인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 절차의 전반적인 목표는 감염된 마우스의 기도 내 인플루엔자 바이러스 역가를 효율적으로 정량화하는 것입니다. 마우스는 감염 후 선택된 시점에 인플루엔자 바이러스를 비강 내로 접종받습니다.

M을 희생시키고 기관지폐포 세척액(BAL fluid)을 수집합니다. 다음으로, 수집한 BAL fluid를 사용하여 MDCK 세포를 감염시킵니다. 이후 감염된 세포를 특이적 1차 항체와 이어서 적외선 결합 2차 항체로 염색하여 바이러스 단백질의 존재 여부를 확인할 수 있습니다.

적외선 신호는 Lycor Odyssey 스캐너를 사용하여 읽으며, Odyssey 소프트웨어를 통해 바이러스 역가를 결정할 수 있습니다. 표준 곡선을 이용하면 바이러스 역가의 정량적 결정이 가능합니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 바이러스 역가의 정밀한 정량화, 재현성, 그리고 분석에 필요한 시료의 양이 매우 적다는 점입니다.

이 기술은 본 절차 이후 임상 시료 내의 바이러스 역가를 정량화하는 데 사용할 수 있으므로, 다양한 호흡기 바이러스성 질환의 진단 및 치료로 응용 범위를 확장할 수 있습니다. 바이러스 복제 수와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 qPCR과 같은 다른 방법이 수행될 수 있습니다. 이 기술을 시도할 때는 본 개발 과정 이후 역가 표준 대조 바이러스를 확인하는 것이 중요함을 기억하십시오.

이 기술은 바이러스 논리 분야의 연구자가 임상 시료에서 바이러스 역가를 탐색하거나 바이러스 단백질의 twist stain을 분석할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 기술을 숙달하면 17시간 이내에 수행할 수 있습니다. 정확한 수행 방법은 다음과 같습니다. 먼저, 30 µL의 멸균 PBS에 희석한 5,000 PFU의 PR8 인플루엔자 바이러스를 마우스의 비강 내로 접종하거나, 음성 대조군으로 PBS만을 접종합니다. 안락사시킨 동물로부터 BAL 액을 수집하려면, 우선 흉강을 절개하고 미세 멸균 가위로 기관과 평행하게 1 cm 정도 절개하여 기관을 노출시킵니다.

기관에 작은 절개를 가하고, 1% BSA가 포함된 PBS 0.5 milliliters를 기관 내에 주입한 후 세척액을 부드럽게 흡인하여 제거합니다. 세척액 내의 바이러스 역가를 정량하기 위해 BAL 세척액을 -20 °C에서 보관합니다. 먼저 T 75 플라스크에서 20 milliliters의 완전 RPMI 배지를 사용하여 MDCK 세포 5 million개를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 세포를 회수하여 광학용 평저 검정 96-well 플레이트에 웰당 10,000 cells의 밀도로 분주합니다.

그 후 배양 과정을 거쳐 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, FBS 대신 0.2% BSA가 포함된 혈청 제거 완전 DMEM으로 세포를 두 번 세척합니다. 세포 세척이 완료되면, 웰당 50 µL의 BAL 액체 또는 알려진 농도의 바이러스가 포함된 현탁액 50 µL를 첨가합니다.

그런 다음 바이러스의 부착, 진입 및 복제를 촉진하기 위해 0.2 µg/mL 농도의 TPCK 처리 trypsin이 포함된 DMEM 배지를 웰당 50 µL씩 첨가합니다. 바이러스가 흡수될 수 있도록 세포를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이어서 complete RPMI가 포함된 FBS 100 µL를 각 웰에 첨가하여 세포를 하룻밤 동안 배양하며, 하룻밤 배양 후 감염이 확산되도록 합니다.

세포를 100 µL의 1% B-S-A-P-B-S로 세척합니다. 세척이 완료되면, 웰당 100 µL의 1% para formaldehyde를 첨가하고 상온에서 5분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 다음으로, 웰당 100 µL의 1% B-S-A-P-B-S로 세척하고 블로킹을 위해 세포를 30분 더 배양합니다. 블로킹이 완료되면, 1:1000으로 희석한 1차 항바이러스 M2 항체 50 µL를 웰당 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 배양하여 존재하는 바이러스 단백질을 염색합니다. 배양 후, 세포를 1% B-S-A-P-B-S로 3회 세척하고, 1:200으로 희석한 적외선 염료 결합 2차 항체 100 µL를 웰당 첨가하여 상온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 염색이 완료되면, 이전과 동일하게 3회 세척합니다.

그런 다음 플레이트를 Licor Odyssey 적외선 스캐너의 리딩 글라스 플랫폼 위에 놓습니다. Licor Odyssey 소프트웨어를 사용하여 리더기에서 96 웰 플레이트 설정을 선택하십시오. 공백 음성 대조군 웰을 지정한 후, 플레이트 전체의 형광을 정량화합니다.

자동 도형 도구를 사용하여 테스트 웰 중앙에 관심 영역(ROI)을 그립니다. 분석의 기선 형광 값을 설정하기 위해 음성 대조군 웰의 ROI를 사용하며, Odyssey 소프트웨어에서 제공하는 두 개의 서로 마주 보는 십자선을 ROI 내에 배치하여 웰 전체의 형광 강도를 측정합니다.

다음으로, 검출을 위해 780 nanometer 채널을 사용하고 680 nanometer를 참조 파장으로 설정하여 플레이트를 스캔합니다. 판독 명령이 활성화되면 ROI의 균일한 간격으로 형광 강도가 측정됩니다. 그 후 수집된 데이터 포인트들이 통합됩니다.

표준 편차 배수를 통해 ROI에 포함될 기선 대비 신호 수준을 결정합니다. 크기에 관계없이 정의된 영역의 순 픽셀 부피를 나타내는 적분 강도 옵션을 선택하여 계산하십시오. 배경 형광은 모의 감염 대조군으로부터 정량화하며, 이를 통해 테스트 웰의 적분 강도를 추정합니다. 적정된 바이러스를 단계 희석하여 포함한 중복 웰의 적외선 형광을 이용하여 표준 곡선을 작성합니다.

표준 곡선을 사용하여 감염된 마우스의 BAL 액 내 역가를 결정할 수 있습니다. 본 실험에서는 2일 차와 4일 차에 바이러스 부하가 유의미하게 증가하는 것이 관찰되었습니다. 여기에 표시된 바와 같이, 감염 후 바이러스는 10일 차까지 제거되었습니다.

본 분석법으로 측정한 바이러스 역가는 감염 후 생쥐의 체중 감소와 높은 상관관계를 보입니다. 이 기술은 인간 샘플에도 적용할 수 있습니다. 여기 제시된 내용은 인간 비강 스왑에서 추출한 H1N1 바이러스의 정량 분석 결과입니다.

여기서 검출 한계는 10³ TCID(조직 배양 감염량)입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 적외선 염료 기반 분석법을 사용하여 인플루엔자 바이러스 역가를 추정하는 방법을 충분히 이해하시게 될 것입니다. Core imager 사용이 어려울 수 있으므로 이 기법에 대한 시각적 시연이 매우 중요하며, 이는 96웰 또는 384웰 플레이트에서 바이러스 역가를 정량화하는 당사의 방법을 단순화하고 입증하는 데 도움이 될 것입니다.

마지막으로, 바이러스를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.