High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Influenza-Virustiter in den Atemwegen infizierter Mäuse effizient zu quantifizieren. Mäuse werden zu einem ausgewählten Zeitpunkt zunächst intranasal mit dem Influenzavirus geimpft. Punkte nach der Infektion.

Die M werden geopfert und die bronchoalveoläre Lavage oder BAL-Flüssigkeit wird aufgefangen. Als nächstes wird die BAL-Flüssigkeit verwendet, um MDCK-Zellen zu infizieren. Infizierte Zellen können dann mit spezifischen Primärantikörpern auf das Vorhandensein von viralen Proteinen gefärbt werden, gefolgt von infrarotkonjugierten Sekundärantikörpern.

Infrarotsignale werden mit dem Lycor Odyssey Scanner ausgelesen und die Odyssey-Software kann zur Bestimmung von Virustitern verwendet werden. Mit Hilfe einer Standardkurve kann eine quantitative Bestimmung der Virustiter erfolgen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber den bestehenden Methoden sind die genaue Quantifizierung der viralen Titer, die Reproduzierbarkeit und das geringe Volumen, das für die Durchführung dieses Assays erforderlich ist.

Die Implikationen dieser Technik können auf die Diagnose und Therapie verschiedener respiratorischer Viruserkrankungen ausgeweitet werden, da sie zur Quantifizierung von Virustitern in klinischen Proben verwendet werden kann. Nach diesem Verfahren kann die Technik erweitert werden. Andere Methoden wie QPCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Anzahl der viralen Kopien zu beantworten. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, daran zu denken, das Titerstandard-Kontrollvirus nach dieser Entwicklung zu überprüfen.

Diese Technik ebnet dem Forscher auf dem Gebiet der viralen Logik den Weg, um Virustiter oder Twist-Stain-Virusproteine in klinischen Proben zu erforschen. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in 17 Stunden durchgeführt werden. Es wurde präzise durchgeführt: Mäuse intranasal mit 5.000 Platforming-Einheiten oder PFU von PR acht Influenzaviren in 30 Mikrolitern sterilem PBS oder mit PBS allein als Negativkontrolle für die BAL-Flüssigkeitsentnahme von euthanasierten Tieren zuerst zu infizieren, die Brusthöhle aufzuschneiden und einen einen Zentimeter langen Schnitt parallel zur Luftröhre zu machen, um sie mit einer feinen sterilen Schere freizulegen.

Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Luftröhre, infundieren Sie die Luftröhre mit 0,5 Millilitern 1%BSA, das PBS enthält, und saugen Sie die Spülflüssigkeit vorsichtig ab. Lagern Sie die BAL-Flüssigkeiten bei minus 20 Grad Celsius, um die Virustiter in den Spülflüssigkeiten zu quantifizieren. Kultivieren Sie zunächst 5 Millionen MDCK-Zellen in 20 Millilitern vollständigem RPMI in einem T 75-Kolben über Nacht bei 37 Grad Celsius am nächsten Tag, ernten Sie die Zellen und plättieren Sie sie in einer optischen schwarzen 96-Well-Platte mit flachem Boden bei 10.000 Zellen pro Well.

Inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei 37 Grad Celsius nach der Inkubation. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und waschen Sie die Zellen zweimal vollständig, aber serumfreies DMEM, das 0,2 % BSA anstelle von FBS enthält. Sobald die Zellen gewaschen sind, fügen Sie 50 Mikroliter BAL-Flüssigkeit oder 50 Mikroliter einer Suspension hinzu, die eine bekannte Viruskonzentration pro Vertiefung enthält.

Fügen Sie dann 50 Mikroliter DMEM pro Well hinzu, ein Medium, das TPCK-behandeltes Trypsin in einer Menge von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter enthält, um die Anheftung, den Eintritt und die Replikation des Virus zu verbessern. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, damit das Virus absorbiert werden kann. Geben Sie dann über Nacht 100 Mikroliter FBS mit vollständigem RPMI in jede Vertiefung, um die Zellen zu kultivieren, damit sich die Infektion nach der Inkubation über Nacht ausbreiten kann.

Waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 1%B-S-A-P-B-S. Sobald die Zellen gewaschen sind, fügen Sie 100 Mikroliter 1%para-Formaldehyd pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren. Waschen Sie anschließend mit 100 Mikrolitern pro Vertiefung 1%B-S-A-P-B-S und inkubieren Sie die Zellen für weitere 30 Minuten zum Blockieren. Sobald die Zellen blockiert sind, fügen Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung primären antiviralen M zwei Antikörper hinzu, verdünnt auf eins bis 1000, und inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um das nach der Inkubation vorhandene virale Protein zu färben, waschen Sie die Zellen dreimal in 1%B-S-A-P-B-S und inkubieren Sie sie mit 100 Mikrolitern pro Vertiefung Infrarot-Farbstoff-konjugierten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von eins bis 200 für eine Stunde bei Raumtemperatur Im Dunkeln, sobald die Zellen fleckig sind, waschen Sie sie wie zuvor dreimal.

Positionieren Sie dann die Platten auf der Leseglasplattform des Licor Odyssey Infrarotscanners. Wählen Sie die Einstellung für die 96-Well-Platte am Lesegerät mit der Licor Odyssey-Software. Identifizieren Sie die leeren negativen Kontrollvertiefungen und quantifizieren Sie dann die Fluoreszenz von der gesamten Platte.

Verwenden Sie das Werkzeug für die automatische Form, um den Interessenbereich oder den ROI in der Mitte eines Tests zu zeichnen. Nun, nutzen Sie den ROI aus einer Negativkontrolle. Nun, um den Basis-Fluoreszenzwert für den Assay festzulegen, führen Sie dann die beiden gegenüberliegenden Fadenkreuze ein, die von der Odyssey-Software innerhalb des ROI bereitgestellt werden, um die Intensität der Fluoreszenz über das Well zu messen.

Scannen Sie anschließend die Platte mit dem 780-Nanometer-Kanal für die Detektion und 680 Nanometer als Referenzwellenlänge. Sobald der Lesebefehl aktiviert wurde, werden die Fluoreszenzintensitäten in einheitlichen Abständen des ROI gemessen. Und dann wurden die gesammelten Datenpunkte integriert.

Ein Standardabweichungsmultiplikator bestimmt den Signalpegel über der Basislinie, der in den ROI einbezogen wird. Achten Sie darauf, die Option "Integrierte Intensität" für Berechnungen auszuwählen, da sie das Nettopixelvolumen für definierte Bereiche unabhängig von der Größe darstellt. Die Hintergrundfluoreszenz wird von den simulierten infizierten Kontrollen quantifiziert und zur Abschätzung der integrierten Intensität in Testvertiefungen verwendet. Die Infrarotfluoreszenz aus doppelten Vertiefungen, die serielle Verdünnungen des titrierten Virus enthalten, wird verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen.

Die Standardkurve kann dann verwendet werden, um die Titer der BAL-Flüssigkeit von infizierten Mäusen zu bestimmen. In diesem Experiment wurde ein signifikanter Anstieg der Viruslast am zweiten und vierten Tag beobachtet. Das Virus nach der Infektion wurde an Tag 10 beseitigt, wie hier gezeigt.

Die mit diesem Assay gemessenen Virustiter korrelieren gut mit dem Gewichtsverlust der Maus nach einer Infektion. Diese Technik kann auch auf menschliche Proben angewendet werden. Hier ist eine Quantifizierung von H one N one Virus aus einem menschlichen Nasenabstrich

Die Nachweisgrenze liegt hier bei 10 bis zur dritten TCID- oder Gewebekultur-infektiösen Dosis. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie auch ein gutes Verständnis dafür, wie Sie den Influenzavirus-Titer mit Hilfe eines Infrarot-Die-basierten Assays abschätzen können. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die Verwendung des Corp-Imagers schwierig sein kann und dies dazu beitragen wird, unsere Methoden zur Quantifizierung viraler Titer in einer 96- oder 384-Well-Platte zu vereinfachen und zu demonstrieren.

Und vergessen Sie schließlich nicht, dass die Arbeit mit Viren äußerst gefährlich sein kann und Vorläufer wie persönliche Schutzausrüstung bei der Durchführung dieses Verfahrens immer mitgenommen werden sollten.