Name: 流感病毒的高通量检测方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解基于红外染料成像系统的高通量检测流感病毒方法，使用MDCK细胞和Licor Odyssey扫描仪定量分析小鼠支气管肺泡灌洗液中的H1N1病毒滴度。该技术具有高灵敏度、高重复性，仅需微量样本即可实现精准定量，适用于96或384孔板同时筛查多种病原体，为呼吸道病毒疾病的诊断和治疗提供可靠工具。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01 A1064826-01、U19 AI062627-01 和 NO1-HHSN26600500032C（授予 S.M.）。我们感谢实验室成员提供的讨论和技术支持，感谢 Tina Heil 对稿件的审阅。我们还要感谢 David Bina 及密尔沃基卫生局实验室在病毒培养和 PCR 检测方面提供的帮助。

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<li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li>
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<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li>
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<li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li>
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我们没有需要披露的内容。

东南亚地区近期暴发的禽流感疫情以及全球对甲型H1N1流感大流行的担忧，给公共卫生与安全带来了巨大挑战。目前的研究重点集中在开发针对现有及新型流感病毒株的疫苗。快速、高通量的技术若能实现精确检测和准确的病毒滴度计算，将极大改善治疗效果。目前用于测定病毒滴度的最常用技术包括噬斑形成试验和流感病毒血凝试验。噬斑形成试验最初用于测定噬菌体滴度，后由Renato Dulbecco改进，用于测定动物病毒滴度4。该实验的操作步骤为：对流感病毒原液或动物样本（如支气管肺泡灌洗液）进行10倍系列稀释，取0.1 ml等分试样接种于6孔板中的MDCK细胞单层上。让病毒吸附至MDCK细胞后，加入营养培养基和琼脂糖。在孵育过程中，最初被感染的细胞释放出子代病毒，仅扩散至邻近细胞。流感病毒感染引起的细胞病变效应形成圆形的感染细胞区域，称为噬斑。每个噬斑理论上由单个病毒颗粒感染单个细胞并复制后形成。可通过结晶紫等染料增强活细胞与噬斑之间的对比度。该方法的主要缺点是重复性差，实验内变异幅度大。另一种用于测定流感病毒滴度的实验是血凝试验。流感病毒表面的血凝素蛋白可高效结合哺乳动物和禽类红细胞表面含N-乙酰神经氨酸的蛋白质1。流感病毒与红细胞之间的这种相互作用导致形成晶格状的凝集现象。通过观察凝集程度，可估算待测样本中流感病毒的滴度。红细胞凝集试验仅可用于已知病毒的滴定，不能用于病毒株的鉴定。由于该试验无法区分活病毒与死病毒，因此难以获得精确的病毒滴度计算结果。
目前流感感染的临床诊断主要基于血清学检测、聚合酶链式反应（PCR）、直接标本免疫荧光以及细胞培养方法1,6。本文所描述的新方法也具有临床和实验室诊断潜力。流感检测试剂盒Directigen FLU-A（BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）和BinaxNow（Binax, Inc.，美国缅因州斯卡伯勒）采用免疫层析法检测病毒抗原，例如核蛋白7。使用这些试剂盒可在15分钟内完成病毒检测；然而，所有阴性样本仍需通过细胞培养法进一步筛查。多项研究也报道了这些试剂盒的敏感性较低，尤其是在感染较轻或病毒载量较低的情况下8。在我们的方法中，可稳定检测低至100 PFU的病毒量。这表明该技术在临床样本中检测H1N1病毒时具有实用性，即使在感染较轻微的情况下也能有效检出。已有研究报道基于荧光的方法用于检测病毒抗原，该方法可直接分析鼻咽抽吸物标本，或将标本接种至易感细胞单层以进行病毒增殖及后续分析9。然而，这些方法在诊断应用上存在局限性，且不适用于病毒滴度的定量。定量PCR（Q-PCR）虽可鉴定病毒RNA的存在，但无法评估活病毒的感染能力。与上述检测方法相比，基于红外染料（IR dye）的检测系统更有利于在临床和实验室样本中实现病毒的检测与病毒滴度的定量。在流感暴发期间，短时间内诊断数千份样本至关重要。本方法基于384孔板和红外扫描仪，可同时扫描6块板（&gt;2,000个样本），因此相较于其他直接荧光检测方法具有显著优势。快速处理大量临床样本的可行性有助于降低检测变异度、缩短检测时间并减少成本。使用M2特异性抗体的优势在于其不受H和N蛋白株系差异的影响。M2蛋白在大多数感染人类的流感病毒株中相对保守。若将针对流行株系的特异性抗体与本系统结合，即可同时测定病毒滴度并鉴定病毒株系。然而，由于M2是金刚烷胺类药物的作用靶点，可能产生突变，从而改变本研究中所用单克隆抗体的结合位点。这在正在接受此类药物治疗的个体中可能构成该系统的潜在局限性。
检测样本中流感病毒滴度的测定方法有多种。为计算病毒滴度，50%组织培养感染剂量（TCID50）和基于鸡胚尿囊液的检测方法被广泛使用1,10。然而，这些方法需要数天时间，因此可靠性较低。此外，这些方法基于噬斑数量50%变化的计算，仅提供理论值，无法获得准确的病毒滴度。噬斑形成实验可在96小时内完成，但在病毒滴度计算中缺乏可重复性是一个主要问题。本文所述的现有技术具有若干显著优势。首先，该技术具有高度可重复性，结果稳定一致。其次，病毒滴度的计算基于荧光强度的简单定量，并与已定义的标准曲线进行比较。第三，可在同一样本中使用两种或多种一抗来诊断多个血清型。此外，红外染料偶联抗体具有极低的自发荧光，已用于细胞成像11。由于存在高量子产率的内源性荧光物质，紫外或可见光辐射（300–600 nm）会导致细胞产生强烈的自发荧光。这些物质包括芳香族氨基酸、脂色素、吡啶核苷酸（NADPH）、弹性蛋白、胶原蛋白和黄素辅酶。细胞的这一固有特性使得难以利用这些辐射源作为探针来定量特定蛋白的表达。相比之下，近红外染料的激发和发射波长范围为670–1000 nm。许多宿主细胞分子和多环芳烃在此波长下不被激发，且由于光散射减少，产生的背景荧光极低。此外，由于近红外荧光染料具有高消光系数，背景信号与特异性检测信号之间的窗口显著扩大。光稳定性高、信噪比优异，对于病毒滴度的定量极为重要。使用微流控腔室可通过机器人控制实现筛选过程的自动化，从而更便捷地检测高传染性的临床样本。因此，在这些方法中使用近红外染料是理想且高度可靠的技术，可用于组织样本中病毒滴度的定量。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11750</td><td></td></tr><tr><td>PR8 病毒</td><td></td><td></td><td>来自 Dr Thomas M Moran</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IRDye@800</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey 红外扫描仪</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>384 孔平底板</td><td>Nalge Nunc International</td><td>164730</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>Nalge Nunc International</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Invitrogen</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 100x</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>抗 M-2 抗体</td><td></td><td></td><td>来自 Dr Thomas M Moran</td></tr><tr><td>抗 NP 单克隆抗体</td><td>CDC</td><td>V2S2208</td><td>通过 MTA 获得</td></tr></tbody></table>

高通量流感病毒检测方法

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

流感病毒是一种呼吸道病原体，每年在世界多个地区引起高度的发病率和死亡率。因此，准确鉴定感染毒株并快速对大量临床样本进行高通量筛查，对于控制大流行性感染的传播至关重要。目前临床对流感病毒感染的诊断主要基于血清学检测、聚合酶链式反应、直接标本免疫荧光检测以及细胞培养1,2。
本文报道了一种用于检测活体流感病毒的新型诊断技术的开发。我们采用鼠适应性人源 A/PR/8/34（PR8，H1N1）病毒3，利用 MDCK 细胞4对该技术的有效性进行测试。将 MDCK 细胞（每孔 104 或 5 × 103）培养于 96 孔或 384 孔板中，接种 PR8 病毒后，使用抗 M2 抗体进行检测，随后使用红外染料标记的二抗。M25 和血凝素1 是多种不同诊断检测中常用的两种主要标志蛋白。采用红外染料标记的二抗可最大程度降低其他荧光染料所引起的自发荧光。使用抗 M2 抗体使我们能够将抗原特异性荧光强度作为病毒数量的直接度量指标。为了量化荧光强度，我们采用了基于 LI-COR Odyssey 的红外扫描仪。该系统利用双通道激光红外检测技术识别荧光染料，并将其与背景噪声区分开来。第一通道激发波长为 680 nm，发射波长为 700 nm，用于量化背景信号。第二通道检测激发波长为 780 nm、发射波长为 800 nm 的荧光染料。在红外扫描仪中对 PR8 感染的 MDCK 细胞进行扫描，结果显示荧光强度与病毒滴度呈依赖性增强。从 102–105 PFU 起，荧光强度与病毒滴度之间的正相关性可被持续观察到。在 102–103 PFU 的 PR8 病毒滴度下，仍可观察到微弱但可检测的阳性信号，表明近红外染料具有高灵敏度。通过比较模拟感染或同型抗体处理的 MDCK 细胞，确定了信噪比。
利用96孔或384孔板的荧光强度数据，我们构建了标准滴定曲线。在这些计算中，第一个变量为病毒滴度，第二个变量为荧光强度。因此，我们采用指数分布进行曲线拟合，以确定病毒滴度与荧光强度之间的多项式关系。综上所述，我们得出结论：基于红外染料的蛋白质检测系统有助于诊断感染性病毒株，并能精确测定感染性病原体的滴度。

本方法描述了利用基于红外染料的成像系统，以高灵敏度检测感染小鼠支气管肺泡灌洗（BAL）液中的H1N1病毒。该方法可在96孔或384孔板中进行，所需检测样品体积小于&lt;10 μl，且具备同时筛查多种病原体的潜力。

流感病毒是一种呼吸道病原体，每年在世界多个地区导致较高的发病率和死亡率。因此，……

本实验的总体目标是高效定量感染小鼠呼吸道中的流感病毒滴度。首先在选定的时间点通过鼻内接种的方式使小鼠感染流感病毒。处死小鼠后收集支气管肺泡灌洗液（BAL 液）。随后利用 BAL 液感染 MDCK 细胞。感染的细胞可使用特异性一抗对病毒蛋白进行染色，再用红外标记的二抗进行孵育。使用Lycor Odyssey扫描仪读取红外信号，并可利用Odyssey软件确定病毒滴度。通过标准曲线，可实现对病毒滴度的定量测定。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够精确量化病毒滴度、具有良好的重复性，以及仅需少量样本体积即可完成检测。该技术的潜在应用可拓展至多种呼吸道病毒性疾病的诊断与治疗，因为通过该方法可对临床样本中的病毒滴度进行定量。在完成该操作步骤后，还可采用其他方法（如定量PCR）来回答更多问题，例如病毒拷贝数。在实施该技术时，重要的是务必在实验完成后检测滴度标准对照病毒。该技术为病毒学领域的研究人员探索临床样本中的病毒滴度或检测病毒蛋白铺平了道路。掌握该技术后，可在17小时内完成操作。首先，以每只小鼠5,000个感染形成单位（PFU）的PR8流感病毒溶于30微升无菌PBS中，经鼻腔精确感染小鼠；对照组仅使用PBS作为阴性对照，用于收集安乐死动物的支气管肺泡灌洗液。随后，打开胸腔，用无菌精细剪刀在气管旁平行做一厘米切口以暴露气管。在气管上做一个小切口，用含有1% BSA的PBS溶液灌注气管，体积为0.5毫升，然后轻柔地吸出灌洗液。将支气管肺泡灌洗（BAL）液储存于-20摄氏度，用于后续定量分析灌洗液中的病毒滴度。首先，在T75培养瓶中加入20毫升完全RPMI培养基，接种500万个MDCK细胞，于37摄氏度培养过夜。次日收集细胞，并以每孔10,000个细胞的密度接种至光学平底黑色96孔板中。随后，在37摄氏度下将培养板孵育过夜。孵育结束后，轻柔吸除上清液，并用含0.2% BSA替代FBS的完全无血清DMEM洗涤细胞两次。细胞洗涤完成后，每孔加入50 µL BAL液体或含有已知病毒浓度的50 µL悬液。然后每孔加入 50 µL 含 TPCK 处理的胰蛋白酶（浓度为 0.2 µg/mL）的 DMEM 培养基，以促进病毒的吸附、进入和复制。将细胞在 37°C 下孵育 1 小时，使病毒充分吸附。随后每孔加入 100 µL 含胎牛血清（FBS）的完全 RPMI 培养基，过夜培养细胞，使感染在过夜孵育后得以传播。 用 100 微升 1% B-S-A-P-B-S 洗涤细胞。细胞洗涤后，每孔加入 100 微升 1% 多聚甲醛，在室温下孵育 5 分钟以固定细胞。随后用每孔 100 微升 1% B-S-A-P-B-S 洗涤，并将细胞在室温下继续孵育 30 分钟以进行封闭。细胞封闭完成后，每孔加入 50 微升以 1:1000 稀释的一抗（抗病毒 M 二抗体），在室温下孵育 1 小时，以标记任何存在的病毒蛋白。孵育后，用 1% B-S-A-P-B-S 将细胞洗涤三次，然后在避光条件下，每孔加入 100 微升以 1:200 稀释的红外荧光染料标记的二抗，在室温下孵育 1 小时。细胞染色后，按前述方法洗涤三次。然后将培养板放置在 Licor Odyssey 红外扫描仪的读取玻璃平台上。使用 Licor Odyssey 软件在读取仪上选择 96 孔板设置。确定空白阴性对照孔，然后对整块板的荧光信号进行定量分析。使用自动图形工具在检测孔的中央绘制感兴趣区域（ROI）。我们将使用阴性对照的 ROI 来设定该检测的基线荧光值，然后在 ROI 内引入 Odyssey 软件提供的两条相互垂直的十字准线，以测量整个孔内荧光的强度。接下来，使用780纳米通道进行检测，680纳米作为参考波长，对微孔板进行扫描。激活读数命令后，将对感兴趣区域（ROI）内等间距位置的荧光强度进行测量，然后对采集到的数据点进行积分。标准差倍数将决定在 ROI 中包含的相对于基线的信号水平；请务必选择“积分荧光强度”选项进行计算，因为它表示定义区域内与面积无关的净像素体积。背景荧光将从模拟感染的对照组中定量，并用于估算检测孔中的积分荧光强度。来自含有系列稀释滴定病毒的重复孔的红外荧光将用于构建标准曲线。随后可利用标准曲线测定感染小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中的病毒滴度。本实验中，第2天和第4天的病毒载量显著升高。如图所示，感染后病毒在第10天已被清除。使用该检测方法测得的病毒滴度与感染后小鼠的体重减轻情况具有良好的相关性。该技术也可应用于人源样本。此处展示的是从一个人类鼻拭子样本中定量检测H1N1病毒的结果。此处的检测下限为 10 的 3 次方 TCID（组织培养感染剂量）。观看本视频后，您将充分了解如何利用基于红外染料的检测方法来估算流感病毒滴度。该技术的可视化演示至关重要，因为使用 Corp 成像仪可能较为困难，而本视频有助于简化并展示我们在 96 孔或 384 孔板中定量病毒滴度的方法。最后，请务必注意，操作病毒可能具有极高的危险性，进行此实验时应始终采取适当的预防措施，例如穿戴个人防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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