High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Influenzavirus-Titer in den Atemwegen infizierter Mäuse effizient zu quantifizieren. Mäuse werden zunächst zu einem gewählten Zeitpunkt nach der Infektion intranasal mit Influenzavirus infiziert.

Die M werden geopfert und die bronchoalveoläre Lavage oder BAL-Flüssigkeit wird gesammelt. Anschließend wird die BAL-Flüssigkeit verwendet, um MDCK-Zellen zu infizieren. Infizierte Zellen können dann mit spezifischen primären Antikörpern auf das Vorhandensein viraler Proteine gefärbt werden, gefolgt von infrarotmarkierten sekundären Antikörpern.

Infrarotsignale werden mit dem Lycor Odyssey-Scanner ausgelesen, und mit der Odyssey-Software können virale Titer bestimmt werden. Mithilfe einer Standardkurve lässt sich eine quantitative Bestimmung der viralen Titer erzielen. Die wesentlichen Vorteile dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren sind die präzise Quantifizierung der viralen Titer, die Reproduzierbarkeit und das geringe Probenvolumen, das für diesen Assay erforderlich ist.

Die Implikationen dieser Technik können auf die Diagnose und Therapie verschiedener respiratorischer Viruskrankheiten ausgedehnt werden, da sie zur Quantifizierung viraler Titer in klinischen Proben nach diesem Verfahren verwendet werden kann. Andere Methoden wie die qPCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen, beispielsweise zur Virus-Kopienzahl, zu beantworten. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig, daran zu denken, den Titer des Standardkontrollvirus nach dieser Entwicklung zu überprüfen.

Diese Technik ebnet dem Forscher auf dem Gebiet der viralen Logik den Weg, um die Virus-Titer zu bestimmen oder virale Proteine in klinischen Proben nachzuweisen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb von 17 Stunden durchgeführt werden. Mäuse werden präzise intranasal mit 5.000 infektiösen Einheiten oder PFU des PR8-Influenzavirus in 30 Mikroliter steriler PBS oder allein mit PBS als negativer Kontrolle infiziert, um BAL-Flüssigkeit von euthanasierten Tieren zu gewinnen. Zunächst wird die Brusthöhle geöffnet und mit feinen sterilen Scheren ein etwa ein Zentimeter langer Schnitt parallel zur Luftröhre gesetzt, um diese freizulegen.

Führen Sie einen kleinen Schnitt in die Trachea ein, spülen Sie die Trachea mit 0,5 Milliliter PBS, das 1 % BSA enthält, aus und aspirieren Sie die Spülflüssigkeit vorsichtig wieder ab. Lagern Sie die BAL-Flüssigkeiten bei minus 20 Grad Celsius, um die virale Titer in den Spülflüssigkeiten zu quantifizieren. Kultivieren Sie zunächst 5 Millionen MDCK-Zellen in 20 Milliliter vollständigem RPMI über Nacht bei 37 Grad Celsius; am nächsten Tag ernten Sie die Zellen und geben sie in eine optisch flache, schwarze 96-Well-Platte mit je 10.000 Zellen pro Vertiefung.

Anschließend die Platte nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Vorsichtig den Überstand abpipettieren und die Zellen zweimal mit vollständigem, aber serumfreiem DMEM gewaschen, das 0,2 % BSA anstelle von FBS enthält. Nach dem Waschen der Zellen 50 Mikroliter BAL-Flüssigkeit oder 50 Mikroliter einer Suspension mit einer bekannten Virus-Konzentration pro Mulde hinzufügen.

Gegeben Sie dann 50 µL pro Vertiefung DMEM-Medium mit TPCK-behandelter Trypsin-Konzentration von 0,2 µg/mL zu, um die virale Anheftung, den Eintritt und die Replikation zu verbessern. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 °C, damit sich das Virus anheften kann. Anschließend geben Sie 100 µL FBS-haltiges komplettes RPMI-Medium zu jeder Vertiefung hinzu und kultivieren die Zellen über Nacht, um die Ausbreitung der Infektion nach der Übernacht-Inkubation zu ermöglichen.

Waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 1 % BSA-PBS. Nach dem Waschen geben Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung von 1 % Paraformaldehyd hinzu und inkubieren die Platten fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren. Waschen Sie anschließend mit 100 Mikrolitern pro Vertiefung von 1 % BSA-PBS und inkubieren Sie die Zellen weitere 30 Minuten zur Blockierung. Nach der Blockierung geben Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung primären antiviralen M2-Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:1000 hinzu und inkubieren die Platten eine Stunde bei Raumtemperatur, um eventuell vorhandene virale Proteine anzufärben. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 % BSA-PBS und inkubieren sie danach mit 100 Mikrolitern pro Vertiefung sekundärem, mit Infrarotfarbstoff konjugiertem Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:200 eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Färbung waschen Sie die Zellen dreimal wie zuvor beschrieben.

Platzieren Sie anschließend die Platten auf der Leseglasplattform des Licor Odyssey Infrarot-Scanners. Wählen Sie im Lesegerät mithilfe der Licor Odyssey-Software die Einstellung für die 96-Loch-Platte aus. Identifizieren Sie die leeren negativen Kontrolllöcher und quantifizieren Sie dann die Fluoreszenz der gesamten Platte.

Verwenden Sie das Auto-Form-Werkzeug, um den interessierenden Bereich oder ROI in der Mitte eines Tests zu zeichnen. Wir verwenden den ROI aus einer negativen Kontrolle, um den Basisfluoreszenzwert für den Assay festzulegen, und führen dann die beiden entgegengesetzt angeordneten Fadenkreuze der Odyssey-Software innerhalb des ROI ein, um die Intensität der Fluoreszenz über den gesamten Wells hinweg zu messen.

Als Nächstes scannen Sie die Platte unter Verwendung des 780-Nanometer-Kanals zur Detektion und des 680-Nanometer-Kanals als Referenzwellenlänge. Sobald der Lesebefehl aktiviert wurde, werden die Fluoreszenzintensitäten in gleichmäßigen Abständen der ROI gemessen. Anschließend werden die gesammelten Datenpunkte integriert.

Ein Multiplikator der Standardabweichung legt das Maß an Signal über der Basislinie fest, das in die ROI einbezogen wird. Achten Sie darauf, die Option „integrierte Intensität“ für die Berechnungen auszuwählen, da diese das Nettopixelvolumen für definierte Bereiche unabhängig von der Größe repräsentiert. Die Hintergrundfluoreszenz wird anhand der Mock-infizierten Kontrollen quantifiziert und zur Schätzung der integrierten Intensität in den Testansätzen verwendet. Die Infrarotfluoreszenz aus duplizierten Ansätzen, die serielle Verdünnungen eines titrierten Virus enthalten, wird zur Erstellung einer Standardkurve verwendet.

Anschließend kann die Standardkurve verwendet werden, um die Titer der Bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von infizierten Mäusen zu bestimmen. In diesem Experiment wurde ein signifikanter Anstieg der Viruslast am zweiten und vierten Tag beobachtet. Nach der Infektion war das Virus bis zum zehnten Tag, wie hier gezeigt, eliminiert.

Mittels dieses Assays gemessene virale Titer korrelieren gut mit dem Gewichtsverlust der Mäuse nach einer Infektion. Diese Technik kann auch auf humane Proben angewendet werden. Hier gezeigt ist eine Quantifizierung des H1N1-Virus aus einem menschlichen Nasenabstrich.

Die Nachweisgrenze liegt hier bei 10 hoch 3 TCID oder Gewebekultur-infektiöser Dosis. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, verfügen Sie über ein gutes Verständnis dafür, wie man die Influenzavirus-Titer mithilfe eines auf Infrarotfarbstoffen basierenden Assays abschätzt. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die Verwendung des Corp-Imagers schwierig sein kann, und dies wird dazu beitragen, unsere Methoden zur Quantifizierung viraler Titer in einer 96- oder 384-Loch-Platte zu vereinfachen und zu veranschaulichen.

Und schließlich: Arbeiten mit Viren kann äußerst gefährlich sein, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.