JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

نماذج مامي لتصوير الخلايا الحية 4D من ورم: التفاعلات المكروية أن التقدم تأثير الخبيثة

1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2

1Department of Pharmacology, Wayne State University, 2Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.82.77.50, User IP: 54.82.77.50, User IP Hex: 911363378

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    قمنا بتطوير نماذج coculture 3D لحية خلية التصوير في الوقت الحقيقي من التفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية الأخرى في المكروية في أن تقدم إلى تأثير النمط الظاهري الغازية. ويمكن لهذه النماذج بمثابة الشاشات قبل السريرية على المخدرات لاستهداف نظير الصماوي التي يسببها بروتين، chemokine / خلوى وكيناز المسارات المتورطين في الغازية.

    Date Published: 2/17/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3661

    Cite this Article

    Sameni, M., Anbalagan, A., Olive, M. B., Moin, K., Mattingly, R. R., Sloane, B. F. MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression. J. Vis. Exp. (60), e3661, doi:10.3791/3661 (2012).

    Abstract

    قمنا بتطوير نماذج coculture 3D، والتي نحن مامي مصطلح (م 1 عماري rchitecture وم ngineering icroenvironment ه)، واستخدموه لحية خلية التصوير في الوقت الحقيقي من الخلية: التفاعلات الخلية. وكان هدفنا العام لتطوير النماذج التي تلخص في الهندسة المعمارية من آفات الثدي سابق للغزو لدراسة تقدم بها إلى النمط الظاهري الغازية. على وجه التحديد، قمنا بتطوير نماذج لتحليل التفاعلات بين المتغيرات الثدي ما قبل الخبيثة الخلايا الظهارية وأنواع أخرى من الخلايا السرطانية التي المكروية قد تورطت في تعزيز أو الحد من تطور خلايا الثدي الظهارية سابق للغزو لسرطان الأقنية الغازية. أنواع الخلايا الأخرى دراسته حتى الآن هي خلايا myoepithelial، الخلايا الليفية، الضامة والدم والخلايا اللمفاوية الاوعية الدموية الدقيقة البطانية. بالإضافة إلى نماذج مامي، والتي تهدف إلى تلخيص التفاعلات الخلوية داخل الثدي خلالتطور السرطان، وقمنا بتطوير نماذج قابلة للمقارنة لتطور سرطان البروستاتا.

    نحن هنا لتوضيح الإجراءات اللازمة لإنشاء cocultures 3D جنبا إلى جنب مع استخدام خلايا حية التصوير وفحص التحلل البروتيني وظيفي لمتابعة عملية الانتقال من cocultures من سرطان الثدي الأقنية في الموقع (DCIS) الخلايا والخلايا الليفية إلى النمط الظاهري الغازية على مر الزمن، في هذه الحالة أكثر من 23 أيام في الثقافة. وcocultures مامي تتكون من طبقات متعددة. هي جزء لا يتجزأ الليفية في الطبقة السفلى من النوع الأول من الكولاجين. يتم وضعها على أن طبقة من الغشاء القاعدي المعاد (RBM) في الخلايا التي بذرت DCIS. يتم تضمين طبقة أعلى من الإدارة القائمة على النتائج النهائية 2٪، وتتجدد مع كل تغيير في وسائل الاعلام. إلى التحلل البروتيني صورة المرتبطة تقدم إلى النمط الظاهري الغازية، ونحن نستخدم صبغ مروي (DQ) فلوري البروتينات المصفوفة (DQ-الكولاجين أنا مختلطة مع طبقة من الكولاجين وأنا الرابع DQ-الكولاجين مختلطة مع طبقة وسطى من الميزانية العاديةم) ومراعاة الثقافات الحية باستخدام متحد البؤر المجهري. ويتم التقاط المقاطع البصرية، ومعالجتها وإعادة بنائها في 3D مع برنامج التصور Volocity. على مدار 23 يوما في cocultures مامي، والخلايا DCIS تتكاثر وتتجمع في الهياكل الغازية الكبيرة. الليفية الهجرة ويندمج في هذه الهياكل الغازية. تم العثور على شظايا بروتين فلوري من collagens بالتعاون مع سطح هياكل DCIS، intracellularly، وفرقت أيضا في جميع أنحاء المصفوفة المحيطة بها. الأدوية التي بروتين الهدف، chemokine / خلوى وكيناز المسارات أو تعديلات في تركيبة الخلوية من cocultures يمكن أن تقلل من الغازية، مما يوحي بأن ويمكن استخدام نماذج مامي والشاشات قبل السريرية للنهج علاجية جديدة.

    Protocol

    1. إعداد DQ-ركائز

    1. تسمح مجفف بالتجميد DQ-ركائز لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح قارورة، وإعداد حل الأوراق المالية من 1 ملغ / مل من DQ-الركيزة في الماء منزوع الأيونات، الفجوة إلى 50 aliquots ميكرولتر ومخزن في درجة مئوية 4

    قد يكون من الضروري للتحريض DQ-الركيزة في حمام ماء الموجات فوق الصوتية ل~ 5 دقائق والحرارة إلى 50 درجة مئوية لتسهيل تشتت.

    1. الإدارة المستندة إلى النتائج ذوبان الجليد بين عشية وضحاها في يوم 4 درجات مئوية، وينبغي أن تعالج الإدارة على أساس النتائج على الجليد في جميع الأوقات.
    2. لجعل الفوسفات 10X مخزنة المالحة (PBS)، ويحل 80 جم كلوريد الصوديوم (1.37 م)، 2 غرام بوكل (0،027 م)، 14،4 ز نا 2 هبو 4 (1 م)، و 2.4 غرام KH 2 PO 4 (0.02 م) في 800 مل من الماء عالى النقاء. ضبط درجة الحموضة من حل العازلة في برنامج تلفزيوني إلى 7.4 مع 1.0 M حمض الهيدروكلوريك. جلب إلى حجم 1 لتر، تعقيم بواسطة الترشيح.
    3. إعداد الكولاجين أنا حل على الجليد: 8 أجزاء من الكولاجين المبردة أنا إلى 1 جزء من برنامج تلفزيوني 10X مبردة. ضبط درجة الحموضةمن خليط من 7،2-7،6 باستخدام معقم 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم. فحص درجة الحموضة مع شرائح الأس الهيدروجيني وضبط مستوى الصوت النهائي إلى 10 أجزاء مع الماء المعقم.
    4. إعداد DQ-الكولاجين قلت: أنا الكولاجين المصفوفة تمييع DQ-الكولاجين أنا في حل أنا الكولاجين في أنبوب prechilled إلى تركيز النهائي من 25 ميكروغرام / مل و 2.4 ملغ / مل، على التوالي.
    5. إعداد DQ-الكولاجين الرابع: المعاد الغشاء القاعدي (RBM) المصفوفة تمييع DQ-الكولاجين الرابع في الإدارة على أساس النتائج (Cultrex أو Matrigel) في أنبوب prechilled إلى تركيز النهائي من 25 ميكروغرام / مل و 12-15 ملغ / مل، على التوالي. خلط على الجليد باستخدام pipetting لطيف لتجنب خلق الفقاعات.

    2. إعداد مامي cocultures

    انظر الشكل 1 للحصول على رسم تخطيطي لcocultures.

    1. 2 مكان coverslips بلاستيكية مستطيلة (تعقيمها في الكحول 70٪ لمدة 10 دقيقة وتجفف في الهواء) في طبق ثقافة 35 ملم أو استخدام IbiTreat 35 ملم μ-الصحن. الاتجاهات هنا لكلا coverslips وμ صحون، والتي نستخدمها لستويموت على مجهر تستقيم. لإجراء دراسات على مجهر مقلوب، ونحن نستخدم فقط μ-صحون.
    2. مزيج من الرقم المطلوب من الخلايا الليفية مع DQ-الكولاجين قلت: أنا الكولاجين المصفوفة. لcocultures على المدى الطويل هو موضح في الشكلين 2 و 3، ونحن نستخدم 500 الليفية في 10 ميكرولتر من وسائل الإعلام بالإضافة إلى 60 ميكرولتر من DQ-الكولاجين قلت: أنا الكولاجين المصفوفة.
    3. باستخدام micropipettor 100 ميكروليتر، ماصة بعناية ونشر 70 ميكرولتر من الخلايا الليفية: DQ-الكولاجين قلت: أنا الكولاجين مصفوفة على سطح كامل من كل ساترة، وترك على 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بدون CO 2 لمدة 30 دقيقة ليصلب.
    4. نقل 35 ملم الأطباق التي تحتوي على coverslips إلى 37 درجة مئوية مع حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 لمدة 10 دقيقة لكي تتوازن.
    5. إزالة من الحاضنة وترك الأطباق 35 ملم تحت غطاء محرك السيارة حتى وصولها إلى درجة حرارة الغرفة.
    6. إضافة 60 ميكرولتر من DQ-الكولاجين الرابع: الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة على رأس أنا DQ-طدت الكولاجين: الكولاجين أنا مع مصفوفة الخلايا الليفية المضمنة. مع ماصة معلومات سرية، كاليفورنيانشر refully DQ-الكولاجين الرابع: الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة بالتساوي، وتجنب خدش الليفية: DQ-الكولاجين قلت: أنا الكولاجين المصفوفة.
    7. نقل 35 ملم الأطباق التي تحتوي على coverslips إلى 37 درجة مئوية مع حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 لمدة 10 دقيقة ليصلب. في حين ان الرابع DQ-الكولاجين: الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة وترسيخ، ويعرض للتريبسين عد الخلايا الظهارية.
    8. 50 ميكرولتر مكان لتعليق الخلايا الظهارية / ورم على coverslips المغلفة مع DQ-الكولاجين الرابع: الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة. مكان 35 ملم الأطباق التي تحتوي على coverslips في الحاضنة 37 درجة مئوية. تسمح 40-60 دقيقة للحصول على الخلايا لنعلق على DQ-الكولاجين الرابع: الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة. لcocultures على المدى الطويل هو موضح في الشكلين 2 و 3، ونحن نستخدم 2500 الخلايا الظهارية أو ورم.
    9. أضف 2 مل من وسط ثقافة الإدارة القائمة على النتائج التي تحتوي على 2٪ على كل طبق من 35 ملم. إذا فعل أي أدوية، يجب إضافة الأدوية في هذا الوقت.
    10. احتضان لفترة من الوقت المطلوب قبل التصوير. على المدى الطويل الثقافات، يجب تغيير وسائل الاعلام كل 3-4 أيام. يمكن الحفاظ على الخلايافي وسط ثقافتهم طبيعي. لcocultures مامي من خطوط الخلايا الثدي، ونحن نستخدم متوسطة بصل طلائي (MEBM-PRF) تستكمل مع SingleQuots MEGM.

    3. أداء 4D (3D + وقت) التصوير من cocultures مامي الحية متحد البؤر المجهري

    1. للدراسات إثبات صحة المبدأ يتضح، وصفت مامي cocultures مع صبغة خلية تتبع فلوري وفقا للإجراءات لدينا نشرت 1. بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني، وحضنت cocultures مع 5 ميكرون البرتقال CellTracker في المتوسط ​​MEGM لمدة 45 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية، وغسلها مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني وحضنت مع MEGMmedium prewarmed لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ حاضنة CO 2 قبل التصوير .
    2. صورة مامي cocultures نعيش في تضخم منخفضة (10X عدسة المياه، وغمس) على مجهر LSM-510 زييس META مبائر.
    3. ويتم التقاط المقاطع البصرية على فترات طوال عمق كامل للهياكل. للدراسات دينا، ونحن التقاط المقاطع البصرية بنسبة 10ميكرومتر فترات.
    4. استخدام المقاطع البصرية لإعادة بناء الصور في 3D. ونحن نستخدم برامج Volocity لتوليد اعادة البناء 3D.
    5. صنع أفلام من اعادة البناء 3D بحيث الهياكل، الخلية: التفاعلات الخلية والتفاعلات مع المصفوفات المحيطة يمكن تصور. التي قطعناها على أنفسنا أفلام مع لاعب QuikTime 7.

    4. ممثل النتائج

    وcocultures مامي أننا المتقدمة هي نموذج تجريبي للين العريكة الخلية الحية التصوير في الوقت الحقيقي من التفاعلات بين المكونات الخلوية المختلفة التي تتألف منها وجود ورم الثدي والمكروية لها. هنا علينا أن نبرهن على قدرة النماذج مامي أن ألخص الخلية: التفاعلات الخلية خلال التقدم من سرطان الثدي والتصوير الخلية الحية لمتابعة هذه التفاعلات مع مرور الوقت. نحن توضيح القدرة على التفاعل بين صورة الإنسان MCF10.DCIS سابق للغزو الثدي خط الخلية، وسرطان الثدي البشرية المرتبطة خط الليفية، WS-12Ti، أكثر منلفترة اكثر من ثلاثة اسابيع في الثقافة. تم تصوير هذا cocultures في 16 و 3 و 23 يوما. وأعيد بناء المقاطع البصرية من خلال وحدة التخزين بالكامل من cocultures في أمثلة 3D وممثل وتظهر لكل من timepoints الثلاثة في الشكل 2. ومضان أحمر في الشكل رقم 2 يمثل MCF10.DCIS والخلايا WS-12Ti. على التمييز بين أنواع الخلايا اثنين وعلى المدى الطويل cocultures، يمكن للمرء أن transfect أو transduce أنواع الخلايا الفردية مع البروتينات الفلورية قبل وضع الثقافات. ويتضح ان coculture مامي من الخلايا MCF10.DCIS و WS-12Ti التي وصفت بشكل مختلف مع البروتينات الفلورية لتحديد الهوية في الشكل 3.

    من ركائز تتضمن، في هذه الحالة DQ-collagens، في cocultures مامي، يمكننا تقييم وتحديد التغيرات على مر الزمن في التحلل البروتيني المرتبطة الانتقال إلى النمط الظاهري الغازية. أقمنا أساليب لقياس المنتجات انشقاق فلوري أن النتيجةمن DQ-الكولاجين تدهور 2،3. نحن تطبيع المنتجات في جميع أنحاء تدهور حجم 3D كاملة من cocultures مامي على أساس خلية في وصفها من قبل والعد نوى الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكننا أن توطين تدهور إلى مقصورات خارج الخلية وبين الخلايا وتحديد مجموع والمنتجات تدهور داخل وخارج الخلية كما وصفناها سابقا 2. ومضان أخضر في أرقام 2 و 3 تمثل المنتجات انشقاق من ركائز DQ-2 الكولاجين. في هذا الوقت، collagens تفاضلي المسمى ليست متاحة من شأنها أن تسمح لنا أن نميز بين تدهور الكولاجين النوع الرابع وتدهور الكولاجين من النوع الأول.

    التفاعلات في cocultures مامي هي دينامية، ويمكن أن تتغير بمرور الوقت. للحصول على المعلومات الزمانية والدينامية، لا يمكن للنفس الحقل من مشاهدة المقاطع المصورة تكون والبصرية من خلال أخذ عينة من كامل حجم مرارا وتكرارا على مدى فترة من الوقت من دقائق إلى أسابيع،وبالتالي جمع البيانات في D-4. في الشكل 2، ونحن لتوضيح التغيرات الهائلة التي تحدث وليس أكثر من 23 أيام: التغيرات في عدد الخلايا، والهجرة الخلية والتفاعلات الخلية، بنية وحدات التخزين، والأشكال هيكل، والانحرافات من الهياكل من كروية، الامتداد الغازية والتحلل البروتيني. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن أيضا إجراء تغيير شامل في حجم بسبب cocultures مامي المهينة المحيطة بها المصفوفة خارج الخلية خلال هذه الفترة الزمنية. في ثلاثة أيام كما هو موضح في الشكل 2A، وحجم هو 110000 ميكرون 3. في المقابل، فإن حجم cocultures مامي في 16 و 23 يوما ليست سوى 46250 ميكرون كما هو موضح في 2B أرقام وجيم.

    الشكل 1
    الشكل 1. رسم تخطيطي من cocultures مامي. وهي مغلفة ساترة البلاستيك مع الكولاجين الأول، الذي يتضمن DQ-الكولاجين أنا والخلايا الليفية (أرجواني). وهناك طبقة من الغشاء القاعدي 2 المعاد (RBM) التي تحتوي على DQ كولونيليضاف لاجين الرابع. ومطلي الخلايا السرطانية (الحمراء) على رأس والإدارة على أساس النتائج 2٪ في وسائل الاعلام الثقافة هي متراكبة (بقع بيضاء) مع كل تغيير وسائل الإعلام. الأخضر يمثل المنتجات انشقاق فلوري من DQ-الكولاجين الأول والرابع.

    الشكل 2
    الشكل 2. مامي cocultures من خلايا سرطان الثدي البشرية وMCF10.DCIS WS-12Ti الليفية الثدي البشري. كانت جزءا لا يتجزأ من الخلايا الليفية في الكولاجين I / DQ-الكولاجين أنا ومتراكبة مع الإدارة على أساس النتائج التي تحتوي على الكولاجين DQ-IV. وفازت المصنفة ثم الخلايا DCIS على الإدارة على أساس النتائج ومتراكبة مع وسائل الإعلام التي تحتوي على 2٪ الإدارة القائمة على النتائج. على مدى 23 يوما في coculture يتضح هنا، كان هناك تكاثر الخلايا، وتدهور DQ-الكولاجين الرابع وأنا (الخضراء) والمصفوفات الكولاجين كما يدل على ذلك انخفاض في حجم cocultures. تم ترجمة الخلايا عن طريق وصفها مع البرتقال CellTracker في الموقع قبل التصوير (الحمراء). وقد لوحظت في cocultures نفسه يعيش على مدى 23 يوما مع الصور الملتقطة بواسطة جonfocal المجهري في 3 و 16 و 23 يوما من coculture. وأعيد بناء شرائح الضوئية الناتجة في 3D مع برنامج Volocity. التكبير، 10X.

    الشكل (3)
    الشكل 3. cocultures مامي يوم 16 من خلايا سرطان الثدي البشرية وMCF10.DCIS WS-12Ti الليفية الثدي الإنسان التي تعبر عن طلب تقديم العروض (أحمر) وYFP (أبيض)، على التوالي. وأنشئت Cocultures وتحليلها كما في الشكل رقم 2. كانت أنواع الخلايا جهازي المبينة هنا، ومع ذلك، قد وصفت بشكل مختلف بحيث يمكن تمييزها عن بعضها البعض. الصور تضخم أعلى في هذا الرقم، مقارنة مع تلك الموجودة في الشكل 2، توضح التحلل البروتيني من DQ-الكولاجين الرابع على سطح الخلايا DCIS والتحلل البروتيني منتشر من DQ-الكولاجين أنا في مناطق قريبة من الخلايا الليفية. التكبير، 20X.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    كما ثبت، ويمكن استخدام cocultures مامي للخلية الحية التصوير في الوقت الحقيقي من التفاعلات بين المكونات الخلوية المختلفة التي تتألف منها وجود ورم الثدي والمكروية لها. في الدراسات الجارية في مختبرنا، وقد استخدمنا مامي cocultures لتحديد مسارات بروتين يرتبط مع الانتقال من DCIS لسرطان الأقنية الغازية، وكذلك التفاعلات بين مسارات بروتين ومسارات اخرى تشارك في هذه المرحلة الانتقالية مثل مسارات عامل chemokine / خلوى / نمو . نحن وأظهرت كذلك أن يمكن أن تستخدم النماذج مامي كأداة لفحص آثار مثبطات جزيء صغير، ومنع الأجسام المضادة أو shRNAs أن تعدل بروتين / chemokine / خلوى / نمو مسارات عامل 3-5. ويمكن استخدام نماذج مامي لحية خلية التصوير من نمو الورم، والغزو، والتحلل البروتيني أكثر من مرة تتراوح ما بين دقائق وساعات، كما بينا سابقا 6،7، لأسابيع كما هو موضح هنا في أرقام 2 و 3. والتفاعلات التي لاحظت ما بين الخلايا من نوع واحد، أي الخلايا السرطانية البشرية والخلايا السرطانية المرتبطة، بدلا من بين الخلايا السرطانية والخلايا البشرية الماوس اللحمية كما في التصوير intravital 8. نماذج مامي هي نظام لين العريكة. يمكن للجزيئات أن تكون مصلحة downregulated مع shRNAs في أنواع الخلايا الفردية قبل coculturing بحيث يمكن تصوير مساهمتها في ذلك نوع من الخلايا إلى تدهور DQ-collagens وكميا في 3D 2. ويمكن أخذ عينات من وسائل الإعلام مكيفة نماذج مامي لقياس التغيرات في إفراز البروتياز، السيتوكينات، وما إلى ذلك من المعلومات التي تم الحصول عليها توفر أساس تجريبي لاختبار آثار مثبطات جزيء صغير، ومنع الأجسام المضادة، الخ.

    ويمكن تكوين الخلوية من cocultures مامي التلاعب بها بسهولة بحيث يمكن لأحد أن استخدامها لتقييم مساهمة أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في الورم المكروية (على سبيل المثال، خلايا myoepithelial، وحيدات، الخلايا البطانية من الدمالسفينة وأصل اللمفاوية) لتقدم 6،7 الخبيثة. وعدد المصنفة خلية أنواع مختلفة، ونسبة من نوع خلية واحدة إلى آخر، وطول الوقت في ثقافة تعتمد على أنواع معينة من الخلايا المستخدمة ومسألة تجريبية. ويمكن أيضا نماذج مامي أن يمتد لتقييم آثار التغيرات في المكروية المحيطة أورام الثدي، على سبيل المثال، درجة الحموضة، وتوتر الأوكسجين. على سبيل المثال، لقد أظهرنا أنه عندما تتم المحافظة على الثقافات مامي في درجة الحموضة قليلا الحمضية، أي، ودرجة الحموضة 6.8، هناك زيادة في التحلل البروتيني والغازية. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا أيضا أن نتمكن من استخدام cocultures مماثل لنموذج أنواع أخرى من السرطان مثل سرطان البروستاتا.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    ليس لدينا ما يكشف.

    Acknowledgements

    وأيد هذا العمل، في جزء منه، من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 CA131990 (BFS وRRM). تم تنفيذ الخلية الحية التصوير في الموارد الأساسية الميكروسكوب والتصوير والخلوي المعتمدة، في جزء منه، من قبل المعاهد الوطنية للصحة مركز منحة P30 CA22453 لمعهد السرطان كارمانوس، جامعة ولاية واين، وفرع بحوث الفترة المحيطة بالولادة من المعاهد الوطنية للصحة الطفل والتنمية ، جامعة واين ستيت.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reconstituted basement membrane (Cultrex) Trevigen Inc. 3445-005-01 Comparable to Matrigel (BD Biosciences)
    Collagen I Cohesion Laboratories 5005-B
    DQ-substrates (collagen I, IV) Invitrogen DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052
    22-mm plastic coverslips Fisher Scientific 12-547 Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use.
    Cell culture medium Lonza Inc. MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 Phenol red-free
    ibiTreat μ-Dish Ibidi 80136
    Volocity software PerkinElmer, Inc. Version 5.5 Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies.

    References

    1. Sameni, M., Dosescu, J., & Sloane, B.F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2,159-175 (2003).
    2. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M.B., Moin, K., & Sloane, B.F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, 4.20.1-4.20.15 (2008).
    3. Jedeszko, C., Victor, B.C., Podgorski, I., & Sloane, B.F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
    4. Sameni, M., et al. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
    5. Li, Q., et al. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
    6. Sameni, M., et al. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
    7. Cavallo-Medved, D., et al. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
    8. Fukumura, D., et al. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter