Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

Liam O'Ryan, Tracy Rimington, Natasha Cant, Robert C. Ford

Faculty of Life Sciences, University of Manchester

Il regolatore transmembrana della fibrosi cistica conduttanza (CFTR) è un canale cloruro, che quando mutati, può dar luogo alla fibrosi cistica in humans.There è pertanto notevole interesse in questa proteina, ma sforzi per studiare la struttura e attività sono stati ostacolati dalla difficoltà di esprimere e purificare quantità sufficienti di proteina ^1-3. Come molti 'difficili' proteine ​​di membrana eucariotica, espressione in un organismo in rapida crescita è auspicabile, ma impegnativo, e nel lievito S. cerevisiae, finora basse quantità sono stati ottenuti e rapida degradazione della proteina ricombinante è stata osservata ^4-9. Le proteine ​​coinvolti nel trattamento di CFTR ricombinante in lievito sono stati descritti ^6-9. In questa relazione si descrive un metodo per l'espressione di CFTR in lievito e la sua purificazione in quantità significativa. Il protocollo descrive come i problemi proteolisi precedenti possono essere superati e come livelli di espressione diCFTR può essere notevolmente migliorata modificando le condizioni di crescita cellulare e controllando le condizioni di induzione, in particolare il periodo di tempo prima della raccolta delle cellule. Le reagants associati a questo protocollo (CFTR murino che esprimono le cellule di lievito o plasmidi di lievito) saranno distribuiti attraverso la Cystic Fibrosis Foundation statunitense, che ha sponsorizzato la ricerca. Un articolo che descrive la progettazione e la sintesi del CFTR costrutto impiegato in questa relazione sarà pubblicata separatamente (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inedito). In questo articolo vi spiegheremo il nostro inizio metodo con la trasformazione delle cellule di lievito con il CFTR costruire - lievito contenente plasmide (Fig. 1). Il costrutto ha una proteina verde fluorescente (GFP) fusa alla sequenza CFTR al suo C-terminale e segue il sistema sviluppato da Drew et al. (2008) ^10. La GFP permette l'espressione e la purificazione di CFTR da seguire con relativa facilità. Il protoc JOVE visualizzatofiniture olo dopo la preparazione di microsomi delle cellule di lievito, anche se si comprendono alcuni suggerimenti per la purificazione della proteina dai microsomi. I lettori possono aggiungere proprie modifiche alla procedura di purificazione microsoma, a seconda degli esperimenti finali da effettuare con la proteina e le attrezzature locali a loro disposizione. Il lievito-espresso proteina CFTR può essere parzialmente purificato di ioni metallici con cromatografia di affinità, utilizzando un tag intrinseca purificazione poliistidina. Dopo cromatografia ad esclusione dimensionale produce una proteina che sembra essere> 90% puro, come giudicato da SDS-PAGE e colorazione Coomassie-del gel.

Questo protocollo presuppone che il CFTR-GFP-8His gene di fusione è stata inserita in un plasmide di lievito a valle di un promotore GAL1 galattosio (Fig.1) e che il plasmide è stato trasformato in cellule FGY217, un mutante di delezione PEP4 ¹⁰ S.cerevisiae et al. (2008) ^10.

1. Scegli 5-10 ben separati colonie da una piastra di trasformazione. Trasferire ciascuna colonia ad una sterile separata tubo da 50 ml Falcon contenente 9 ml YNB e 1 ml di terreno di glucosio al 20%. Per questo passaggio, è importante avere una concentrazione finale del 2% glucosio (w / v) in coltura per mantenere la crescita cellulare. Crescere durante la notte per 16 ore a 250 rpm, 30 ° C in un incubatore orbitale agitazione.
2. Fare stock di glicerolo per ciascuna delle colonie schermati. Asepsi 0,8 ml delle colture overnight a 0,2 ml di glicerolo sterile in etichettati vite migliori fiale, brevemente vortex e conservare a -80 ° C.
3. Diluire le colture restanti overnight a un volume finale di 50 ml in YNB, incluse 250 microlitri di terreno di glucosio 20%.Per questo passaggio, è importante per diluire la concentrazione di glucosio a circa lo 0,1% (w / w) nella cultura perché glucosio può reprimere la promotore GAL1 ^10. Grow culture in etichetta 250 ml Erlenmeyer sconcertato palloni ad un OD ₆₀₀ di 0,7-0,8 a 250 rpm, 30 ° C in un incubatore orbitale agitazione.
4. Indurre le culture con aggiunta di 5 ml di mezzo galattosio 20% a ciascun pallone e crescere su per 16 ore.
5. Confermare l'espressione di CFTR usando la microscopia a fluorescenza. Prendete 100 microlitri di cultura e di glicerolo aggiungere 100 microlitri di limitare la mobilità delle cellule in soluzione. Analizzare le celle di un microscopio Vision Delta RT ripristino (o simili), utilizzando un laser blu sotto un filtro FITC (lunghezza d'onda di eccitazione di 490 nm e la lunghezza d'onda di emissione di 528-538 nm). Espressione positiva del CFTR-GFP proteina di fusione deve essere visibile come un anello di fluorescenza alla membrana plasmatica delle cellule di lievito. Cellule di lievito non trasformate possono essere utilizzati come controllo.
6. Trasferire ilculture in tubi Falcon da 50 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3500 xg, a 4 ° C per 10 minuti in una centrifuga da banco. Mentre la centrifuga è in funzione, preparare 2 tubi microcentrifuga ml con tappo a vite contenente circa 500 pl acid-washed perline di vetro e immessi sul ghiaccio. Eliminare il surnatante e risospendere ciascuna pellet in 500-800 ul ghiacciato CRB con inibitori della proteasi. Trasferire le sospensioni ai tubi da microcentrifuga contenente le perline e tenere su ghiaccio.
7. Lisare le cellule scuotendo vigorosamente / vortex ciascuna provetta da microcentrifuga per 10 periodi di 30 secondi, appoggiato su ghiaccio tra i periodi. Un beadbeater può essere impiegato in alternativa, ad esempio un beadbeater Biospec mini funzionare per 3 min.
8. Porre i tubi in una microcentrifuga da banco e centrifugare a 3500 xg, a 4 ° C per 5 minuti. Trasferire il surnatante contenente la popolazione greggio membrana per pulire i tubi microcentrifuga e immettono sul ghiaccio. Aggiungere 500 ul fresco ghiaccio-cold CRB con inibitori della proteasi in ogni provetta e ripetere il processo di accumulare le membrane.
9. Raccogliere le membrane grezzi facendo girare alla massima velocità, 4 ° C in una microcentrifuga da banco per 2 ore. Eliminare il supernatante e risospendere ciascun pellet in 50 microlitri di buffer CFTR ghiacciata.
10. In tubi puliti microcentrifuga, miscelare 15 microlitri di ciascuna sospensione colorante con 15 microlitri di carico 2x pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Non bollire i campioni, ciò causerebbe proteine ​​di membrana CFTR e l'altro per formare SDS-aggregati insolubili e denaturare il tag GFP.
11. Caricare i campioni con PageRuler Plus. standard proteiche prestained (Fermentas) su un 4-20% Tris / glicina gradiente di gel (NuSep) e funzionare a 150 V per 40 minuti o fino a che il colorante è di fronte al fondo del gel.
12. Identificare le cellule che esprimono alti da in-gel fluorescenza. Inserire in un sistema di imaging di fluorescenza come uno scanner Typhoon. Eseguire la scansione del u gelcantare il laser blu a lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 526 nm. Il CFTR-GFP fusione deve essere visibile a circa 220 kDa. Ci sarà anche una banda fluorescente visibile debole a circa 70 kDa che probabilmente è un lievito intrinseca FAD contenente proteina di membrana (come succinato deidrogenasi subunità A) ^11,12.
13. Colorare il gel con Coomassie, Decolorare ed eseguire la scansione il gel per il confronto con la scansione di fluorescenza mediante una comoda visualizzazione pacchetto di immagini software. Il gel colorato con Coomassie-permette una valutazione relativa di CFTR-GFP livelli di espressione in diverse linee clonali dopo la normalizzazione per la quantità di proteina totale caricato su ciascuna traccia del gel.
14. Streak la linea cellulare che esprime più alto dal suo magazzino glicerolo (2.2) su un nuovo YNBA ed incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. Questo piatto può quindi essere conservati per un massimo di 2 settimane a 4 ° C.

3. Su larga scala Fermentatore Culture

1. Preparazione pre-culture per il fermentatore. Raschiare uno spazio di 1 centimetro ^due cellule dal YNBA piastra (2.13) utilizzando un'ansa sterile e aggiungere 45 ml YNB e 5 ml di terreno di glucosio 20%, in modo tale che la OD ₆₀₀ è circa 0,1. Crescere in beute da 250 ml sconcertati a 250 rpm, 30 ° C in un incubatore orbitale agitazione fino a quando la OD ₆₀₀ raggiunge 1.
2. Dividere la cultura tra i due 2 l Erlenmeyer sconcertato palloni contenenti ciascuna 450 ml YNB e 25 ml di glucosio media del 20%. Coltivare queste sul a 250 rpm, 30 ° C in un incubatore orbitale agitazione fino a quando la OD ₆₀₀ raggiunge 1,2.
3. Mentre queste pre-culture sono in crescita, impostare il fermentatore. Fare 11.2l di YNB come descritto in 1,1, ma sciogliere un ulteriore 8,28 g YNB e 0,95 g goccia fuori supplemento per compensare l'aggiunta di glicerolo a induzione. Asepsi, aggiungere il l 11,2 YNB e 75 ml di glucosio media del 20% a una nave sterile fermentatore 20L e regolare la temperatura di esercizio di30 ° C.
4. Aggiungere asetticamente le precultures al fermentatore e impostare la velocità di agitazione a circa 800 rpm e mantenere la temperatura a 30 ° C. L'aria compressa deve fluire a circa 15 dm ³ min ^-1. Una volta la cultura fermentatore raggiunge un OD ₆₀₀ del 1.2, inducono aggiungendo asetticamente la soluzione 1,5 l galattosio YNB 20% glicerolo e 1,2 l. Ridurre la temperatura a 25 ° C e crescere la coltura per 16 ore.
5. Trasferire il contenuto fermentatori in centrifuga refrigerata vasi da 1 litro su ghiaccio utilizzando una pompa peristaltica. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.500 xg, a 4 ° C per 30 minuti in un rotore di grande capacità (ad esempio 6 litri). Risospendere le cellule in 150 ml CRB ghiaccio freddo con inibitori della proteasi. Da qui, tutti i lavori deve essere condotta a 4 ° C.
6. Lisare le cellule passando attraverso una costante disgregatore cella sistemi in 4 passaggi a 25, 30, 32 e 35 kPa, raccogliendo il lisato su ghiaccio in ciascun caso. In alternativa, utilizzare un bead Beater (Biospec) con un volume uguale di acido lavate perle di vetro 0,5 mm e agitare per 3 minuti a piena potenza. Trasferire il lisato di provette Falcon da 50 ml e il pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 3.500 xg, a 4 ° C per 15 minuti in una centrifuga da banco.
7. Trasferire il supernatante in provette da centrifuga refrigerata. Centrifugare a 14.000 xg, a 4 ° C per 30 minuti in una centrifuga per rimuovere mitocondri.
8. Trasferire il surnatante in provette ultracentrifuga refrigerati. Centrifugare a 200.000 xg, a 4 ° C per 90 minuti in un'ultracentrifuga per raccogliere microsomi.
9. Attenzione decantare e scartare il surnatante e aggiungere 2 ml di buffer CFTR fredda come il ghiaccio con inibitori della proteasi e 1mM DTT in ciascun tubo. Risospendere delicatamente le palline con un pennello, rabboccare ogni tubo con tampone CFTR e mescolare con un miscelatore vortex.
10. Centrifugare la sospensione a 200.000 xg, 4 ° C per 60 minuti in un'ultracentrifuga, scartare il pellet supernatante e risospendere in 2 ml ghiacciata CFTR tampone winibitori della proteasi ith (Senza DTT) con un pennello.
11. Pool di microsomi risospeso, regolare il volume finale di 50 ml con il tampone CFTR e mescolare bene. Prenota un aliquota 1 ml per analisi SDS-PAGE gel, come descritto in 2,9-2,11. I microsomi possono ora essere lampo congelati in azoto liquido e poi stoccato a -80 ° C fino al momento.
12. CFTR può essere estratto da microsomi utilizzando uno dei seguenti: detergenti litio perfluorooctonoate acido (LiPFO), tetradecanoly-liso-fosfatidilglicerolo (LPG14), n-dodecil-β-D-maltoside (DDM). Mescolare le microsomi con tampone CFTR, inibitori della proteasi e il 5% detergente (w / w). Se DDM viene utilizzato, anche aggiungere 300 mM NaCl al buffer. Agitare a 4 ° C per 15 minuti su un rotatore tubo.
13. Centrifugare i campioni a 100.000 xg, a 4 ° C per 1 ora in un'ultracentrifuga. Conservare il supernatante e prendere una piccola aliquota di analisi SDS-PAGE gel. CFTR può ora essere purificati dal materiale di metallo immobilizzato solublisedcromatografia di affinità seguita da cromatografia per esclusione di dimensione.

4. Risultati rappresentativi

Trasformazione di lievito con il CFTR contenente plasmide non è efficiente al 100%. Un rappresentante di piccole dimensioni dello schermo di espressione CFTR nelle colonie selezionati da un esperimento di trasformazione produrrà circa 1 su 4 colonie che esprimono la proteina. Un tipico risultato di uno schermo di 5 colonie raccolti da una piastra viene mostrato nel pannello A di Fig. 3. Una delle colonie mostra una forte livello di espressione di CFTR-GFP proteina di fusione che si estende tipicamente tra i 250 e 130 kDa marcatori kDa, come mostrato. Le CFTR-GFP livelli di fluorescenza variano considerevolmente tra gli esperimenti, con la colonia di 4 in fig. 3 indica almeno 10 volte superiore a fluorescenza della banda intrinseca fluorescente a circa 70kDa. Se i livelli di espressione di CFTR-GFP sembrano dare meno fluorescenza rispetto alla banda da 70 kDa, allora è probabilmente vale la pena ri-trasformazione e la scelta di una coloniacon alti livelli di CFTR-GFP espressione. Come mostrato in Fig. 3A, è improbabile, anche con un livello di elevata espressione di CFTR-GFP, che il CFTR-GFP banda sarà distinguibile nell'estratto cella da colorazione con Coomassie.

Una volta selezionate colonie sono state coltivate in esperimenti scala maggiore, e microsomi isolati, la presenza di CFTR-GFP nei microsomi dovrà essere valutata, come mostrato in fig. 3B. I risultati di questo esperimento sono importanti, non solo per valutare l'efficienza di induzione di espressione, ma anche per verificare che i microsomi sono stati preparati con cura e che la proteolisi è stata minimizzata. I risultati mostrati in fig. 3B implica che in questo esperimento il CFTR-GFP espressione è leggermente inferiore (come giudicato relativa alla banda intrinseca 70kDa) che in piccola scala esperimento mostrato nel pannello A. Tuttavia questa impressione è polarizzato dalla sovraesposizione del rivelatore di fluorescenza in questo misurazione. Questo perché lo sperimentatore era checking per la presenza di frammenti proteolitici del CFTR costrutto. Vi è qualche evidenza in questo esperimento di alcuni frammenti fluorescenti proteolitici tra i 130 kDa e 100 kDa marcatori, ma questi sono molto deboli rispetto alla full-length CFTR GFP-band. Con gli inibitori della proteasi qui descritte, si trovano poche prove per la degradazione proteolitica di CFTR dopo la rottura delle cellule. Se proteolisi significativa si osserva, si consiglia di fare nuove soluzioni stock inibitori della proteasi. Abbiamo anche trovato che le compresse commerciali cocktail inibitore di proteasi non sono efficaci per questo sistema. La crescita di cellule oltre 16 ore (post-induzione) darà luogo ad espressione di CFTR è diminuita come mostrato in Figura 4. Ciò è probabilmente dovuto al turnover della proteina, forse a causa upregulation della macchina lievito controllo di proteine ​​di qualità ^6-9,13. Si consiglia pertanto di monitorare i livelli di espressione del gene CFTR dopo induzione con galattosio, se possibile, come il momento ottimale per raccogliere le cellule may varia da un laboratorio all'altro.

Figura 1. Il costrutto contenente CFTR lievito plasmide. Il CFTR-GFP-8His fusione viene inserito nel vettore di espressione 2μ p424GAL1, sotto il controllo di un (GAL1) promotore galattosio. Il vettore contiene anche un marcatore di selezione uracile (URA) e un gene di resistenza all'ampicillina (Amp).

Figura 2. Un diagramma di flusso che sintetizza il protocollo visualizzato.

Figura 3. Rappresentativi SDS-PAGE gel di espressione CFTR e di purificazione. Panel A presenta cinque scelto a caso colonie trasformanti (corsie 1-5) che sono state sottoposte a screening per l'espressione CFTR. Panel B mostra microsomi che sono stati isolati da un ferm 15LInserisci cultura. Panel C presenta purificata CFTR murino ottenuto dopo due fasi di purificazione mediante cromatografia per affinità seguita da cromatografia ad esclusione dimensionale. Tutti i gel vengono visualizzati in condizioni di illuminazione a fluorescenza entusiasmante dal dominio GFP (sinistra) e dopo Coomassie macchia (a destra). Le posizioni relative di standard di peso molecolare sono elencati sulla sinistra (kDa).

Figura 4. Dati rappresentativi per l'espressione di CFTR in lievito. Pannello A mostra un corso di tempo di espressione di CFTR dopo induzione con galattosio. Estratti cellulari sono stati analizzati mediante SDS-PAGE, e la fluorescenza GFP per la CFTR-GFP banda di proteina è stata integrata. B pannello mostra risultati tipici per microscopia a fluorescenza di GFP cellule esprimenti 16 ore dopo l'induzione. Tipicamente, solo una frazione delle cellule esprimono CFTR a livelli elevati.