Name: 인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 학습하세요 인플루엔자 바이러스의 높은 처리량 검출 방법을 적외선 염료 기반 이미징 시스템을 사용하여 감염된 마우스의 기관지폐포 세척액에서 H1N1을 정량화하는 기법입니다. 이 방법은 높은 감도와 재현성을 제공합니다.

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이 작품은 부분 NIH 교부금 R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (SM까지)에서 지원됩니다. 우리는 원고의 비판적 검토, 논의와 기술적 도움 티나 히틀러를 저희 연구실 구성원 감사드립니다. 우리는 바이러스 문화와 PCR을위한 데이비드 비나, 밀워키 보건국 실험실을 감사드립니다.

<ol><li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+%28PR8%29+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li>
<li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+%28H5N1%29+viruses+using+a+pyrosequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Directigen+flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li>
<li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li>
<li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR%3A+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+%28FLU+OIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+into+the+infrared%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li>
<li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

동남 아시아에서 조류 독감과 돼지 독감 유행병의 세계적 공포의 최근 전염병 발생은 공중 보건과 안전에 대한 커다란 우려를 부과. 중요한 초점은 인플루엔자 바이러스의 기존 및 새로운 변종을위한 백신을 발전 전념하고있다. 정확한 감지하고 정확한 바이러스 titer의 계산을위한 신속한 높은 처리량 기술의 가용성은 대단히 치료를 향상됩니다. 바이러스 titer를 계산하기 위해 사용된 가장 일반적으로 사용되는 기법은 플라크 형성과 독감 hemagglutination의 assays를 포함합니다. 플라크 형성 검정 처음으로 박테리오 파지 titers을 추정하기 위해 개발되었으며, 동물의 바이러스성 titers에게 4 계산할 Renato Dulbecco에 의해 채택되었습니다. 이러한 분석을 수행하려면 6 - 잘 접시에 인플루엔자 주식이나 BAL 유체와 같은 동물 표본의 10 배 dilutions이 준비되며 0.1 ML aliquots는 MDCK 세포 단일층에 주사한다. 바이러스는 광고 뒤에 MDCK 세포에 adsorb 할 수 있습니다영양 매체와 아가로 오스의 dition. 배양하는 동안, 원래 감염된 세포는 이웃 세포에게 전염 바이러스 자손을 풀어주고있다. 독감 바이러스 감염의 cytopathogenic 효과 상패 불리는 감염된 세포의 원형 영역을 생산하고 있습니다. 각 플라크는 아마도 바이러스의 복제를 다음 단일 바이러스 입자와 단일 세포의 감염 후에 형성된다. 살아있는 세포와 plaques 사이의 대비 같은 크리스탈 바이올렛 등 염료에 의해 향상될 수 있습니다. 이 분석의 주요 단점은 재현성과 실험 사이 거대한 변화의 부족이다. 인플루엔자 바이러스 titer를 결정하는 데 사용되는 또 다른 분석은 hemagglutination 분석이다. 인플루엔자 바이러스의 표면에 적혈구응집소 단백질 선물 효율적으로 포유류와 조류 적혈구 1 N-acetylneuraminic 초산 함유 단백질에 바인딩합니다. 인플루엔자 바이러스와 적혈구 간의 이러한 상호 작용은 격자의 형태로 응집이 생깁니다. 리터응집의 거시기는 테스트 표본에서 인플루엔자 바이러스의 titer를 추정하는 데 사용됩니다. 적혈구 응집 분석은 알려진 바이러스의 적정을 결정하기 위해서만 사용되며, 스트레인 식별 목적으로 사용할 수 없습니다. 이 분석은 실제와 죽은 바이러스를 구분하지 않기 때문에, 그것은 바이러스 titers의 정확한 계산을 얻기 어렵습니다. 인플루엔자 감염 현재 임상 진단은 serologic 검사, 중합 효소 사슬 반응, 직접 표본 immunofluorescence 및 세포 배양 1,6를 기준으로합니다. 새로운 방법은 또한 임상 및 실험실 진단 잠재력을 가지고 여기에 설명했다. 인플루엔자 검출 키트 Directigen 독감 등 핵 단백질 7으로 바이러스 항원을 검출하기 위해 (BD Biosciences, 산호세, 캘리포니아)과 BinaxNow (Binax 주식 회사, 스카, ME) 사용 immunochromatography 분석. , 바이러스 감지 이러한 키트를 사용하면 15 분 이내에 달성될 수 있지만, 모든 부정적인 샘플이 더들 있어야세포 배양 방법으로 creened. 각종 연구는 또한 감염이 약한 또는 8 낮았다 특히이 키트의 낮은 감도를,보고했습니다. 우리의 방법에서 우리는 지속적으로 바이러스의 낮은 100 등 PFU을 감지. 이것은 감염이 약한 경우에도 우리의 기술은, 임상 샘플에서 H1N1 바이러스를 검출에 유용합니다 제안합니다. 중 nasopharyngeal 대기음의 표본 직접 분석 않았거나 바이러스 증식 및 후속 분석 9 감염될 세포 단일층에 주사 곳 - 바이러스 항원을 감지하는 형광 기반의 방법은,보고되었습니다. 그러나 이러한 방법은 진단 목적으로 제한 및 바이러스 titer 계산에 적합하지 않습니다. Q-PCR은 RNA 바이러스의 존재를 파악하는 데 도움과 실시간 바이러스의 감염을 추정하지 않습니다. 이러한 assays에 비해 IR 염료 기반의 분석 시스템은 임상 및 실험실 표본의 탐지 및 바이러스 titer 열거에 도움이 될 것입니다. 독감 발발 경우에는 그렇지짧은 기간 동안 견본의 수천을 진단하는 것이 중요합니다. 384 잘 플레이트와 적외선 스캐너를 기반으로 우리의 방법은 그러므로 다른 직접적인 형광등 방식에 비해 큰 이점을 제공 시간 (&gt; 2,000 샘플)에 6 접시를 스캔할 수 있습니다. 임상 견본의 수천의 빠른 처리 타당성은 분석 시간과 비용을 테스트 변화, 길이를 줄일 수 있습니다. M2 특정 항체의 사용은 H와 N 단백질의 변형 차이 독립적이라는 장점을 제공합니다. M2-단백질은 상대적으로 인간을 감염 대부분의 인플루엔자 변종에 보존되어있다. 순환 얼룩 특정 항체는 저희 시스템과 결합하는 경우에는 하나는 바이러스의 두 titer를 측정하고 긴장을 식별할 수 있습니다. M2는 Amantadine 같은 약물의 대상이기 때문에 그러나, 돌연변이 여기에 사용되는 mAb에 대한 바인딩 사이트를 바꿀 수 있었 발생할 수 있습니다. 이것은이 약물에 의해 치료되고 개인이 시스템에 대한 잠재적인 제한 사항을 나타냅니다. 복수assays는 테스트 샘플에서 인플루엔자 titers를 열거하는 데 사용됩니다. 바이러스 titer, 50 %의 조직 문화가 전염성 선량 (TCID 50) 계란 allantoic 유체 기반 assays를 계산하기 위해서는 널리 1,10를 사용합니다. 그러나 여러 일 요구 사항은 이러한 방법이 덜 안정적인합니다. 또한, 이러한 방법에 plaques의 수가 50 %의 변화를 기반으로 계산이 정확한 이론 있지만 바이러스 titrations를 제공합니다. assays를 형성 상패가 96시간 이내에 수행할 수 있으나, 재현성의 부족 바이러스 titer 계산에서 주요 관심사입니다. 여기에 설명된 현재의 기술은 몇 가지 뚜렷한 장점이 있습니다. 첫째, 일관성있는 결과와 높은 재현성 기술입니다. 둘째, 바이러스 titer의 계산은 정의된 표준 곡선 비교되는 형광 강도의 간단한 부량 기준으로 산정됩니다. 셋째, 두 개 이상의 일차 항체는 주어진 샘플에서 여러 serotypes를 진단하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 IR 염료 복합 항체가 미소를알 autofluorescence하며 세포 이미징 11 사용되었습니다. 높은 양자 항복 내생 fluorophores의 존재로 인해 높은 휴대 autofluorescence의 자외선이나 방사선 영상 (300-600 nm의) 결과입니다. 이들은 방향족 아미노산, 사러가 - 안료, pyridinic 세포핵 (NADPH), 엘라스틴, 콜라겐과 플라 빈의 coenzymes을 포함합니다. 세포의 이러한 본질적인 속성은 프로브는 특정 단백질의 표현을 수치로 어렵게 방사선 이러한 소스를 활용할 수 있습니다. 반면, 가까운 적외선 염료는 자극과 670-1000 nm의 사이에 내보냅니다. 많은 호스트 세포 분자와 polyaromatic 탄화 수소는이 파장에 자극 및 감소 광 산란으로 인해 매우 낮은 배경 형광을 방출하지 않습니다. 또한, 배경과 구체적인 탐지 사이의 창이 크게 부근-IR fluorophores의 높은 흡광 계수에 의해 향상됩니다. Photostability, 우수한 신호 대 노이즈 비율은 바이러스 titers의 부량에 매우 적합합니다. microfl 사용uidic 챔버 스는 로봇 제어를 통해 심사 과정을 자동화합니다, 그리고 우리가 쉽게 높은 전염성 임상 샘플을 테스트할 수있다. 따라서 이러한 메서드에 가까운 적외선 염료의 활용은 조직 샘플에서 바이러스 titers를 열거할 수 이상과 높은 신뢰성이다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 소의 혈청 알부민 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 바이러스 </td><td></td><td></td><td> 닥터 토마스 M 모란에서 </td></tr><tr><td> 염소 항 마우스 IRDye @ 800 </td><td> LI-COR biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 희석 </td></tr><tr><td> LI-COR 오디세이 IR 스캐너 </td><td> LI-COR-biosciences </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 우물 평면 바닥 플레이트 </td><td> Nalge Nunc 인터내셔널 </td><td> 164,730 </td><td></td></tr><tr><td> 96 우물 평면 바닥 플레이트 </td><td> Nalge Nunc 인터내셔널 </td><td> 165,305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM 배지 </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 배지 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> Invitrogen </td><td> 25,080 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> 반 (反) M-2 항체 </td><td></td><td></td><td> 닥터 토마스 M 모란에서 </td></tr><tr><td> 안티 NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> MTA로 획득 </td></tr></tbody></table>

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스는 세계의 여러 지역에서 병적 상태와 사망률 매년 높은 학위를 일으키는 호흡기 병원체이다. 따라서 임상 샘플 방대한 숫자의 감염 변형 및 신속한 높은 처리량 검사의 정확한 진단 유행성 감염의 확산을 제어할 답해야 해요. 인플루엔자 감염 현재 임상 진단은 serologic 검사, 중합 효소 사슬 반응, 직접 표본 immunofluorescence 및 세포 배양 1,2를 기준으로합니다. 여기서는 라이브 인플루엔자 바이러스를 검색하는 데 사용 소설 진단 기술의 발전을보고합니다. 우리는 MDCK 세포에게 4를 사용하여이 기술의 효능을 테스트하는 마우스 적응 인간 A/PR/8/34 (PR8, H1N1) 바이러스 3 사용됩니다. MDCK 세포는 (물론 지당 10 4 ~ 5 × 10 3) 96에서 배양해 있었다 - 또는 PR8 및 바이러스성 단백질에 감염된 384 잘 접시는 IR 염료 복합 초에 의해 안티 M2 다음을 사용하여 발견되었습니다ondary 항체. M2 5 적혈구응집소 1은 다양한 진단 assays에 사용되는 두 가지 주요 마커 단백질입니다. 채용 IR-염료 복합 이차 항체는 다른 형광 염료와 관련된 autofluorescence을 최소화. 안티 M2 항체의 사용은 우리가 바이러스 수량의 직접적인 메트 릭으로 항원에 특정한 형광 강도를 사용하도록 허용했다. 형광 강도를 열거하기 위해 우리는 LI-COR 오디세이 기반 적외선 스캐너를 사용했습니다. 이 시스템은 fluorophores을 파악하고 배경 잡음에서 그들을 차별화하기 위해 두 채널의 레이저 기반 적외선 탐지를 사용합니다. 첫 번째 채널은 680 nm의에서 흥분과 배경을 계량하기 위해 700 nm의에서 방출. 두 번째 채널은 780 nm의에서 fluorophores 그 자극을 감지 및 800 nm의에서 내보냅니다. 적외선 스캐너의 PR8에 감염된 MDCK 세포 검사는 바이러스 titer 종속 밝은 형광을 지적했다. 10 2 -10 5 PFU부터 바이러스 titer에 대한 형광 강도의 긍정적인 상관 관계가 사기꾼이 될 수도sistently 관찰했다. 10 2 -10 3 PFU PR8 바이러스성 titers는 거의 적외선 염료의 높은 감도를 보여주지만, 최소한의 감지 양성 지속적으로 본. 신호 대 잡음 비율 모의 - 감염된 또는 isotype 항체 - 대우 MDCK 세포를 비교하여 결정되었다. 96에서 형광 강도를 사용하여 - 또는 384 - 잘 플레이트 형식을, 우리는 표준 적정 곡선을 잽니다. 두 번째 변수는 형광 강도가있는 동안이 계산에서 첫 번째 변수는 바이러스 titer입니다. 따라서 바이러스 titers와 형광 농도 사이의 다항식 관계를 결정하는 곡선 맞춤을 생성하는 지수 분포를 사용했습니다. 집단적으로, 우리는 IR 염료 기반의 단백질 검출 시스템은 바이러스 변종에 감염 진단하고 정확하게 감염 병원체의 titer를 열거할 수 있습니다 결론.

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스는 매년 전 세계 여러 지역에서 높은 이환율과 사망률을 유발하는 호흡기 병원체입니다. 따라서, ...

본 절차의 전반적인 목표는 감염된 마우스의 기도 내 인플루엔자 바이러스 역가를 효율적으로 정량화하는 것입니다. 마우스는 먼저 선택된 감염 후 시점에 인플루엔자 바이러스를 비강 내로 접종받습니다.마우스를 희생시키고 기관지폐포 세척액(BAL fluid)을 수집합니다. 다음으로, 수집한 BAL fluid를 사용하여 MDCK 세포를 감염시킵니다. 감염된 세포는 특정 1차 항체와 이어서 적외선 접합 2차 항체를 사용하여 바이러스 단백질의 존재 여부를 염색할 수 있습니다.적외선 신호는 Lycor Odyssey 스캐너를 사용하여 읽으며, Odyssey 소프트웨어를 사용하여 바이러스 역가를 결정할 수 있습니다. 표준 곡선을 이용하면 바이러스 역가의 정량적 결정이 가능합니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 바이러스 역가의 정밀한 정량화, 재현성, 그리고 분석 수행에 필요한 시료 부피가 적다는 점입니다.이 기술의 시사점은 이 절차 이후 임상 시료 내의 바이러스 역가를 정량화하는 데 사용할 수 있으므로, 다양한 호흡기 바이러스 질환의 진단 및 치료로 확장될 수 있습니다. 바이러스 복제 수와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 QPCR과 같은 다른 방법이 수행될 수 있습니다. 이 기술을 시도할 때, 이러한 전개 이후 역가 표준 대조 바이러스를 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 기술은 바이러스 논리 분야의 연구자가 임상 샘플에서 바이러스 역가를 탐색하거나 바이러스 단백질의 트위스트 염색을 수행할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 기술을 숙달하면 17시간 이내에 수행할 수 있습니다. 정확한 수행 방법은 다음과 같습니다. 우선, 멸균 PBS 30 µL에 희석된 5,000 PFU의 PR eight 인플루엔자 바이러스를 마우스의 비강 내로 감염시키거나, 대조군으로서 PBS만을 투여합니다. 안락사시킨 동물로부터 BAL 액을 수집하기 위해, 먼저 가슴강을 절개하고 미세 멸균 가위로 기관과 평행하게 1 cm 절개하여 기관을 노출시킵니다.기관에 작은 절개를 내고 1% BSA가 포함된 PBS 0.5 milliliters를 주입한 후, 세척액을 부드럽게 흡인합니다. 세척액 내의 바이러스 역가를 정량하기 위해 BAL 액체를 -20 °C에서 보관하십시오. 먼저 5 million 개의 MDCK 세포를 T 75 플라스크 내 20 milliliters의 완전 RPMI 배지에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양한 뒤, 다음 날 세포를 수확하여 광학용 평저 검정 96 웰 플레이트에 웰당 10,000 cells의 밀도로 분주합니다.배양 후 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, FBS 대신 0.2% BSA가 포함된 혈청이 없는 완전 DMEM으로 세포를 두 번 세척합니다. 세포 세척이 완료되면, 웰당 50 µL의 BAL 액체 또는 기지의 농도로 포함된 바이러스 현탁액 50 µL를 첨가합니다.그 다음, 바이러스의 부착, 진입 및 복제를 촉진하기 위해 0.2 µg/mL의 TPCK 처리 trypsin이 포함된 DMEM 배지를 웰당 50 µL씩 첨가합니다. 바이러스가 흡수될 수 있도록 세포를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 각 웰에 complete RPMI가 포함된 FBS 100 µL를 첨가하고 세포를 하룻밤 동안 배양하여 감염이 확산되도록 합니다.1% B-S-A-P-B-S 100 µL로 세포를 세척합니다. 세포 세척이 끝나면, 웰당 1% paraformaldehyde 100 µL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 다음으로 웰당 1% B-S-A-P-B-S 100 µL로 세척하고, 블로킹을 위해 세포를 30분 동안 추가로 배양합니다. 블로킹이 완료되면, 1:1000으로 희석한 1차 항바이러스 M2 항체 50 µL를 웰당 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하여 존재하는 바이러스 단백질을 염색합니다. 배양 후, 1% B-S-A-P-B-S로 세포를 3회 세척하고, 1:200으로 희석한 적외선 염료 접합 2차 항체 100 µL를 웰당 첨가하여 암실 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 염색이 완료되면, 이전과 동일하게 3회 세척합니다.그런 다음 플레이트를 Licor Odyssey 적외선 스캐너의 리딩 글라스 플랫폼 위에 배치합니다. Licor Odyssey 소프트웨어를 사용하여 리더기에서 96웰 플레이트 설정을 선택합니다. 블랭크 음성 대조군 웰을 지정한 후, 플레이트 전체의 형광을 정량화합니다.자동 도형 도구를 사용하여 테스트 웰 중앙에 관심 영역(ROI)을 그립니다. 분석의 기저 형광값을 설정하기 위해 음성 대조군 웰의 ROI를 사용하며, Odyssey 소프트웨어에서 제공하는 두 개의 대립하는 십자선을 ROI 내에 배치하여 웰 전체의 형광 강도를 측정합니다.다음으로, 검출을 위해 780 nanometer 채널을 사용하고 680 nanometer를 참조 파장으로 설정하여 플레이트를 스캔합니다. 읽기 명령이 활성화되면, ROI의 균일한 간격으로 형광 강도가 측정됩니다. 그 후 수집된 데이터 포인트들이 통합됩니다.표준 편차 배수는 ROI에 포함될 기저선 대비 신호 수준을 결정합니다. 크기와 관계없이 정의된 영역의 순 픽셀 부피를 나타내는 통합 강도(integrated intensity) 옵션을 선택하여 계산하시기 바랍니다. 배경 형광은 모의 감염 대조군으로부터 정량화하며, 이를 통해 테스트 웰의 통합 강도를 추정합니다. 희석 배수별로 정량된 바이러스가 포함된 중복 웰의 적외선 형광을 사용하여 표준 곡선을 작성합니다.표준 곡선을 사용하여 감염된 마우스의 BAL 액 내 역가를 결정할 수 있습니다. 본 실험에서는 2일 차와 4일 차에 바이러스 부하가 유의미하게 증가하는 것이 관찰되었습니다. 여기에 나타난 바와 같이, 감염 후 10일 차까지 바이러스가 제거되었습니다.이 분석법을 사용하여 측정한 바이러스 역가는 감염 후 마우스의 체중 감소와 잘 상관됩니다. 이 기술은 인간 시료에도 적용할 수 있습니다. 여기에는 인간 비강 면봉에서 채취한 H1N1 바이러스의 정량 결과가 나타나 있습니다.여기서 검출 한계는 10³ TCID 또는 조직 배양 감염량입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 적외선 염료 기반 분석법을 사용하여 인플루엔자 바이러스 역가를 추정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. Core imager 사용이 어려울 수 있으므로 이 기술에 대한 시각적 시연이 매우 중요하며, 이는 96 또는 384 웰 플레이트에서 바이러스 역가를 정량화하는 당사의 방법을 단순화하고 입증하는 데 도움이 될 것입니다.마지막으로, 바이러스를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 개인 보호 장구와 같은 사전 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

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