JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Dutch was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

1, 1, 1

1Department of Biology, Johns Hopkins University

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.226.213.228, User IP: 54.226.213.228, User IP Hex: 920835556

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Onlangs high-throughput sequencing technologie is sterk toegenomen gevoeligheid van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) experiment en gevraagd de toepassing ervan met behulp van gezuiverde cellen of weefsel ontleed. Hier hebben we een methode om af te bakenen ChIP techniek te gebruiken met

    Date Published: 3/23/2012, Issue 61; doi: 10.3791/3745

    Cite this Article

    Tran, V., Gan, Q., Chen, X. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue. J. Vis. Exp. (61), e3745, doi:10.3791/3745 (2012).

    Abstract

    Epigenetica blijft een zich snel ontwikkelende veld dat bestudeert hoe de chromatine staat bijdraagt ​​aan de differentiële genexpressie in verschillende celtypen in verschillende ontwikkelingsstadia. Epigenetische regelgeving draagt ​​bij aan een breed spectrum van biologische processen, met inbegrip van cellulaire differentiatie tijdens de embryonale ontwikkeling en homeostase in de volwassenheid. Een kritische strategie in epigenetische studies is om te onderzoeken hoe verschillende histon modificaties en chromatine factoren genexpressie reguleren. Om dit aan te pakken, wordt chromatine immunoprecipitatie (ChIP) veel gebruikt om een ​​momentopname van de vereniging van specifieke factoren met DNA in de cellen van belang te verkrijgen.

    ChIP techniek maakt gebruik gewoonlijk gekweekte cellen als uitgangsmateriaal, dat kan worden verkregen in overvloed en homogeniteit reproduceerbaar te genereren. Er zijn echter verschillende nadelen: eerst het milieu cellen groeien in petrischaal verschilt van die in vivo, kan dusgeen afspiegeling van de endogene chromatine toestand van de cellen in een levend organisme. Ten tweede kunnen niet alle soorten van cellen gekweekt ex vivo. Er is slechts een beperkt aantal cellijnen, waarvan mensen genoeg materiaal ChIP assay verkrijgen.

    Hier beschrijven we een methode om ChIP experiment met behulp van Drosophila weefsels te doen. Het uitgangsmateriaal wordt ontleed weefsel van een levend dier kan dus nauwkeurig de endogene chromatine weerspiegelen. Het aanpassingsvermogen van deze methode met veel verschillende soorten weefsels kunnen de onderzoekers om veel meer biologisch relevante vragen met betrekking tot epigenetische regulatie in vivo 1, 2 aan te pakken. De combinatie van deze methode met high-throughput sequencing (ChIP-volgende) zal verder kunnen de onderzoekers om een ​​epigenomisch landschap te verkrijgen.

    Protocol

    (De hele chip procedure duurt ongeveer twee dagen. Voorbereiding van ChIP bibliotheken voor high-throughput sequencing duurt nog eens 2-3 dagen.)

    1. Ontleden en Bereid weefsel voor ChIP Experiment (~ 1 miljoen cellen)

    1. Ontleden weefsel van belang (bijvoorbeeld 200 paar van Drosophila testes) in koude PBS + 1x proteaseremmer (los 1 pellet van protease inhibitor cocktail in 1,5 ml 1x PBS om 7x voorraad oplossing te verkrijgen) + PMSF (uiteindelijke concentratie 100 ug / ml). Spoel tweemaal weefsel en hersuspenderen weefsel in 200 pi van dezelfde PBS oplossing met remmers.
    2. Om het monster vast te stellen, toe te voegen 5,5 ul 37% formaldehyde (warm formaldehyde in 37 ° C waterbad gedurende 1 min voor het gebruik). Incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten, elke 5 minuten vortex daartussen.
    3. Plaats het monster op het ijs voor het weefsel om zich te vestigen voor 2 minuten. Spoel 2x met 450 ul PBS (met proteaseremmers en PMSF). Sample kan nu winkeld bij -20 ° C. Herhaal dissectie een paar keer om genoeg materiaal voor ChIP te verkrijgen.

    2. Bereid Supernatant met eiwit-DNA Vervoeging voor Chip Assay

    1. Meng voldoende monster van stap 1.3 1,75 mL Eppendorf buis.
    2. Verwijder de PBS uit weefselmonster. Voeg 200 ul lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 of NP-40, 5 mM butyraat en 1x proteinase inhibitor cocktail). Voeg verse PMSF stockoplossing lysis buffer (PMSF eindconcentratie van 0,5 mM). Meng met blauwe homogenisator (Fisher Cat # 749521 tot +1.590) tot weefsels volledig distantiëren zonder aggregatie, incuberen bij RT (kamertemperatuur) gedurende 10 minuten.
    3. Sonicatie: gebruik microtip ultrasoonapparaat (Misonix HS-XL200) aan de macht 20. Sonificeer 10 sec en rust op het ijs voor 50 sec. Herhaal 4-5 keer (optimale sonicatie tijd moet empirisch worden bepaald, zoals langere sonicatie zal opleveren kleinere fragmenten. Voor chip met behulp van antilichamen tegen histone wijzigingen, normaal gesproken hebben we ultrasone trillingen chromatine tot ongeveer 200-300 bp; voor transcriptie factor of chromatine toezichthouder (bijvoorbeeld de Polycomb-eiwitten), hebben we normaal gesproken ultrasone trillingen chromatine tot 200-1000 bp. Echter, de optimale fragmentgrootte empirisch worden getest. Let op: ALTIJD DE BUIS KEEP ON ICE, zelfs tijdens sonicatie OM monster te voorkomen opwarming van!
    4. Verdun monster door toevoeging 1,8 ml RIPA buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoxycholaat, 1% Triton X-100 met proteaseremmers en PMSF bij dezelfde concentratie als beschreven eerder). Sla 40 pl als input controle door 2 pi 5M NaCl en incuberen bij 65 ° C geroerd (O / N) crosslink keren.
    5. Om antilichaam geconjugeerd aan korrels, voeg 40 ul Proteïne A puimsteen 1,5 ml eppendorfbuisje en voeg 600 pi PBS en gesteente bij 4 ° C gedurende 2 minuten toepassing korrels magneet en verwijderen supernatant Voeg 100 ul van PBS en het antilichaam van belang (hoeveelheid antilichaam moet worden bepaald empirmatisch). Incubeer bij kamertemperatuur 1 uur of 4 ° C gedurende 4 uur.
    6. Verwijder supernatant van de kralen door de magneet en voeg 1 ml chromatine uittreksel uit stap 2.4 tot de kralen. Draai bij 4 ° CO / N.
    7. Breng ChIP monster tot magneet en te verwijderen supernatant. Was de kralen met de volgende buffer bij 4 ° C gedurende 10 minuten:
      2x met 1 ml RIPA buffer [1,89 mL 'RIPA buffer' + 315 pl 7x proteaseremmers + 20 pL PMSF];
      2x met 1 ml RIPA buffer + 0,3 M NaCl [1,89 mL RIPA buffer + 220 uL 3 M NaCl];
      2x met 1 ml LiCl buffer (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC);
      1x met 1 ml 1 x TE + 0,2% Triton X-100;
      1x met 1 ml 1x TE.
    8. Om crosslink keren de korrels te resuspenderen in 100 ul TE buffer + 3 pi 10% SDS + 5 pi proteinase K (20 mg / ml). Incubeer bij 65 ° CO / N.
    9. Breng kralen om magneet en over te dragen supernatant in een nieuwe buis. DE BOVENSTAANDE bevat uw DNA-monster. Was kralen met 100 pi TE + 0,5 MNaCl en combineren van de twee supernatant.
    10. Fenol-chloroform halen het DNA-monster. Voeg 200 ul Fenol: Chlorofrom: IAA (25:24:1) mix en vortex. Spin op 14k gedurende 5 minuten bij RT. Als alternatief kan DNA worden gehaald met behulp van PCR Qiagen zuivering kit.
    11. Breng de bovenstaande / waterlaag in een nieuwe buis en voeg lineaire acrylamide tot een eindconcentratie van 20 ng / ml (U 1 pi van glycogeen bij 20 mg / ml per 1 ml van de bovenstaande kunnen ook worden gebruikt. Glycogeen wordt gebruikt daaropvolgende qPCR of PCR analyse terwijl lineaire acrylamide gebruikt voor sequentie assays.) Voeg 20 ul van 3M NaOAc en 500 ul 100% EtOH. Meng goed en incubeer bij 80 ° C gedurende 10 minuten. Spin bij maximale snelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
    12. Verwijder supernatant en was met 300 pl 70% EtOH. Drogen aan de lucht en resuspendeer monster in 50 ul TE-buffer. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C. Monster kan worden gebruikt voor de kwantitatieve PCR (qPCR) assay (figuur 1).

    3a. Analyseer ChIP-ed DNA met behulp van qPCR

    1. Verdun genomisch DNA in de volgende concentratie met een standaard curve maken: onverdunde, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
    2. Voor elke primerpaar, opgericht qPCR in twee exemplaren in een 96-wells plaat met genomisch DNA uit stap 3a.1, inputcontrole en Chip-ed DNA:
      10 pi 2x SYBR PCR-mix (Fermentas, K0222);
      1 pi 10 pM voorwaartse primer;
      1 pi 10 pM reverse primer;
      x ul ChIP-ED-DNA (controle op, of genomisch DNA);
      y ul nuclease vrij H2O de reactie volume op 20 pL.
    3. Spin down van de 96-wells plaat met Mini plaat Spinner (LABNET).
    4. Voer qPCR met de ABI 7300 real-time PCR-systeem (of andere real-time PCR-systemen) met behulp van de volgende voorwaarde:
      Stap 1: 50 ° C gedurende 2 minuten, 1 cyclus;
      Fase 2: 95 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus;
      Fase 3: 95 ° C gedurende 15 s 60 ° C gedurende 1 min., 40 cycles;
      Fase 4 (dissociatie fase): 95 ° C gedurende 15 s 60 ° C gedurende 1 minuut, 95 ° C gedurende 15 s.
    5. Controleer de dissociatie curve: een piek bij de thermische dissociatie plot suggereert een amplicon van de PCR-reactie. Meer dan een piek geeft niet-specifieke product met primerpaar dient de qPCR zij niet worden gebruikt.
    6. Bepaal de lineaire fase van exponentieel van PCR-reactie voor elke primer set door berekening van de formule DNA hoeveelheid opgelost volgens Ct (cyclus drempelwaarde) waarde, gebaseerd op de standaard curve met de reeks verdunde genomisch DNA in 3a. 1.
    7. Als de Ct-waarde van CHIP-ED-DNA en input controle zijn binnen het lineaire gebied van de Ct-waarde, de berekening van de verrijking van CHIP-ed-DNA versus input, volgens de verdunningsfactor van CHIP-ED-DNA en input controle in 2.4.

    3b. Amplify ChIP-ed DNA voor high throughput sequencing.

    1. End-reparatie van ChIP-ed DNA-mix (GebruikEpicentre DNA END-Repair kit), opgericht op het ijs:
      1-34 ul genomisch DNA van stap 2,12 (0,1 tot 5 ug)
      5 pi 10x End reparatie buffer
      5 pi 2,5 mM dNTP mix
      5 pi 10 mM ATP
      x il H 2 O om de reactie volume aan te passen tot 49 pl
      1 pi einde Repair enzymmengsel (T4 DNA polymerase + T4 polynucleotidekinase)
      Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur. Zuiver reactie met gebruikmaking van Qiagen MinElute Reactie
      Cleanup kit. Elueren in 30 pi elutiebuffer (EB).
    2. Voeg een-overhangende aan het 3 'uiteinde:
      30 pl geëlueerde DNA van stap 3B.1
      5 pi 10x NEB buffer # 2
      10 pi 1 mM dATP
      2 pi dH 2 O
      3 pi 5 U / pl Klenow fragment (3 '→ 5' exo-)
      Gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Zuiver reactie met gebruikmaking van MinElute ReactionCleanup kit. Elueren in 10 pi EB.
    3. Solexa linker ligatie:
      10 ul van geëlueerde DNA van stap 3B.2
      10 pl DDH 2 O
      2.5 μ l 10x T4 DNA-ligase buffer
      1 pi Adapter oligo mix van Illumina (1/10-diluted uit voorraad)
      2,5 pi T4 DNA ligase (400 eenheden / pl)
      Incubeer gedurende 1 uur bij RT. Zuiver reactie met gebruikmaking van MinElute ReactionCleanup kit. Elueren in 20 pi EB. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C.
    4. Voer de geëlueerde DNA-monster uit stap 3B.3 het gebruik van de E-gel apparaat. Isoleren 300-500 bp band in de gel en zuiveren met de Qiagen gelextractiekit (deze stap maakt het ~ 125 bp zelf geligeerde linkers van de adapter oligo ligatie). Elueren in 12 pi EB.
    5. Amplify bibliotheek met behulp van gepaarde-end (PE) primers van Illumina:
      10,5 pi geëlueerde DNA van stap 3B.4
      12,5 pl van master mix (2X Phusion HF, Finnzymes)
      1 pi PE1 PCR primer 1
      1 pi PE2 PCR primer 2
      PCR staat:
      98 ° C gedurende 30 sec
      (98 ° C 10 sec, 65 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec), 20 cycli herhaald
      72 ° C gedurende 5 minuten.
    6. Monsters van stap 3B.5 kan worden gebruikt voor ChIP-seq na het selecteren van de juiste maat DNA (300-500 bp) met de standaard 2% agarose gel. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C. Het beste is om elke chip monster isoleren op een enkele gel om besmetting te voorkomen. Monsters kunnen worden ingediend voor high-throughput sequencing.

    3c. Solexa pijplijn analyse

    1. De 25 bp sequentie leest werden verkregen uit de Illumina Genome Analyzer (GA) pijpleiding.
    2. Alle maal gelezen werden afgestemd op de Drosophila genoom (dm3) met behulp van de eland (Efficient Local Alignment van Nucleotide Data)-software, waarmee maximaal twee mismatches met de referentie sequentie.
    3. Uniek in kaart gebracht maal gelezen werden weerhouden voor downstream-analyse. Bij meerdere identieke gelezen, werden tot drie kopieën gehandhaafd om de mogelijkheid vertekening van PCR-amplificatie verminderen.
    4. De output van de GA Pipeline werd omgezet naar de browser uitbreidbaar gegevens (BED) bestanden.
    5. Voor het genereren vande pruik bestanden voor het uploaden naar de UCSC browser voor visualisatie, gebruikten we een python scrip die is in een eerdere publicatie 3 beschreven met 4 basispunten als grootte van het venster en 160 bp als het DNA-fragment grootte.
    6. Om Drosophila genen in te delen in stil en expressie genen, hebben we gebruik gemaakt van een digitaal getal genoemd RPKM (leest / per kilobase samengevoegd exon regio / per miljoen in kaart gebrachte leest). Genen RPKM = 0 werden als stil groep genen RPKM ≥ 1 werden ingedeeld in de uitdrukking groepen die in drie groepen worden ingedeeld als genen lage, middelmatige en hoge expressie, en elke groep over hetzelfde aantal genen.
    7. Om de histon-eiwitten niveau en de genexpressie vergelijken, gebruikten we een python script die is beschreven in een eerdere publicatie 3.

    4. Representatieve resultaten

    Voorbeelden van ChIP-qPCR resultaten met behulp van bam (zak knikkers) mutant testes worden getoond in Figuur 1 4. In bam testes, is er een storing in de overgang van proliferatieve spermatogonia te differentiëren spermatocyten 5, 6. We maken gebruik van bam testes als bron voor ongedifferentieerde kiemcellen, die zijn verrijkt met dit weefsel type. Differentiatie genen die nodig zijn voor sperma differentiatie, zoals man-specifieke transcriptie factor 87 (mst87F), Don Juan (dj) en fuzzy ui (FZO) worden niet uitgedrukt in bam testes. Deze genen zijn sterk verrijkt met de repressieve H3K27me3 histon-eiwitten 7 (Figuur 1A), maar zijn verstoken van de actieve H3K4me3 histon-eiwitten 8 (figuur 1B), een chromatine handtekening noemden we 'monovalent' 7. Verrijking van een van beide H3K27me3 of H3K4me3 wordt bepaald door normalisatie tot een constitutief tot expressie Cycline A (CycA) gen 4.

    inhoud "> ChIP-seq analyse met behulp van dezelfde set van antilichamen (dwz repressieve H3K27me3 en actieve H3K4me3) met bam mutant testes (figuur 2) gevalideerd qPCR resultaten weergegeven in figuur 1. Voor de drie geteste terminale differentiatie genen mst87F, dj en FZO worden de genomische gebieden hoog verrijkt met H3K27me3 maar H3K4me3 (Figuur 2A-2C). daarentegen de constitutief tot expressie CycA gen aanmerkelijke H3K4me3 weinig H3K27me3 binding nabij de transcriptie start site (TSS) (Figuur 2D).

    Bovendien is de ChIP profielen van H3K27me3 en H3K4me3 de buurt van de TSSs van vier klassen van genen differentieel tot expressie komen overeen met de functie van elke histon-eiwitten. Zoals getoond in figuur 3A is verrijkt H3K27me3 stroomafwaarts van de TSSs omgekeerd evenredig met niveau van genexpressie. De stille genen hebben de hoogste H3K27me3 terwijl dehoog tot expressie genen hebben geen H3K27me3 bindend. Deze gegevens in overeenstemming met de repressieve van H3K27me3 op genexpressie. Daarentegen verrijking van H3K4me3 rond de TSSs heeft de tegenovergestelde verband met gen expressie (figuur 3B), consistent met de actieve rol H3K4me3 op genexpressie.

    Figuur 1
    Figuur 1. QPCR analyse van ChIP-ED-DNA met behulp van antilichamen tegen zowel de repressieve H3K27me3 histon-eiwitten (A) of actieve H3K4me3 histon-eiwitten (B) in niet-gedifferentieerde cel-verrijkte bam mutant testes. (A) in BAM testes, differentiatie genen (Mst87F, dj, FZO) zijn verrijkt met de H3K27me3 repressieve histon-eiwitten. (B) Differentiatie genen zijn uitgeput met H3K4me3 actieve markering. Het niveau van ChIP DNA (ChIP DNA / ingang) op de target-gen (Mst87F, dj of FZO) werd voor het eerst genormaliseerd naar de lev el van CHIP DNA bij de controle CycA gen. Fout balken geven de standaardafwijking van drie onafhankelijke biologische repliceert.

    Figuur 2
    Figuur 2. UCSC genoom browser snapshots van H3K27me3 en H3K4me3 verrijking over de hele genomische regio's van (A) Mst87F (B) dj en (C) FZO, (D) CycA genen. De omcirkelde H3K27me3 verrijkte regio in (D) geeft de chromatine status van een overlappende gen CG7264, die laag uitgedrukt in bam testes (RPKM = 1), maar zeer uitgedrukt in wild-type testes (RPKM = 130) 8 (chip-seq gegevens 7). Probes in kwantitatieve PCR analyse van ChIP resultaten in Figuur 1 zijn voorzien onderaan elk veld. klik hier grotere figuur zien .

    tp_upload/3745/3745fig3.jpg "/>
    Figuur 3. ChIP-seq profielen met behulp van H3K27me3 en H3K4me3 in bam testes 7. De vier groepen genen (7509 genen) werden ingedeeld op basis van hun genexpressie niveaus op basis van RNA-seq resultaten 8. De vertegenwoordiger klassen van genen worden uitgezet voor de verrijking van een bepaalde histon-eiwitten, met behulp van sequenties van 3kb stroomopwaarts tot 3kb stroomafwaarts van de transcriptie start sites (TSSs). Dit genereert een profiel van verrijking van (A) H3K27me3 (K27) en (B) H3K4me3 (K4) chip-seq analyses in elke groep. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De veelzijdigheid van ChIP analyses die in dit protocol kan worden gebruikt op verschillende weefsels, die een kans om de chromatine staat te studeren in een biologisch relevante systeem biedt. ChIP experimenten met gekweekte cellen systemen geschikt uitvoeren omdat grote hoeveelheden cellen kunnen gemakkelijk worden verkregen. Echter, gekweekte cellen niet noodzakelijk cellen in een meercellige omgeving. Door het ontwikkelen van deze techniek met behulp van ontleed weefsel van levende dieren, kunnen we in op vele vragen die gekweekte cellen niet kan.

    Ondanks het nut van dit protocol, zijn er verschillende valkuilen. Bijvoorbeeld, de ontleed weefsel nog heterogeen verschillende celtypen. Terwijl relatief homogene cellen worden verkregen in Drosophila weefsels zoals denkbeeldige schijven andere weefsels zoals darmen, testes en eierstokken welke allen beperkt stamcellen heterogeen zijn. Deze complicatie kan gedeeltelijk wordenaangepakt met behulp van krachtige Drosophila genetica. Bijvoorbeeld, hoewel volwassen stamcellen bestaan ​​in een kleine populatie in weefsels hierboven besproken en zijn uiterst moeilijk te worden geïsoleerd in een voldoende aantal voor Chip-analyse, kunnen stamcellen bevolking verrijkt worden met behulp van genetisch gemuteerde achtergrond. De bam gen noodzakelijk is voor stamcellen differentiatie in Drosophila kiembaan lijn 5,6. Daarom bam mutant geslachtsklieren zijn een goede bron voor verrijkte ongedifferentieerde kiemcellen. Door het uitvoeren van chip met behulp van bam mutant, kunnen we het verkrijgen van een epigenomisch landschap in ongedifferentieerde kiemcellen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Wij hebben niets te onthullen.

    Acknowledgements

    De auteurs willen graag Dr Keji Zhao's lab (NIH / NHLBI) bedanken voor hun hulp bij het verstrekken van sequencing resultaten. Wij zouden ook graag de UCSC genome project bedanken voor het gebruik van Genome Browser om in kaart gebracht sequencing leest te visualiseren.

    Dit werk werd ondersteund door de R00HD055052 NIH Pathway to Independence Award en R01HD065816 van NICHD, de Lucile Parkard Foundation en de Johns Hopkins University start-up financiering voor XC

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Complete Mini protease inhibitor cocktail Roche Group 11836153001
    Formaldehyde (37%) Supelco, Sigma-Aldrich 47083-U
    PMSF Sigma-Aldrich 78830
    Kontes pellet pestle Fisher Scientific K749521-1590
    PCR Purification Kit Qiagen 28104
    Linear polyacrylamide Sigma-Aldrich 56575-1ML
    Glycogen Qiagen 158930
    SYBR green/ROX qPCR Master Mix Fermentas K0223
    Mini plate spinner Labnet International Z723533
    Real time PCR system Applied Biosystems 4351101
    Small Volume Ultrasonic Processor Misonix HS-XL2000 Model discontinued
    Dynabeads, Protein A Invitrogen 100-01D
    Dynamag magnet Invitrogen 123-21D
    Phenol:Chlorofrom:IAA Invitrogen 15593-049
    Epicentre DNA END-Repair Kit Epicentre Biotechnologies ER0720
    MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28204
    Klenow Fragment (3’→5’ exo-) New England Biolabs M0212S
    T4 DNA ligase Promega Corp. M1794
    Adaptor oligonucleotides Illumina PE-400-1001
    Paired-End Primer 1.0 and 2.0 Illumina 1001783 1001 784
    E-Gel Electorphoresis system Invitrogen G6512ST
    2X Phusion HF Mastermix Finnzymes F-531

    References

    1. Kharchenko, P.V., Alekseyenko, A.A., Schwartz, Y.B., Minoda, A., Riddle, N.C., Ernst, J., Sabo, P.J., Larschan, E., Gorchakov, A.A., Gu, T., et al. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
    2. Filion, G.J., van Bemmel, J.G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L.D., Brugman, W., de Castro, I.J., Kerkhoven, R.M., Bussemaker, H.J., & van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
    3. Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., & Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
    4. Chen, X., Lu, C., Prado, J.R., Eun, S.H., & Fuller, M.T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
    5. Gonczy, P., Matunis, E., & DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
    6. McKearin, D.M. & Spradling, A.C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
    7. Gan, Q., Schones, D.E., Eun, S.H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., & Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, R42 (2010).
    8. Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., & Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-83 (2010).

    Comments

    1 Comment

    Hi Dr. Chen,
    I 'm trying to minimize ChIP with sepharose beads but I would like to try minimized conditions with dynabeads. Could you send me the part of the protocol where you are using it?
    Best regards

    Denis
    Reply

    Posted by: Denis S.January 28, 2013, 4:32 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter