을 사용하여 바이러스 역가의 정량적 측정을 얻을 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기법의 주요 장점은 바이러스 역가의 정확한 정량화, 재현성 및 이 분석을 수행하는 데 필요한 소량입니다.

이 기술의 의미는 이 절차에 따라 임상 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하는 데 사용할 수 있기 때문에 다양한 호흡기 바이러스 질환의 진단 및 치료로 확장될 수 있습니다. 바이러스 복제 수와 같은 추가 질문에 답하기 위해 QPCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 시도하는 동안 이 개발 후 역가 표준 제어 바이러스를 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 바이러스 로직 분야의 연구자가 임상 샘플에서 바이러스 역가 또는 트위스트 염색 바이러스 단백질을 탐색할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 기술을 마스터하면 17시간 안에 수행할 수 있습니다. 30 마이크로 리터의 멸균 PBS에 PR 8 인플루엔자 바이러스의 5, 000 플랫폼 유닛 또는 PFU로 마우스를 비강 내 감염 시키거나 안락사 된 동물의 BAL 체액 채취에 대한 음성 대조군으로 PBS 단독으로 먼저 흉강을 열고 기관과 평행하게 1cm 절개를 만들어 미세한 멸균 가위로 노출시킵니다.

기관을 작게 절개하고 PBS가 함유된 0.5ml의 1%BSA를 기관에 주입하고 세척액을 부드럽게 흡인합니다. BAL 유체를 섭씨 음의 20도에서 보관하여 세척액의 바이러스 역가를 정량화합니다. 첫째로 배양 T 75 플라스크에 있는 완전한 RPMI의 20 밀리리터에 있는 5백만개의 MDCK 세포를 다음날 37 °C에서 밤새 배양하고, 세포를 가을걷고 10에 광학적인 편평한 바닥 검정 96 우물 판에서 그(것)들을 도금하십시오, 우물 당 000의 세포

그런 다음 배양 후 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 상층액을 부드럽게 흡인하고 FBS 대신 0.2%BSA를 함유한 혈청이 없는 DMEM을 완전히 두 번 세척합니다. 세포가 세척되면 웰당 알려진 농도의 바이러스를 포함하는 50마이크로리터의 BAL 유체 또는 50마이크로리터의 현탁액을 추가합니다.

그런 다음 TPCK 처리된 트립신을 밀리리터당 0.2마이크로그램으로 함유한 배지인 DMEM당 50마이크로리터를 추가하여 바이러스 부착, 진입 및 복제를 향상시킵니다. 바이러스가 흡수할 수 있도록 섭씨 37도에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 완전한 RPMI가 포함된 FBS 100마이크로리터를 각 웰 배양에 하룻밤 동안 세포를 배양하여 하룻밤 배양 후 감염이 전파될 수 있도록 합니다.

100마이크로리터의 1%B-S-A-P-B-S로 세포를 세척합니다. 세포가 세척되면 웰당 1%파라 포름알데히드 100마이크로리터를 추가하고 실온에서 5분 동안 플레이트를 배양하여 세포를 고정한 다음 1%B-S-A-P-B-S 웰당 100마이크로리터로 세척하고 차단을 위해 세포를 추가로 30분 동안 배양합니다. 세포가 차단되면 1 - 1000으로 희석된 1차 항바이러스 M 2 항체 웰당 50마이크로리터를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양하여 배양 후 존재하는 바이러스 단백질을 염색하고 세포를 1%B-S-A-P-B-S에서 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 1 - 200 희석으로 1 - 200 희석으로 웰당 100마이크로리터의 적외선 염료 접합 2차 항체로 배양합니다. 어둠 속에서 세포가 염색되면 이전과 같이 세 번 씻으십시오.

그런 다음 Licor Odyssey 적외선 스캐너의 판독 유리 플랫폼에 플레이트를 놓습니다. Licor Odyssey 소프트웨어를 사용하여 리더에서 96웰 플레이트 설정을 선택합니다. 빈 negative control well을 식별한 다음 전체 플레이트의 형광을 정량화합니다.

자동 형상 도구를 사용하여 테스트 중간에 관심 영역 또는 ROI를 그릴 수 있습니다. 음의 대조군에서 ROI를 잘 사용하십시오. 음, 분석에 대한 기준선 형광 값을 설정하려면 ROI 내에서 Odyssey 소프트웨어가 제공하는 두 개의 반대 십자선을 도입하여 웰 전체의 형광 강도를 측정합니다.

다음으로, 검출을 위해 780나노미터 채널을 사용하고 680나노미터를 기준 파장으로 사용하여 플레이트를 스캔합니다. read 명령이 활성화되면 ROI의 균일한 간격으로 형광 강도가 측정됩니다. 그런 다음 수집된 데이터 포인트가 통합되었습니다.

표준 편차 승수는 ROI에 포함된 기준선을 통한 신호 수준을 결정하며, 크기와 독립적으로 정의된 영역에 대한 순 픽셀 볼륨을 나타내기 때문에 계산을 위해 통합 강도 옵션을 선택해야 합니다. 배경 형광은 모의 감염 대조군에서 정량화되며 테스트 웰의 통합 강도를 추정하는 데 사용됩니다. 적정 바이러스의 연속 희석액을 포함하는 중복 웰의 적외선 형광은 표준 곡선을 구성하는 데 사용됩니다.

그런 다음 표준 곡선을 사용하여 감염된 마우스의 BAL 유체 역가를 측정할 수 있습니다. 이 실험에서는 2일차와 4일차에 바이러스 부하의 현저한 증가가 관찰되었습니다. 감염 후 바이러스는 여기에 표시된 대로 10일째까지 제거되었습니다.

이 분석을 사용하여 측정된 바이러스 역가는 감염 후 생쥐의 체중 감소와 상관관계가 있습니다. 이 기술은 인간 샘플에도 적용할 수 있습니다. 다음은 인간 비강 면봉에서 채취한 H one N one 바이러스의 정량화입니다.

여기서 검출 한계는 10에서 세 번째 TCID 또는 조직 배양 감염 선량입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 적외선 다이 기반 분석을 사용하여 인플루엔자 바이러스 역가를 추정하는 방법도 잘 이해하게 되었습니다. corp imager를 사용하는 것이 어려울 수 있기 때문에 이 기술을 시각적으로 시연하는 것이 중요하며, 이는 96 또는 384 웰 플레이트에서 바이러스 역가를 정량화하는 방법을 단순화하고 시연하는 데 도움이 됩니다.

마지막으로, 바이러스로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비와 같은 전구체를 복용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.