流感病毒的高通量检测方法

此方法介绍了染料的红外成像系统的使用H1N1病毒的检测，在细支气管肺泡灌洗（BAL）感染小鼠的高灵敏度流体。这种方法可以在96 - 或384孔板，要求<10μL测试材料的量，并有可能并发多种病原体筛查。

该程序的总体目标是有效量化受感染小鼠气道中的流感病毒滴度。首先在选定的时间用流感病毒鼻内接种小鼠。感染后的要点。

处死 M 并收集支气管肺泡灌洗液或 BAL 液。接下来，BAL 液用于感染 MDCK 细胞。然后可以使用特异性一抗对感染细胞进行病毒蛋白染色，然后用红外偶联的二抗对感染细胞进行染色以确定是否存在病毒蛋白。

使用 Lycor Odyssey 扫描仪读取红外信号，Odyssey 软件可用于确定病毒滴度。使用标准曲线，可以获得病毒滴度的定量测定。与现有方法相比，该技术的主要优点是病毒滴度的精确定量、重现性以及进行该分析所需的小体积。

该技术的意义可以扩展到各种呼吸道病毒性疾病的诊断和治疗，因为它可用于量化临床样本中的病毒滴度遵循此程序。可以执行 QPCR 等其他方法来回答其他问题，例如病毒拷贝数。在尝试这种技术时，重要的是要记住在开发后检查滴度标准对照病毒。

该技术为病毒学领域的研究人员探索临床样本中的病毒滴度或扭曲染色病毒蛋白提供了途径。一旦掌握了这项技术，可以在 17 小时内完成。它精确地在 30 微升无菌 PBS 中用 5， 000 个平台单位或 PR 8 流感病毒的 PFU 鼻内感染小鼠，或单独使用 PBS 作为安乐死动物收集 BAL 液体的阴性对照，首先切开胸腔并平行于气管切开一厘米的切口，用精细无菌剪刀暴露它。

在气管上做一个小切口，用 0.5 毫升含有 PBS 的 1% BSA 注入气管，然后轻轻吸出灌洗液。将 BAL 液储存在负 20 摄氏度下，以量化灌洗液中的病毒滴度。首先，第二天在 T 75 培养瓶中的 20 毫升完全 RPMI 中培养 500 万个 MDCK 细胞，在 37 摄氏度下过夜，收获细胞并以每孔 10， 000 个细胞的速度将它们接种在光学平底黑色 96 孔板中。

然后在孵育后将板在 37 摄氏度下孵育过夜。轻轻吸出上清液，在含有 0.2% BSA 而不是 FBS 的完全但无血清的 DMEM 中洗涤细胞两次。洗涤细胞后，每孔加入 50 μL BAL 液或 50 μL 含有已知浓度病毒的悬浮液。

然后每孔加入 50 μL DMEM，即含有 0.2 μg/mL TPCK 处理胰蛋白酶的培养基，以增强病毒附着、进入和复制。将细胞在 37 摄氏度下孵育 1 小时，让病毒吸收。然后向每个孔中加入 100 微升含有完全 RPMI 的 FBS，将细胞培养过夜，以使感染在过夜孵育后繁殖。

用 100 微升 1% B-S-A-P-B-S 洗涤细胞。洗涤细胞后，每孔添加 100 微升 1% 对位甲醛，并在室温下孵育板 5 分钟以固定细胞接下来用每孔 100 微升 1%B-S-A-P-B-S 洗涤，并将细胞再孵育 30 分钟以进行封闭。细胞封闭后，每孔添加 50 微升稀释度为 1 比 1000 的一抗病毒 M 2 抗体，并在室温下孵育板 1 小时以染色孵育后存在的任何病毒蛋白，在 1%B-S-A-P-B-S 中洗涤细胞 3 次，并在室温下用每孔 100 微升 1 比 200 稀释的红外染料偶联二抗孵育 1 小时在黑暗中，一旦细胞染色，像以前一样洗涤它们 3 次。

然后将板放在 Licor Odyssey 红外扫描仪的老花镜平台上。使用 Licor Odyssey 软件在读数仪上选择 96 孔板设置。鉴定空白阴性对照孔，然后定量整个板的荧光。

使用自动形状工具在测试过程中绘制感兴趣区域或 ROI。好吧，使用阴性对照的 ROI。好吧，要设置测定的基线荧光值，然后在 ROI 中引入 Odyssey 软件提供的两个相对的十字准线，以测量整个孔的荧光强度。

接下来，使用 780 纳米通道进行检测，并使用 680 纳米作为参考波长扫描板。激活读取命令后，将测量 ROI 均匀间隔的荧光强度。然后整合收集的数据点。

标准差乘数将确定 ROI 中包含的基线信号水平，请务必选择集成强度选项进行计算，因为它表示定义区域的净像素体积，与大小无关。背景荧光将从模拟感染的对照中量化，并用于估计测试孔中的综合强度。来自含有滴定病毒连续稀释液的重复孔的红外荧光用于构建标准曲线。

然后可以使用标准曲线来确定来自受感染小鼠的 BAL 液滴度。在该实验中，在第 2 天和第 4 天观察到病毒载量显着增加。感染后病毒在第 10 天被清除，如图所示。

使用该测定法测量的病毒滴度与感染后小鼠体重减轻密切相关。该技术也可应用于人类样本。此处显示的是来自人鼻拭子的 H one N one 病毒的定量结果。

这里的检测限是 10 到 3 次 TCID 或组织培养感染剂量。观看此视频后，您还对如何使用基于红外芯片的分析来估计流感病毒滴度有了很好的了解。该技术的视觉演示至关重要，因为使用 corp 成像仪可能很困难，这将有助于简化和演示我们在 96 或 384 孔板中定量病毒滴度的方法。

最后，不要忘记与病毒打交道可能非常危险，在执行此程序时应始终携带个人防护设备等前体。