Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Chemistry

חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Chemistry and Biochemistry, California State University, East Bay

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    Cite this Article

    Edogun, O., Chan, T. Y., Nguyen, N. H., Luu, A., Halim, M. An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III). J. Vis. Exp. (119), e55216, doi:10.3791/55216 (2017).

    Introduction

    החשיבות הגוברת של דימות תהודה מגנטית (MRI) באבחון קליני, אשר מוגבל על ידי רגישות הטבועה של הטכניקה, הביאה את הצמיחה המהירה של המחקר על פיתוח של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום רומן (GBCAs) 1. GBCAs הם מולקולות אשר מנוהלים על מנת לשפר את איכות התמונה, ובדרך כלל יש להם את המבנה הכימי של יון גדוליניום trivalent (ה 3+) מתואם ליגנד polydentate. Complexation זה הוא בעל חשיבות קריטית כפי שהקב"ה unchelated 3+ הוא רעיל; זה כבר לידי ביטוי בהתפתחות של סיסטיק מערכתית nephrogenic בחלק מהחולים עם מחלת כליות או אי ספיקת 2. כתוצאה מכך, הקולט את היון חינם המימי הוא סייע להבטיח את שלומם של GBCAs. הנוכחות של 3+ unchelated הקב"ה בפתרונות GBCA לעתים קרובות היא תוצאה של תגובה מלאה בין ליגנד ואת יון, דיסוציאציה של המתחם, או displacement ידי קטיונים מתכת ביולוגיים אחרים 3.

    בין מספר טכניקות המשמשות כיום לקביעת הנוכחות של קב"ה 3+, שמסתמך על כרומטוגרפיה ו / או דרגת ספקטרומטריית הגבוהה ביותר מבחינת צדדיות ותחולה 4. בין שאר מעלותיו שלהם גבוהה רגישות ודיוק, היכולת לנתח מטריצות מדגם שונות (כולל בסרום אדם 5, שתן ושיער 6, שפכים 7, ועל ניסוחים חומר ניגוד 8), ואת כימות סימולטני של מתחמי ה 3+ מרובים (הרישום של מחקרים קודמים עד 2013 מתוארת סקירה מקיפה על ידי Telgmann et al.) 4. החסרון היחיד הוא כי כמה שיטות אלה דורשים instrumentations (כגון מצמידי אינדוקטיבי ספקטרומטריית פלזמה המונית) 4 כי מעבדות מסוימות עשויות לא תהיינה גישה. במסגרת גילוי GBCA רומן על מחקר הוכחה של קונספט רמות, arelatively יותר נוחה, מהירה, וחסכוני שיטה מבוססת ספקטרוסקופיות (כגון ספיג או קרינת UV-Vis) עשויה לשמש אלטרנטיבה יקרה. בעזרת יישומים אלה בחשבון, חיישן פלורסנט מבוסס aptamer עבור מימיית אלוקים 3+ פותח 9.

    Aptamer (חס-aptamer) הוא מולקולת DNA חד-גדילי ארוך 44-בסיס עם רצף של בסיסים כי היה מבודד בתהליך האבולוציה שיטתית של ligands על ידי העשרה מעריכי (Selex) 9. כדי להתאים את aptamer לתוך חיישן ניאון, fluorophore מחוברת התחנה הסופית '5 של גדיל, אשר הוא הכלאה ואז עם גדיל מרווה (QS) באמצעות 13 בסיסים משלימים (איור 1). QS מתויג עם מולקולת מרווה בחושך ב 3 התחנה הסופית '. בהיעדר ה 3+, החיישן (חס-חיישן), מורכב ביחס של 1: 2 חפרפרת של הקב"ה-aptamer ו QS בהתאמה, יהיה t בשל פליטת קרינה מינימאליתo העברת אנרגיה מן fluorophore אל מרווה. התוספת של מימית אלוקים 3+ יהיה לעקור את QS מן הקב"ה-aptamer, וכתוצאה מכך גידול פליטת הקרינה.

    איור 1
    איור 1. החיישן (חס-חיישן) שמורכב של aptamer הארוך 44-הבסיס (-aptamer ה ') מתויג עם והעמסה (א fluorophore) ואת גדיל המרווה ארוך 13-בסיס (QS) מתויג עם dabcyl (א מרווה כהה) . בהעדר unchelated אלוקים 3+, הקרינה של החיישן היא מינימלית. עם תוספת של הקב"ה 3+, עקירה של QS מתרחשת וגידול פליטת הקרינה הוא ציין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    יש כרגע, אחד נפוצה מבוסס ספקטרוסקופיות שיטה לזהותing 3+ אלוקים מימי. Assay זו משתמשת תפוז xylenol מולקולה, אשר עוברת שינוי אורך הגל קליטה מקסימלית מפני 433 עד 573 ננומטר על קלאציה אל יון 10. יחס מקסימום ספיגת שני אלה יכולים לשמש כדי לכמת את כמות unchelated אלוקים 3+. חיישן aptamer מהווה חלופה (יכול להיות גם משלים) אל assay הכתום xylenol, כמו שתי השיטות יש תנאי תגובה שונים (כגון pH ורכב של תמיסות בופר בשימוש), selectivities היעד, טווח ליניארי של כימות, ואופני זיהוי 9.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    הערה: מי כיתה וביולוגיה מולקולריים משמשים בכל הכנות חיץ פתרון. כל הצינורות הפנויים (microcentrifuge ו- PCR) וטיפי pipet הם DNase- ו RNase חינם. יש להתייעץ עם גיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל הכימיקלים לפני השימוש. שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) מומלץ בחום.

    1. הכנת פתרונות מניות Aptamer

    1. לרכוש 2 קווצות polydeoxynucleotide מסחרית. להזמין שני גדילים עם טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC).
      גדיל 1 (-aptamer ה '):
      5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3 "
      סטרנד 2 (QS):
      5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
    2. ממיסים כל קווצה מים לעשות 100 פתרונות מניות בודדות מיקרומטר של aptamer-ה 'ואת QS.
    3. אחסן פתרונות אלה ב -20 ° C. הפתרונות הם יציבים עד כה, במשך 3 שנים.
    4. כדי למזער FreeZדואר ההפשרה מחזורים, לאחסן את פתרונות המניות ב 10 aliquots μL.

    2. הכנת הפתרון-חיישן ה 2x

    1. הכן את החיץ assay (20 HEPES מ"מ, 2 מ"מ MgCl 2, 150 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ). התאם את ה- pH ל ~ 7.4 עם NaOH ו HCl, ולסנן דרך מסננים העליון בקבוק חד פעמי סטרילי עם קרום 0.2 מיקרומטר PES. אחסן בבקבוקים סטריליים. אם מסונן מאוחסן כראוי (בטמפרטורת החדר), למאגר יציב עד כה, עבור 2 שנים.
    2. לדלל 1 μL של פתרון ה-aptamer המניות (משלב 1.2) ו -2 μL של פתרון המניות QS (משלב 1.2) ב 497 μL של חיץ assay. מערבבים היטב בעזרת מערבולת. הריכוזים שלהם בפתרון ה-חיישן 2x הם 200 ננומטר ו 400 ננומטר, בהתאמה.
      הערה: היקף הפתרון ה-חיישן 2x מוכן בשלב זה הוא 500 μL, וזה מספיק כדי לבדוק 6 - 7 ריכוזים שונים של אלוקים 3+ עבור עקומת הכיול ואת הפתרונות חומר ניגוד(שלב 3). כל דגימה תיתן בארות כפולות צלחת 384 גם.
      1. כוון את עוצמת הקול של פתרון 2x אלוקים-החיישן פי מספר פתרונות 3+ האלוקים שצריך להיבדק.
    3. מעבירים את הפתרון-חיישן ה 2x ל -9 צינורות PCR, עם 50 μL לתוך צינור אחד. מניחים את צינורות Cycler תרמית.
    4. הגדר את תוכנית Cycler התרמית כדי לחמם את הפתרון המוצע עבור צינורות עד 95 מעלות צלזיוס, להחזיק למשך 5 דקות, ואז לאט לאט לקרר את פתרונות ל -25 מעלות צלזיוס מעל ~ 15 דקות (בשיעור של ~ 0.05 - 0.1 ° C / ים). מחזור החימום וקירור הוא להבטיח הכלאה אופטימלית בין aptamer-ה 'ואת QS. תוצאות הכלאה חלקית מרווה שלמה קרינת רקע גבוהה של החיישן. אם Cycler תרמית אינו זמין, לבצע את התהליך הזה באמצעות אמבט מים חמים במקום.
    5. לאחר מצונן עד 25 מעלות צלזיוס, מיד להשתמש הפתרון, או לשמור Cycler התרמית (עד כ 2 שעות) עד מוכן להיותמְשׁוּמָשׁ. כאשר באמבט מים משמש למערכות החימום, לעזוב את הצינורות באמבטיה כמו המים מתקררים לאט לטמפרטורת חדר.

    3. בניית עקומת כיול הקרינה לאיתור נוכחות של הקב"ה Unchelated 3+ בתמיסה של חומר ניגוד אלוקים

    1. ממיסים GdCl 3 מוצק למאגר assay (אותו למאגר כמו בשלב 2.1).
    2. באמצעות דילול סדרתי, להכין 100 μL כל אחד 6 פתרונות 3+ שוני אלוקים צינורות microcentrifuge ב כפול הריכוזים הרצויים הסופיים עבור עקומת הכיול (2x פתרונות).
      1. לדוגמה, כדי לבנות כיול עבור 0 (מאגר בלבד ללא GdCl 3), 50, 100, 200, 400, ו -800 ננומטר של הקב"ה 3+, להכין תמיסות המכילות 0, 100, 200, 400, 800, ו -1,600 ננומטר של היון. הקפד תמיד לכלול את "אטומים" עם 0 ננומטר אלוקים 3+ כמו שליטה שלילית.
    3. ממיסים את חומר ניגוד להיות מבחןאד למאגר assay. כן 2 או 3 ריכוזים שונים של פתרונות חומר ניגוד דרך דילול סדרתי.
      הערה: בדיקת 3 ריכוזים שונים של פתרון חומר ניגוד מומלצת. זו היא להבטיח כי ריכוזים אלה נמצאים בטווח ליניארי. אם בדגימות שנבדקו אינו מציג קשר לינארי, הקטינו את הריכוזים של חומר הניגוד בשימוש.
    4. קח את צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן משלב 2.5 מתוך Cycler התרמית.
    5. הוסף 50 μL של כל פתרון ה 3+ משלב 3.2 לתוך 6 מתוך 9 צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. כל צינור PCR מכיל כעת את הריכוז הרצוי של הקב"ה 3+ להיבדק, 100 ננומטר אלוקים-aptamer, ו -200 ננומטר QS.
    6. אל צינורות הנותרים PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן, להוסיף 50 μL של פתרונות חומר ניגוד משלב 3.3. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.
    7. דגירה שלolutions בתוך צינורות PCR במשך כ 5 דקות בטמפרטורת החדר. הם עשויים להיות שנותרו לעמוד עד 30 דקות.
    8. העבר 45 μL של כל צינור לתוך צלחת 384 גם. כל צינור PCR ייתן בארות כפולות.
    9. רשום את הקרינה של כל אחד גם על קורא צלחת. Fluorophore (FAM) המשמש לעיצוב חיישן-ה 'יש מקסימום עירור ופליטה של ​​ננומטר 495 ו -520 בהתאמה, כמפורט באתר האינטרנט של הספק. בחר אורכי גל עירור ופליטה מתאימים או מסנן תלויים אם הצליח-הקורא monochromator- או מסנן מבוסס.
    10. שרטט את הגרף של קרינה ביחידות קרינה שרירותיות (עפו) נגד ריכוז של קב"ה 3+.
    11. שרטט את הגרף כמו שינוי לקפל הקרינה נגד ריכוז של הקב"ה 3+. חשב את השינוי לקפל הקרינה על ידי חלוקת עפו של כל ריכוז ידי עפו של הפתרון "אטומים" (עם 0 ננומטר של הקב"ה 3+). השינוי לקפל קרינה יאפשר עבור normalization של התוצאות, צריך התצוגה עפה עת מסוימת (בימים שונים, וכו ') וריאציות.
    12. השווה את פליטת הקרינה של תמיסה המכילה חומר הניגוד ו 'ריק', המהווה את התמיסה המכילה 0 ננומטר GdCl 3 (מאגר בלבד).
      הערה: קרינה גבוהה יותר של פתרון GBCA מרמזת על הנוכחות של unchelated אלוקים 3+, אשר עשוי להצריך טיהור נוספת של חומר הניגוד. הכמות הנוכחית 3+ unchelated האלוקים ניתן להעריך באמצעות עקומת הכיול נבנתה בשלב 3.10 או 3.11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    שינוי קרינה אופייני הפתרון ה-החיישן בנוכחות unchelated אלוקים 3+ מוצג באיור 2. הפליטה ניתן להתוות כשינוי לקפל פלואורסצנטי (איור 2 א) או את קרינת הגלם לקרוא (תרשים 2B) ביחידות כלשהן (עף). מגרשי שני להניב עקומות כיול דומות מאוד עם מגוון ליניארי לריכוזי ה 3+ מתחת ל -1 מיקרומטר ו רוויה של האות ב> 3 מיקרומטר. המגבלה של זיהוי היא ~ 100 ננומטר עם יחס אות לרעש של 3.

    בשנת פתרונות המכילים את GBCA עניין, בנוכחות 3+ אלוקים unchelated תתורגם לעליית קרינה של החיישן בהשוואת הפתרון "אטומים". שינויי הקרינה בפתרונות של 2 קבוצות שונות של מורכבות ה-DOTA, אחד של טוהר גבוה יותר מהשני, הם מראיםn כדוגמאות תוצאות נציג (איור 3). אלוקים-DOTA (חומצה gadoteric) הינו קומפלקס גדוליניום של הקב"ה 3+ מוקף DOTA ליגנד אורגני שנמצא חומר ניגוד מסחרי. את המנה של טוהר גבוה אינה מציגה עלייה משמעותית עד פליטה עד 20 מ"מ של הקב"ה-DOTA. כאשר unchelated אלוקים 3+ קיים, שינוי זה מורגש גם בריכוזי האלוקים-DOTA מתחת ל -5 מ"מ הוא ציין. בדוגמה זו שבה נקודות הנתונים הם זממו כמו שינוי לקפל הקרינה של החיישן, כימות של סכום של 3+ אלוקים unchelated ניתן להעריך באמצעות עקומת כיול איור 2 א.

    איור 2
    איור 2. מגרשים עקומים כיול נציג ה-חיישן פלואורסצנטי. כל נקודות הנתונים בוצעו לפחות כפילויות לממוצע ערכי עלילהטד עם סטיית תקן כמו סרגל השגיאות. (א) עקומת כיול שהושגו באמצעות 100 ננומטר אלוקים-aptamer ו -200 ננומטר QS. הגרף הוא זמם עם שינוי לקפל הקרינה כציר y. אותו (ב) עקומת הכיול כמו ב (א) עם קרינת גלם ביחידות כלשהן (עפו) כציר y. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    נציג איור 3. שינוי ה-חיישן קרינה כאשר בודקים את הנוכחות של 3+ אלוקים unchelated בדגימות של מולקולת ה-DOTA. שתי קבוצות שונות של פתרונות מורכבים האלוקים-DOTA מוצגות העלילה הזה, אחד של טוהר גבוה (סמן בעיגול) והשני המכיל אלוקים unchelated 3+ (triangl הכחולסמן ה). כל נקודת נתונים היא ממוצעת של שתי קריאות עם סטיית תקן כמו סרגל השגיאות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    שימוש בחיישן ה-מבוסס aptamer, גידול פליטת קרינה כי היא יחסית ריכוז unchelated אלוקים 3+ הוא ציין. כדי למזער את כמות מדגם, assay ניתן לרוץ microplate 384 גם עם נפח דגימה כולל של 45 μL לכל טוב. בתכנון זה, הבחירה של והעמסה (FAM) ו dabcyl (DAB) התבססה בעיקר על העלות של החומרים הכימיים; כדי לשנות את אורך גל הפליטה, זיווג של fluorophore שונה מרווה ניתן להשתמש 11.

    חשוב לציין כי על מנת להשיג את התוצאה הטובה ביותר עם החיישן, אחד השלבים הקריטיים הוא החימום עד 95 מעלות צלזיוס ו קירור איטי (שלב 2.4) למאגר assay להשיג הכלאה אופטימלית בין aptamer-ה 'ואת QS גדילים. כאמור בפרוטוקול, אם Cycler תרמית אינה זמינה, הדגירה על 95 מעלות צלזיוס עלולה להתבצע בתוך אמבט מים. פרמטר נוסף מפתח לשלוט הוא tהוא יצירות של תמיסות בופר; שימוש חיץ assay המפורטים בשלב 2.1 לפזר את חומר הניגוד מומלץ, או מים ללא יונים עשויים לשמש גם. עם זאת, פתרונות המכילים interferents פוטנציאל יש להימנע. דוגמה חיץ כזה הוא אחד המכיל אניונים פוספט, אשר יכולים לתאם לאלוקים unchelated 3+ לגבש פוספט גדוליניום מסיס 12. המשקע לא יגיב עם החיישן, וכתוצאה מכך תוצאה שלילית שגויה.

    כמה צעדים בניסויים ניתן לשנות מבלי להשפיע על התוצאה. ראשית, כדי לפשט את assay וחישוב, להכין הן הפתרון ה-חיישן ואת מימית GdCl 3 עבור עקומת כיול בריכוזים 2x. אם תרצה, גורמים לדילול אחרים עשויים לשמש (למשל עבור, 10x פתרונות), ובלבד ריכוזי assay הסופיים של aptamer-ה 'ואת QS נשמרים ב 100 ננומטר ו -200 ננומטר, בהתאמה. שנית, ד חיץ assayOES לא חייב להיות בדיוק 7.4 pH. כל ערך בין 7 - 7.4 יפיק את גידול הקרינה הרצוי, כל עוד אותו החיץ משמש לאורך כל הניסוי. שלישית, לאחר קריאת פליטת הקרינה מתקבלת, נקודות הנתונים ניתן להתוות כמו גם קרינת גלם יחידות שרירותיות (עף) או כשינוי לקפל קרינה. כדי לחשב את השינוי לקפל קרינה, קריאת קרינת הגלם של כל ריכוז מנורמל (מחולק) קריאת הביקורת השלילית (0 ננומטר אלוקים 3+). כפי שמוצגים איורי 2 א 'וב', מגמות פליטת הקרינה בשתי החלקות כמעט זהות. השינוי לקפל עשוי להיות דרך נוחה יותר כדי לנתח את הנתונים אם קורא הצלחת מציג כמה וריאציות של קריאות הגלם רשמו בזמנים שונים. לבסוף, אם המעבדה מצוידת fluorometer, אבל לא קוראים צלחת, כל נקודת נתונים ניתן למדוד באמצעות קובט, במקום microplate. בהתאם o גודלf את cuvettes זמין, היקפי הפתרונות מוכן ב assay ייתכן שיהיה צורך מותאם.

    השיטה דיווחה בזאת מספקת אלטרנטיבה chromatographic- ו / או טכניקות מבוססות spectrometric לאיתור 3+ אלוקים מימי. בהשוואה לזה אחרון, assay-חיישן הקב"ה מוגבל יותר מבחינת רגישות, דיוק, ויכולת עבור זיהוי סימולטני של מינים רבים. מצד השני, החיישן מבוסס ספקטרוסקופיות דורש מכשור כי עשוי להיות זמין יותר, ניתן לבצע בתוך פרק זמן קצר יותר, ואת הכנת המדגם היא מינימאלית. הסוכן לקונטרסט עשוי להיות פשוט התפרק בפתרון החיץ, מעורבב עם פתרון ה-החיישן, ואת פליטת הקרינה נמדדת ישירות. יתר על כן, החיישן הוא מסוגל לזהות ריכוז נמוך בהרבה של הקב"ה unchelated 3+ מ מחוון כתום xylenol (כ -2 סדרי הבדל גודל בין שתי השיטות) ויש לוסלקטיביות גבוהה לאלוקים 3+ פני כמה יונים של מתכות חשובות מעבר ביולוגיים אחרים 9.

    ישנם שני חסרונות של assay זה שעשוי להגביל את השימוש בו תחת כמה תנאים ניסויים. מגבלה אחת היא כי החיישן אינו ספציפי לאלוקים 3+; הוא מציג מענה יוני lanthanide אחרים (כגון האיחוד האירופי 3+ ו Tb 3+) 9. עם זאת, אלה אינם יונים נפוץ למצוא חומר ניגוד או מערכות ביולוגיות ולכן, הפרעה שלהם הן מינימליות. הנקודה השנייה שיש לציין הוא כי בריכוזים גבוהים (מעל ~ 10 מיקרומטר) של הקב"ה 3+, ירידה הדרגתית של פליטת הקרינה ה-חיישן הוא ציין. השפעת המרווה ידי יוני lanthanide היא תופעה מתועדת היטב 13 כי שמשה גם כטכניקה לגילוי וכימות אותם 14. אמנם זה מגביל את השירות של חיישן למדידת ריכוזים גבוהים של הקב"ה 3+

    בעבודה זו, השימוש בטכניקת קרינה מבוססת נוחה לאיתור 3+ אלוקים unchelated רעיל בתמיסה מימית תואר. Assay זה נועד להערכה בשלב המוקדם של טוהר חומר ניגוד מבוסס גדוליניום, במיוחד במהלך הסינתזה והגיבוש לניסויים במבחנה. עם הגידול הנוכחי של תהודה מגנטית באבחון, מספר גדל והולך של סוכנים בניגוד רומן הרף שתוכנן ונבדק. Aptamer מבוססי ה-חיישן יקל התפתחות זו על ידי מתן אמצעים במהירות לאיתור נוכחות של ריכוזים תת-מיקרו של הקב"ה unreacted או ניתק 3+ בתמיסה מימית ב- pH הסביבה. יתר על כן, מאז החיישן מציג תגובתיות צולבת עם יוני lanthanide trivalent אחרים, היישום שלה עשוי להיותהוארך לאזורים אלה של המחקר.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gd-aptamer IDTDNA Input sequence and fluorophore modification in the order form A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Quenching strand IDTDNA Input sequence and quencher modification in the order form A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Molecular biology grade water No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
    Gadolinium(III) chloride anhydrous Strem 936416 Toxic
    HEPES Fisher Scientific BP310-500
    Magnesium chloride anhydrous MP Biomedicals 0520984480 - 100 g
    Sodium Chloride Acros Organics 327300025
    Potassium chloride Fisher Scientific P333-500
    Sodium hydroxide, pellets Fisher Scientific BP359 Corrosive
    Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Toxic and corrosive
    384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates Corning 3575 Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
    Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter Thermo Scientific 5680020 The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
    Disposable sterile bottles 250 mL Corning 430281 A larger or smaller bottle may be used
    1.5 mL microcentrifuge tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    0.2 mL PCR tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Micropipets No specific manufacturer
    Pipet tips (non filter) of appropriate sizes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Equipment
    Plate reader Biotek Synergy H1 Plate readers from other manufacturers would work equally well

    References

    1. Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, (2), 158-166 (2013).
    2. Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists. Tex. Heart Inst. J. 37, (5), 508-515 (2010).
    3. Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. MRI contrast agents: basic chemistry and safety. J Magn. Reson. Imaging. 36, (5), 1060-1071 (2012).
    4. Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review. Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).
    5. Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C. Invest. Radiol. 43, (12), 817-828 (2008).
    6. Loreti, V., Bettmer, J. Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 1050-1054 (2004).
    7. Telgmann, L., et al. Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater. Environ. Sci. Technol. 46, (21), 11929-11936 (2012).
    8. Cleveland, D., et al. Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations. Anal. Bioanal. Chem. 398, (7), 2987-2995 (2010).
    9. Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution. Anal. Bioanal. Chem. 408, (15), 4121-4131 (2016).
    10. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, (5), 184-188 (2006).
    11. Johansson, M. K. Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).
    12. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. A primer on gadolinium chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30, (6), 1240-1248 (2009).
    13. Shakhverdov, T. A. A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands. Opt. Spectrosc. 95, (4), 571-580 (2003).
    14. Brittain, H. G. Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence. Anal. Chem. 59, (8), 1122-1125 (1987).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter