高通量流感病毒检测方法

本实验的总体目标是高效定量感染小鼠呼吸道中的流感病毒滴度。首先在选定的时间点通过鼻内接种的方式使小鼠感染流感病毒。

处死小鼠后收集支气管肺泡灌洗液（BAL 液）。随后利用 BAL 液感染 MDCK 细胞。感染的细胞可使用特异性一抗对病毒蛋白进行染色，再用红外标记的二抗进行孵育。

使用Lycor Odyssey扫描仪读取红外信号，并可利用Odyssey软件确定病毒滴度。通过标准曲线，可实现对病毒滴度的定量测定。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够精确量化病毒滴度、具有良好的重复性，以及仅需少量样本体积即可完成检测。

该技术的潜在应用可拓展至多种呼吸道病毒性疾病的诊断与治疗，因为通过该方法可对临床样本中的病毒滴度进行定量。在完成该操作步骤后，还可采用其他方法（如定量PCR）来回答更多问题，例如病毒拷贝数。在实施该技术时，重要的是务必在实验完成后检测滴度标准对照病毒。

该技术为病毒学领域的研究人员探索临床样本中的病毒滴度或检测病毒蛋白铺平了道路。掌握该技术后，可在17小时内完成操作。首先，以每只小鼠5,000个感染形成单位（PFU）的PR8流感病毒溶于30微升无菌PBS中，经鼻腔精确感染小鼠；对照组仅使用PBS作为阴性对照，用于收集安乐死动物的支气管肺泡灌洗液。随后，打开胸腔，用无菌精细剪刀在气管旁平行做一厘米切口以暴露气管。

在气管上做一个小切口，用含有1% BSA的PBS溶液灌注气管，体积为0.5毫升，然后轻柔地吸出灌洗液。将支气管肺泡灌洗（BAL）液储存于-20摄氏度，用于后续定量分析灌洗液中的病毒滴度。首先，在T75培养瓶中加入20毫升完全RPMI培养基，接种500万个MDCK细胞，于37摄氏度培养过夜。次日收集细胞，并以每孔10,000个细胞的密度接种至光学平底黑色96孔板中。

随后，在37摄氏度下将培养板孵育过夜。孵育结束后，轻柔吸除上清液，并用含0.2% BSA替代FBS的完全无血清DMEM洗涤细胞两次。细胞洗涤完成后，每孔加入50 µL BAL液体或含有已知病毒浓度的50 µL悬液。

然后每孔加入 50 µL 含 TPCK 处理的胰蛋白酶（浓度为 0.2 µg/mL）的 DMEM 培养基，以促进病毒的吸附、进入和复制。将细胞在 37°C 下孵育 1 小时，使病毒充分吸附。随后每孔加入 100 µL 含胎牛血清（FBS）的完全 RPMI 培养基，过夜培养细胞，使感染在过夜孵育后得以传播。

用 100 微升 1% B-S-A-P-B-S 洗涤细胞。细胞洗涤后，每孔加入 100 微升 1% 多聚甲醛，在室温下孵育 5 分钟以固定细胞。随后用每孔 100 微升 1% B-S-A-P-B-S 洗涤，并将细胞在室温下继续孵育 30 分钟以进行封闭。细胞封闭完成后，每孔加入 50 微升以 1:1000 稀释的一抗（抗病毒 M 二抗体），在室温下孵育 1 小时，以标记任何存在的病毒蛋白。孵育后，用 1% B-S-A-P-B-S 将细胞洗涤三次，然后在避光条件下，每孔加入 100 微升以 1:200 稀释的红外荧光染料标记的二抗，在室温下孵育 1 小时。细胞染色后，按前述方法洗涤三次。

然后将培养板放置在 Licor Odyssey 红外扫描仪的读取玻璃平台上。使用 Licor Odyssey 软件在读取仪上选择 96 孔板设置。确定空白阴性对照孔，然后对整块板的荧光信号进行定量分析。

使用自动图形工具在检测孔的中央绘制感兴趣区域（ROI）。我们将使用阴性对照的 ROI 来设定该检测的基线荧光值，然后在 ROI 内引入 Odyssey 软件提供的两条相互垂直的十字准线，以测量整个孔内荧光的强度。

接下来，使用780纳米通道进行检测，680纳米作为参考波长，对微孔板进行扫描。激活读数命令后，将对感兴趣区域（ROI）内等间距位置的荧光强度进行测量，然后对采集到的数据点进行积分。

标准差倍数将决定在 ROI 中包含的相对于基线的信号水平；请务必选择“积分荧光强度”选项进行计算，因为它表示定义区域内与面积无关的净像素体积。背景荧光将从模拟感染的对照组中定量，并用于估算检测孔中的积分荧光强度。来自含有系列稀释滴定病毒的重复孔的红外荧光将用于构建标准曲线。

随后可利用标准曲线测定感染小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中的病毒滴度。本实验中，第2天和第4天的病毒载量显著升高。如图所示，感染后病毒在第10天已被清除。

使用该检测方法测得的病毒滴度与感染后小鼠的体重减轻情况具有良好的相关性。该技术也可应用于人源样本。此处展示的是从一个人类鼻拭子样本中定量检测H1N1病毒的结果。

此处的检测下限为 10 的 3 次方 TCID（组织培养感染剂量）。观看本视频后，您将充分了解如何利用基于红外染料的检测方法来估算流感病毒滴度。该技术的可视化演示至关重要，因为使用 Corp 成像仪可能较为困难，而本视频有助于简化并展示我们在 96 孔或 384 孔板中定量病毒滴度的方法。

最后，请务必注意，操作病毒可能具有极高的危险性，进行此实验时应始终采取适当的预防措施，例如穿戴个人防护装备。