Name: High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Erfahren Sie die hochsensitive Infrarot-Farbstoff-Imaging-Methode zur Quantifizierung von Influenza-Virustitern in BAL-Flüssigkeit infizierter Mäuse. Diese Technik ermöglicht präzise, reproduzierbare Ergebnisse mit geringem Probenvolumen.

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Diese Arbeit wird teilweise NIH Zuschüsse A1064826 R01-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (SM) unterstützt. Wir danken unseren Labor-Mitglieder zur Diskussion und technische Hilfe, Tina Heil für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir möchten David Bina, Milwaukee Health Department Virus Labor für Kultur und PCR danken.

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<li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li>
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<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li>
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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die jüngste Epidemie Ausbruch der Vogelgrippe in Südostasien und einer globalen Angst vor der Schweinegrippe-Pandemie zu verhängen enorme Bedenken für die öffentliche Gesundheit und Sicherheit. Kritische Schwerpunkt bei der Erzeugung von Impfstoffen für die bestehenden und neuer Stämme von Influenza-Viren gewidmet. Die Verfügbarkeit von schnellen High-Throughput-Technologien für präzise Erkennung und genaue Berechnungen Virustiter wird enorm verbessern Behandlung. Die am häufigsten verwendeten Techniken eingesetzt werden, um Virustiter zu berechnen beinhalten Plaque-bildenden und Influenza Hämagglutinationsassays. Die Plaque-bildenden-Assay wurde zunächst entwickelt, um Bakteriophagen-Titer schätzen und wurde von Renato Dulbecco angenommen zu berechnen Tier virale Titer 4. Um diesen Test durchzuführen, werden 10-fach-Verdünnungen von Influenza lizenzfreie oder tierischen Proben, wie zB BAL-Flüssigkeit hergestellt und 0,1 ml Aliquots werden auf der Monoschicht von MDCK-Zellen inokuliert in 6-Well-Platten. Das Virus wird zur Adsorption auf die MDCK-Zellen von der Ad gefolgt erlaubtdition eines Nährmediums und Agarose. Während der Inkubation, lassen Sie die Original-infizierten Zellen virale Nachkommenschaft, die nur zu den benachbarten Zellen ausbreiten. Die zytopathogene Wirkung des Influenza-Virusinfektion produziert eine kreisförmige Zone von infizierten Zellen genannt Plaque. Jede Plakette wird vermutlich nach Infektion von einer einzigen Zelle mit einem einzigen Viruspartikel von der Replikation des Virus gebildet, gefolgt. Kontrast zwischen den lebenden Zellen und die Plaques können durch Farbstoffe wie Kristallviolett verbessert werden. Ein wesentlicher Nachteil von diesem Assay ist der Mangel an Reproduzierbarkeit und eine enorme Schwankungsbreite innerhalb Experimenten. Ein weiterer Assay verwendet, um die Influenza-Virus-Titer zu bestimmen ist die Hämagglutinationsassay. Die Hämagglutinin-Protein auf der Oberfläche des Influenzavirus effizient bindet an N-Acetylneuraminsäure-enthaltenden Proteine ​​auf Säugern und Vögeln roten Blutkörperchen 1. Diese Wechselwirkung zwischen dem Influenza-Virus und den Erythrozyten führt zu Agglutination in der Form eines Gitters. Der level der Agglutination wird verwendet, um den Titer des Influenza-Virus in Prüfkörper zu schätzen. Erythrozyten-Agglutinations-Assay wird nur für die Titration von einem bekannten Virus zu bestimmen verwendet und kann nicht für Stammidentifizierungsnummer Zwecke verwendet werden. Da dieser Assay nicht zwischen dem Live-und den toten Viren zu unterscheiden, ist es schwierig, eine genaue Berechnung der viralen Titer zu erhalten. Aktuelle klinische Diagnose von Influenza-Infektionen sind auf serologische Tests, Polymerase-Kettenreaktion, direkte Probe Immunfluoreszenz und Zellkultur 1,6 basiert. Die hier beschriebene neue Verfahren hat auch klinische und labordiagnostische Potenzial. Influenza-Nachweis-Kits Directigen Flu-A (BD Biosciences, San Jose, CA) und BinaxNOW (Binax, Inc., Portland, ME) Verwendung Immunchromatographie Assay auf virales Antigen wie Nukleoprotein 7 zu erkennen. Unter Verwendung dieser Kits, Nachweis von Virus kann innerhalb von 15 min erreicht werden, doch, haben alle negativen Proben zur weiteren s betragencreened durch die Zellkultur-Verfahren. Verschiedene Studien haben auch geringe Empfindlichkeit dieser Kits, vor allem, wenn die Infektion mild oder niedrigen 8 berichtet wurde. Bei unserer Methode erkennen wir konsequent so niedrig wie 100 PFU des Virus. Dies legt nahe, unsere Technik ist hilfreich bei der Erkennung H1N1-Virus in klinischen Proben, selbst wenn die Infektion mild ist. Ein Fluoreszenz-basierte Methode zur viralen Antigene zu detektieren wurde berichtet, aus denen entweder Nasen-Rachen-Aspirat Proben direkt analysiert wurden oder wurden auf eine Monoschicht von empfänglichen Zellen zur Virusvermehrung und die anschließenden Auswertungen 9 inokuliert. Allerdings sind diese Methoden für diagnostische Zwecke beschränkt und eignen sich nicht für Virustiter Berechnungen. Q-PCR hilft, um das Vorhandensein von viraler RNA zu identifizieren und schätzt nicht die die Infektiosität von Lebend-Viren. Im Vergleich zu diesen Assays, wird IR-Farbstoff-basierten Assay-System in der Detektion und virale Titer-Enumeration in der klinischen und Laborproben zu helfen. Im Falle einer Grippewelle, ist esentscheidend für Tausende von Proben in einer kurzen Zeitperiode zu diagnostizieren. Unsere Methode auf einer 384-Well-Platte und IR-Scanner basieren, können 6-Platten in einer Zeit (&gt; 2.000 Proben) zu scannen, und bietet daher einen größeren Vorteil gegenüber anderen direkten Fluoreszenz-Methoden. Machbarkeit der schnellen Verarbeitung von Tausenden von klinischen Proben könnten reduzieren Test Variabilität, Länge der Assay-Zeit und Kosten. Die Verwendung von einem M2-spezifischen Antikörper bietet den Vorteil, dass unabhängig von Belastung Unterschiede in den H und N-Proteine. Das M2-Protein ist relativ in den meisten Influenza-Stämme infizieren Menschen konserviert. Wenn Antikörper, die spezifisch an zirkulierenden Flecken mit unserem System kombiniert werden kann man messen sowohl den Titer des Virus zu identifizieren und die Belastung. Da jedoch M2 ist das Ziel für den Amantadin-ähnliche Medikamente, können Mutanten auf, die das Bindungsstelle für den hier verwendeten mAb ändern. Dies stellt eine potentielle Beschränkung für dieses System in Individuen, die durch diese Medikamente behandelt werden. MehrereTests werden verwendet, um Influenza-Titer in Testproben aufzuzählen. Um Virustiter, 50% Gewebekultur infektiöser Dosis (TCID 50) und Eier Allantois-Flüssigkeit-basierte Assays zu berechnen sind weit verbreitet 1,10 verwendet. Stellen Sie jedoch Bedarf von mehreren Tagen diese Methoden weniger zuverlässig. Ferner wird in dieser Methoden Berechnungen auf 50% Veränderung in der Anzahl der Plaques Basis stellen theoretische, aber nicht genau viralen Titrationen. Plaque-bildenden Tests können innerhalb von 96 Stunden durchgeführt werden, jedoch ist mangelnde Reproduzierbarkeit ein wichtiges Anliegen der virale Titer Berechnungen. Die vorliegende Technik hier beschriebene Vorgehen hat mehrere deutliche Vorteile. Erstens ist es ein hoch reproduzierbare Technik mit konsistenten Ergebnissen führen. Zweitens Virustiter Berechnungen basieren auf einfachen Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten, die gegen definierte Standard-Kurven im Vergleich beruhen. Drittens kann zwei oder mehr primären Antikörper verwendet, um mehrere Serotypen in einer gegebenen Probe zu diagnostizieren. Außerdem haben IR-Farbstoff-konjugierte Antikörper minimal Autofluoreszenz und haben für Cell Imaging 11 verwendet worden. UV-oder Stoss mit niedriger Energie (300-600 nM) führt zu hohen zelluläre Autofluoreszenz aufgrund der Gegenwart von hohen Quantenausbeuten nachgebenden endogener Fluorophore. Dazu gehören aromatische Aminosäuren, Lipo-Pigmente, pyridinischer Nukleotide (NADPH), Elastin, Kollagen und Flavin-Coenzymen. Diese intrinsische Eigenschaft von Zellen macht es schwierig, diese Quellen von Strahlung zu nutzen als Sonden die Expression spezifischer Proteine ​​zu quantifizieren. Im Gegensatz dazu anregen NIR-Farbstoffe und emittieren zwischen 670-1000 nm. Viele Gastgeber zellulären Molekülen und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe nicht bei dieser Wellenlänge anregen und aufgrund der geringeren Lichtstreuung, geben extrem geringe Hintergrundfluoreszenz. Ferner wird das Fenster zwischen dem Hintergrund und spezifischen Nachweis erheblich verbessert aufgrund einer hohen Extinktionskoeffizienten der Nah-IR-Fluorophore. Photostabilität, Hervorragendes Signal-Rausch-Verhältnis, ist äußerst relevant bei der Quantifizierung der viralen Titer. Verwendung von Microfluidic Kammern wird das Screening-Verfahren durch Roboter-Steuerungen zu automatisieren, und könnten es uns ermöglichen, hoch ansteckende klinischen Proben mit Leichtigkeit zu testen. Somit ist die Nutzung der NIR-Farbstoffe in diesen Verfahren ideale und höchst zuverlässige, um virale Titer in Gewebeproben aufzuzählen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8-Virus </td><td></td><td></td><td> Von Dr. Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus-IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR-Scanner </td><td> LI-COR Biosciences- </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-Brunnen flache Bodenplatte </td><td> Nalge Nunc internationalen </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Brunnen flache Bodenplatte </td><td> Nalge Nunc internationalen </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2-Antikörper </td><td></td><td></td><td> Von Dr. Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Anti-NP-mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Erhalten mit einem MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput nachweisverfahren für influenza-virus

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza-Virus ist ein Krankheitserreger, der Atemwege ein hohes Maß an Morbidität und Mortalität in jedem Jahr in verschiedenen Teilen der Welt verursacht. Daher ist eine genaue Diagnose des infizierenden Stammes und schnelle Hochdurchsatz-Screening einer großen Zahl von klinischen Proben ausschlaggebend für die Ausbreitung der Pandemie-Infektionen zu kontrollieren. Aktuelle klinische Diagnose von Influenza-Infektionen sind auf serologische Tests, Polymerase-Kettenreaktion, direkte Probe Immunfluoreszenz und Zellkultur 1,2 basiert. Hier berichten wir über die Entwicklung eines neuartigen Diagnose-Technik verwendet, um Live-Influenza-Viren zu erkennen. Wir nutzten die Maus-adaptierten menschlichen A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-Virus 3, um die Wirksamkeit dieser Technik unter Verwendung MDCK-Zellen 4 zu testen. MDCK-Zellen (10 4 oder 5 x 10 3 pro Vertiefung) wurden in 96 kultiviert - oder 384-Well-Platten, mit PR8 und viralen Proteinen infiziert wurden unter Verwendung von anti-M2 gefolgt von einer IR-Farbstoff-konjugierten Sek.ondary antibody. M2 5 und Hämagglutinin 1 sind zwei bedeutende Marke Proteine ​​in vielen verschiedenen diagnostischen Assays verwendet. Der Einsatz IR-Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörpern minimierte die Autofluoreszenz mit anderen fluoreszierenden Farbstoffen zugeordnet. Die Verwendung von Anti-M2-Antikörper erlaubte uns, die Antigen-spezifischen Fluoreszenzintensität als direkte Metrik von viralen Menge die verwenden. Um die Intensität der Fluoreszenz aufzählen, nutzten wir die LI-COR Odyssey IR-basierten Scanner. Dieses System verwendet zwei Kanal Laser-basierter IR-Erkennungen zu Fluorophoren identifizieren und unterscheiden sie von Hintergrundrauschen. Der erste Kanal Anregung bei 680 nm und emittiert bei 700 nm zu helfen, den Hintergrund zu quantifizieren. Der zweite Kanal erkennt Fluorophore anzuregen, dass bei 780 nm und 800 nm emittieren. Scannen von PR8-infizierten MDCK-Zellen in der IR-Scanner zeigten eine virale Titer-abhängige helle Fluoreszenz. Eine positive Korrelation der Fluoreszenzintensität zu Virustiter ab 10 2 -10 5 PFU könnte conkonsequent beobachtet. Minimal, aber nachweisbare Positivität konsequent gesehen mit 10 2 -10 3 PFU PR8 virale Titer zeigte die hohe Empfindlichkeit der Nah-IR-Farbstoffe. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis wurde durch Vergleich der Mock-infizierten oder Isotyp-Antikörper behandelten MDCK-Zellen bestimmt. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Intensitäten von 96 - oder 384-Well-Platte-Formate, konstruierten wir Standard-Titrationskurven. In diesen Rechnungen ist die erste Variable der virale Titer, während die zweite Variable ist die Fluoreszenzintensität. Deshalb nutzten wir die exponentielle Verteilung, um eine Kurve anpassbare, um das Polynom Beziehung zwischen den viralen Titer und Fluoreszenz-Intensitäten bestimmen, zu erzeugen. Zusammen schließen wir, dass IR-Farbstoff-basierten Protein Detection System kann bei der Diagnose von viralen Stämmen infiziert und genau aufzuzählen den Titer der infizierenden Erreger.

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Das Influenzavirus ist ein respiratorischer Erreger, der jedes Jahr in vielen Teilen der Welt eine hohe Morbidität und Mortalität verursacht. Daher ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Influenzavirus-Titer in den Atemwegen infizierter Mäuse effizient zu quantifizieren. Mäuse werden zunächst zu einem ausgewählten Zeitpunkt nach der Infektion intranasal mit Influenzavirus infiziert.Die M werden geopfert und die bronchoalveoläre Lavage oder BAL-Flüssigkeit wird gesammelt. Anschließend wird die BAL-Flüssigkeit verwendet, um MDCK-Zellen zu infizieren. Infizierte Zellen können dann mit spezifischen primären Antikörpern auf das Vorhandensein viraler Proteine gefärbt werden, gefolgt von infrarotmarkierten sekundären Antikörpern.Infrarotsignale werden mit dem Lycor-Odyssey-Scanner ausgelesen, und mit der Odyssey-Software können virale Titer bestimmt werden. Mithilfe einer Standardkurve lässt sich eine quantitative Bestimmung der viralen Titer erzielen. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren sind die präzise Quantifizierung der viralen Titer, die Reproduzierbarkeit und das geringe Probenvolumen, das für den Assay benötigt wird.Die Implikationen dieser Technik können auf die Diagnose und Therapie verschiedener respiratorischer Viruskrankheiten ausgedehnt werden, da sie zur Quantifizierung viraler Titer in klinischen Proben nach diesem Verfahren verwendet werden kann. Andere Methoden wie die qPCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen, beispielsweise zur Virus-Kopienzahl, zu beantworten. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig, daran zu denken, den Titer des Standardkontrollvirus nach dieser Entwicklung zu überprüfen.Diese Technik ebnet den Weg für Forscher im Bereich der viralen Logik, um Virus-Titer oder verdrehte Virusproteine in klinischen Proben zu untersuchen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 17 Stunden durchgeführt werden. Mäuse werden präzise intranasal mit 5.000 infektiösen Einheiten oder PFU des PR8-Influenzavirus in 30 Mikroliter steriler PBS oder allein mit PBS als negativer Kontrolle infiziert, um BAL-Flüssigkeit von euthanasierten Tieren zu gewinnen. Zunächst wird die Brusthöhle geöffnet und mit feinen sterilen Scheren ein etwa ein Zentimeter langer Schnitt parallel zur Luftröhre gesetzt, um diese freizulegen.Erstellen Sie einen kleinen Einschnitt in die Trachea, spülen Sie die Trachea mit 0,5 Milliliter PBS, das 1 % BSA enthält, aus und aspirieren Sie die Lavageflüssigkeit vorsichtig wieder ab. Lagern Sie die BAL-Flüssigkeiten bei minus 20 Grad Celsius, um die Virus-Titer in den Lavageflüssigkeiten zu quantifizieren. Kultivieren Sie zunächst 5 Millionen MDCK-Zellen in 20 Milliliter vollständigem RPMI über Nacht bei 37 Grad Celsius; am nächsten Tag werden die Zellen geerntet und in eine optisch flache, schwarze 96-Well-Platte mit durchsichtigem Boden mit je 10.000 Zellen pro Mulde ausplattiert.Anschließend die Platte nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Den Überstand vorsichtig abpipettieren und die Zellen zweimal mit komplettem, aber serumfreiem DMEM gewaschen, das anstelle von FBS 0,2 % BSA enthält. Nach dem Waschen der Zellen 50 Mikroliter BAL-Flüssigkeit oder 50 Mikroliter einer Suspension mit einer bekannten Konzentration des Virus pro Mulde hinzufügen.Anschießend 50 µL DMEM-Medium pro Mulde zugeben, das TPCK-behandeltes Trypsin mit einer Konzentration von 0,2 µg/mL enthält, um die virale Anheftung, den Eintritt und die Replikation zu verbessern. Die Zellen eine Stunde bei 37 °C inkubieren, damit das Virus adsorbieren kann. Danach 100 µL komplettes RPMI-Medium mit FBS pro Zellkultur in jeder Mulde zugeben und die Zellen über Nacht kultivieren, um die Ausbreitung der Infektion nach der Übernacht-Inkubation zu ermöglichen.Waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 1 % BSA-PBS. Nach dem Waschen geben Sie 100 Mikroliter pro Mulde 1 % Paraformaldehyd zu und inkubieren die Platten fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren. Anschließend waschen Sie mit 100 Mikrolitern pro Mulde 1 % BSA-PBS und inkubieren die Zellen weitere 30 Minuten zur Blockade. Nach der Blockade geben Sie 50 Mikroliter pro Mulde primären antiviralen M2-Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:1000 zu und inkubieren die Platten eine Stunde bei Raumtemperatur, um eventuell vorhandene virale Proteine anzufärben. Danach waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 % BSA-PBS und inkubieren sie mit 100 Mikrolitern pro Mulde sekundärem, mit Infrarotfarbstoff konjugiertem Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:200 eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Färbung waschen Sie die Zellen dreimal wie zuvor beschrieben.Danach die Platten auf der Leseglasplattform des Licor Odyssey-Infrarot-Scanners positionieren. Im Licor Odyssey-Software die 96-Loch-Platten-Einstellung am Lesegerät auswählen. Die leeren negativen Kontrolllöcher identifizieren und anschließend die Fluoreszenz der gesamten Platte quantifizieren.Verwenden Sie das Auto-Form-Werkzeug, um den interessierenden Bereich oder ROI in der Mitte eines Tests zu zeichnen. Wir verwenden den ROI aus einer negativen Kontrolle, um den Basis-Fluoreszenzwert für den Assay festzulegen, und führen dann die beiden entgegengesetzt angeordneten Fadenkreuze, die von der Odyssey-Software innerhalb des ROI bereitgestellt werden, ein, um die Intensität der Fluoreszenz über den gesamten Probenträger zu messen.Als Nächstes scannen Sie die Platte unter Verwendung des 780 Nanometer-Kanals zur Detektion und des 680 Nanometer-Kanals als Referenzwellenlänge. Sobald der Lesebefehl aktiviert wurde, werden die Fluoreszenzintensitäten in gleichmäßigen Abständen der ROI gemessen. Anschließend werden die erfassten Datenpunkte integriert.Ein Multiplikator der Standardabweichung legt das Ausmaß des Signals über der Grundlinie fest, das in die ROI einbezogen wird. Achten Sie darauf, die Option „integrierte Intensität“ für die Berechnungen auszuwählen, da diese das netto Pixelvolumen für definierte Bereiche unabhängig von deren Größe angibt. Die Hintergrundfluoreszenz wird aus den Mock-infizierten Kontrollen quantifiziert und zur Schätzung der integrierten Intensität in den Testproben verwendet. Die Infrarotfluoreszenz aus duplizierten Proben, die serielle Verdünnungen titrierter Viren enthalten, wird zur Erstellung einer Standardkurve verwendet.Anschließend kann die Standardkurve verwendet werden, um die Titer der Bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von infizierten Mäusen zu bestimmen. In diesem Experiment wurde ein signifikanter Anstieg der Viruslast am zweiten und vierten Tag beobachtet. Nach der Infektion war das Virus bis zum zehnten Tag, wie hier gezeigt, eliminiert. Mittels dieses Assays gemessene virale Titer korrelieren gut mit dem Gewichtsverlust von Mäusen nach einer Infektion. Diese Technik kann auch auf humane Proben angewendet werden. Dargestellt ist hier eine Quantifizierung des H1N1-Virus aus einem menschlichen Nasenabstrich.Die Nachweisgrenze liegt hier bei 10 hoch 3 TCID, der infektiösen Dosis für Gewebekulturen. Nach dem Anschauen dieses Videos haben Sie zudem ein gutes Verständnis dafür, wie man die Titer von Influenzaviren mithilfe eines auf Infrarotfarbstoffen basierenden Assays abschätzen kann. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die Verwendung des Corp-Imagers schwierig sein kann; dies wird dazu beitragen, unsere Methoden zur Quantifizierung viraler Titer in einer 96- oder 384-Loch-Platte zu vereinfachen und zu veranschaulichen.Und schließlich: Arbeiten mit Viren können äußerst gefährlich sein, und Vorsichtsmaßnahmen wie beispielsweise persönliche Schutzausrüstung sollten stets getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

Diese Studie beschreibt Diagnose der Aviären Influenza bei Wildvögeln mit einem tragbaren rRT-PCR-System. Die Methode nutzt die Vorteile der gefriergetrockneten Reagenzien auf Wildvögel in einem Nicht-Labor-Einstellung, die typisch für einen Ausbruch Szenario Bildschirm. Verwenden von molekularen Werkzeugen bietet genaue und empfindliche Alternativen für eine schnelle Diagnose.

Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld

In diesem Video diskutieren wir die Korrelation zwischen dem CIT50 und der Vielzahl von Virusinfektionen. Die virusinfizierten Zellen zeigen zytopathische Wirkungen, die zu ihrem Tod und ihrer Ablösung von der Goldmikroelektrode führen, was wiederum die Impedanz verringert.

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Das Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung der Influenzaviren A und B. Dieser Assay verwendet eine Nicking-Endonuklease-Amplifikation mit Influenza-spezifischen Primern und eine Zieldetektion mit molekularen Beacon-Sonden.

Ein molekularbasierter Assay zur Quantifizierung von Influenza-A- und -B-Viren

Eine integrierte Mikrofluidvorrichtung thermoplastischen Chip zur Verwendung als molekulare Diagnostik entwickelt. Der Chip führt Nukleinsäureextraktion, reverse Transkriptase und PCR. Methoden zur Herstellung und den Betrieb der Chip beschrieben.

Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect

Unter Verwendung einer gedruckten Glykan-Microarray-Strategie wurde ein konventioneller 96-Well-Plattenassay für die Analyse der Hämagglutinin-Avidität und Spezifität des Influenza-A-Virus für Sialinsäure-haltige Rezeptoren miniaturisiert.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Wir beschreiben eine schnelle, molekülbasierten Influenza A und B-Assay. Die Influenza-Test weist jedes Ziel innerhalb von 15 Minuten durch den Einsatz von isothermen Amplifikation mit Influenza-spezifischen Primer durch Zielerfassung mit molekularen Signalsonden gefolgt. Das Influenza-A-und B-Test ist benutzerfreundlich und benötigt minimale Hands-on-Zeit auszuführen.

Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Diese Studie beschreibt ein   Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Wir beschreiben die Verwendung eines phänotypischen fluoreszenzbasierten Neuraminidase-Hemmt die Anfälligkeit von Influenza A und B Viren in die Neuraminidase-Hemmer Klasse von antiviralen Medikamenten zu beurteilen.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

Erfahren Sie die hochsensitive Infrarot-Farbstoff-Imaging-Methode zur Quantifizierung von Influenza-Virustitern in BAL-Flüssigkeit infizierter Mäuse. Diese Technik ermöglicht präzise, reproduzierbare Ergebnisse mit geringem Probenvolumen.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

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